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문제 정의
- 본 연구에서는 소수성 모델약물인 피오글리타존의 가용화를 위한 생분해성 고분자 미셀의 제조를 위해 생분해성 고분자 원료인 락타이드(LA), 글리콜라이드(GA)와 생체적합성 고분자인 폴리에틸렌글라이콜(PEG)을 이용하여 양친성 이중블록공중합체를 합성하였다. PEG를 거대개시제로 하여 LA (또는 GA) 를 개환중합하였고 합성된 고분자들을 nuclear magnetic resonance spectroscopy (’H-NMR), fourier transform infrared spectrometer (FT-IR), gel permeation chromatography (GPC), differential scanning calorimeter (DSC) 측정을 통하여 그 특성을 확인하였다.
제안 방법
- 1 을 이용하여 모폴로지를 관찰하였다 또한, DLSCzeta sizer 3000, Mal.,ern Instruments, Worcestershire, UK) 를 이용하여 수용 액상에서 고분자 미셀과 약물이 봉입된 미셀의 평균 크기 및 크기 분포를 측정하였다.
- 형태 및 크기. PEG-PLA(또는 PLGA) 미셀의 구조적인 특성을 AFMCXE-100, PSIA Inc, Santa Clara, CA)측정을 통하여 알아보았다. Ultralever non-contact mode tip (PSIA Inc.
- 임계미셀 농도(CMC). PEG-PLA(또는 PLGA) 양친성 블록 공중합체는 pyrene을 이용한 형광분석을 통하여 임계미셀 농도를 즉정하였다. Pyrene의 흡수파장의 첫번째와 세번째 형광 강도값인 1370 과 #의 비 (#)가 급격히 변화하는 구간에서 직선을 그어 그 교차점을 임계미셀 농도로 결정하였다.
- PEG를 거대개시제로 하여 LA (또는 GA) 를 개환중합하였고 합성된 고분자들을 nuclear magnetic resonance spectroscopy (’H-NMR), fourier transform infrared spectrometer (FT-IR), gel permeation chromatography (GPC), differential scanning calorimeter (DSC) 측정을 통하여 그 특성을 확인하였다. 또한, 합성된 고분자들이 수용액 상에서 자기조립을 통하여 미셀구조를 형성함을 확인하였고 투석법과 고체분산법을 이용하여 소수성 약물인 피오글리타존을 미셀 내부에 봉입시킨 후 atomic force microscope (AFM), dynamic light scattering (DLS), high performance liquid chromatography (HPLC) 분석을 통하여 물리화학적 특서 가용화능, 및 생체 외 방출거동을 평가하였다.
- 생체 외 약물 방출. Pioitazone이 함유된 고분자 미셀의 생체 외 방출 거동을 알아보기 위하여 pH 7.4인 인산완충용액 (PBS) 에 넣은 후 37 ℃의 항온수조 안에서 시간에 따른 방출량을 HLC 분석을 통하여 측정하였다. 0.
- PEG-PLA(또는 PLGA) 양친성 블록 공중합체는 pyrene을 이용한 형광분석을 통하여 임계미셀 농도를 즉정하였다. Pyrene의 흡수파장의 첫번째와 세번째 형광 강도값인 1370 과 #의 비 (#)가 급격히 변화하는 구간에서 직선을 그어 그 교차점을 임계미셀 농도로 결정하였다. Table 1과 Figure 4에서 볼 수 있듯이 PEG2K-PLA1K의 경우 1.
- PEG-PLA(또는 PLGA) 미셀의 구조적인 특성을 AFMCXE-100, PSIA Inc, Santa Clara, CA)측정을 통하여 알아보았다. Ultralever non-contact mode tip (PSIA Inc.) 과 티타늄 cantilever가 장착되어 있으며 proscan 1.9와 image analysis 2.1 을 이용하여 모폴로지를 관찰하였다 또한, DLSCzeta sizer 3000, Mal.,ern Instruments, Worcestershire, UK) 를 이용하여 수용 액상에서 고분자 미셀과 약물이 봉입된 미셀의 평균 크기 및 크기 분포를 측정하였다.
- 본 연구에서는 친수성 PEG(M= 2000) 와 소수성 PLA(또는 PLGA) 그룹의 반응액내 당량비를 조절하여 다양한 조성의 블록 공중합체를 합성하였다. 거대개시제인 PEG 에 의해 LA(또는 GA) 의 개환중합으로 합성된 PEG-PLA(또는 PLGA) 양친성 고분자는 1H-NMR 분석을 통하여 중합된 블록 공중합체의 특정 관능기에 해당하는 분자 구조를 분석하였다(Figure 2). PEG의 에틸렌(-CH2-CH2-, a) 피크는 5=3.
- 또한, pyrene의 안정화를 위하여 측정전 samplee 상온에서 24시간 유지하였다. 고분자의 농도는 5.0-5 X 10~5 mg/mL의 범위로 하였고 pyrene의 방출 파장은 350-500 nm 범위에서 측정하였다.
- KBr pellet법으로 시편을 만들었으며 400-4000 cm-1 범위에서 측정하였다. 고분자의 분자량 및 분자량 분포는 GPC (Agilent 1100 series, USA)를 통하여 분석하였다. 두 개의 컬럼(pLgel 5 pm MIXED-D & E columns), RI 탐지기, quaternary 펌프를 장착했으며, PEG를 기준 시료로 하여 1 mL/min의 유속으로 측정하였다.
- 이동상 용매는 THF를 이용하였으며 컬럼과 탐지기의 온도는 모두 40 ℃를 유지하였다. 그리고 합성된 고분자와 약물 봉입 미셀의 열적 특성을 알아보기 위하여 DSC (Pyris 6, PerkinElmer, USA)를 측정하였다. Aluminum pan에 약물 봉입 미셀의 pioglitazone의 함량은 1 mg으로 하였고 마찬가지로 건조된 고분자와 pioglitazone 함량은 동일한 조건으로 준비하였다.
- 걸러진 용액은 곧바로 냉각시켜 3일 이상 동결건조하여 약물이 함유된 분말상 미셀 입자를 얻었다. 다음으로 투석법에 의한 방법은 5, 10%(w/w) 의 pioglitazone과 고분자를 L0 wt%의 농도로 같은 혼합용매에 녹인 뒤 투석막 (Spectra/Por Biotech, Cellulose Ester Type, MWCO : 1000)을 이용하여 다량의 증류수에 24시간 동안 온화하게 저어주었고 증류수를 8시간마다 교체하였으며, 봉입되지 않은 약물은 위의 방법으로 걸러주었고 동결건조 후 분말 상의 입자를 얻었다.25
- 당뇨병 치료제인 pioitazone을 가용화하기 위하여 생체적합성, 생분해성 특징을 지닌 PEG-PLA(또는 PLGA) 양친성 이 중 블록 공중합체를 합성하였다. 합성된 고분자는 소수성 블록과 친수성 블록을 모두 함유하고 있어 수용액 상어)서 수십 나노 크기의 자기조립 미셀 구조를 형성할 수 있었다 PLGA로 이루어진 소수성 core를 갖는 미셀의 봉입률이 PLA core보다 높았으며, 투석법보다는 고체 분산법이 보다 효과적으로 약물을 가용화시킬 수 있었다 결과적으로 고분자의 화학적 조성 변화를 통해 약물 봉입률을 극대화할 수 있고, 방출속도 또한 제어가 가능할 수 있음을 보여주었다.
- 고분자의 분자량 및 분자량 분포는 GPC (Agilent 1100 series, USA)를 통하여 분석하였다. 두 개의 컬럼(pLgel 5 pm MIXED-D & E columns), RI 탐지기, quaternary 펌프를 장착했으며, PEG를 기준 시료로 하여 1 mL/min의 유속으로 측정하였다. 이동상 용매는 THF를 이용하였으며 컬럼과 탐지기의 온도는 모두 40 ℃를 유지하였다.
- PEG를 거대개시제로 하여 LA (또는 GA) 를 개환중합하였고 합성된 고분자들을 nuclear magnetic resonance spectroscopy (’H-NMR), fourier transform infrared spectrometer (FT-IR), gel permeation chromatography (GPC), differential scanning calorimeter (DSC) 측정을 통하여 그 특성을 확인하였다. 또한, 합성된 고분자들이 수용액 상에서 자기조립을 통하여 미셀구조를 형성함을 확인하였고 투석법과 고체분산법을 이용하여 소수성 약물인 피오글리타존을 미셀 내부에 봉입시킨 후 atomic force microscope (AFM), dynamic light scattering (DLS), high performance liquid chromatography (HPLC) 분석을 통하여 물리화학적 특서 가용화능, 및 생체 외 방출거동을 평가하였다.
- PEG-PLA(또는 PLGA)의 특성. 본 연구에서는 친수성 PEG(M= 2000) 와 소수성 PLA(또는 PLGA) 그룹의 반응액내 당량비를 조절하여 다양한 조성의 블록 공중합체를 합성하였다. 거대개시제인 PEG 에 의해 LA(또는 GA) 의 개환중합으로 합성된 PEG-PLA(또는 PLGA) 양친성 고분자는 1H-NMR 분석을 통하여 중합된 블록 공중합체의 특정 관능기에 해당하는 분자 구조를 분석하였다(Figure 2).
- 생체외 약물방출. 약물이 봉입된 PEG-PLA (또는 PLGA) 고분자 중에서 약물함량이 다소 비슷한 샘플들을 선택하여 pH 7.4인 PBS 용액에서 생체 외 방출거동을 관찰하였다. 방출된 약물의 농도를 확인하기 위하여 HPLC측정을 하였으며 그 결과는 Figure 8에 나타내었다 일반적으로 미셀을 이루는 고분자의 소수성 블록 길이가 증가 할수록 약물 방출거동이 느려지는 것을 확인할 수 있었다.
- Pioglitazono을 봉입하기 위한 방법으로 고채분산법과 투석법이 사용되었으며 약물과 고분자의 무게비를 1 : 9, 1 : 19 로 하여 실험하였다. 약물이 봉입된 고분자 미셀은 동결건조 처리된 고체상 입자형태로 일정량을 고정상 용매에 녹인 뒤 HPLC 분석을 통하여 함유된 pioglitazone의 농도를 측정하였고 봉입률과 약물함량은 다음 식을 이용하여 결정하였다(식 (1), (2)).
- Pioglitazone의 봉입률 및 방출률 측정. 약물이 봉입된 고분자 미셀의 약물 봉입능과 방출능을 알아보기 위하여 HPLC(NS-3000i, Futecs)측정을 통하여 분석하였다. 자동 샘플주입기 (NS-6000A, Futecs) 와 Prontosil C18-ace-EPS 컬럼 (250x4.
- 5 mg의 약물이 함유된 고분자 미셀을 PBS 용액에 녹인 뒤 투석막(MWC0 : 1000)을 이용하여 40 mL의 PBS 용액이 담긴 conical 튜브에 넣었다. 정해진 시간마다 새로운 PBS 용액으로 교체해 주면서 얻은 샘플들로부터 방출된 약물의 농도를 분석하였다.
- 중합된 혼합물은 적당량의 dichloromethane에 녹인 뒤 과량의 차가운 에테르에 침전시켰다. 침전물은 여과 및 분리하였고 24시간 이상 진공건조하여 최종 생성물인 PEG-PLA (또는 PLGA) 이중 블록 공중합체를 합성하였다
- 고분자 및 미셀의 특성분석. 합성된 PEG-PLA(또는 PLGA) 의화학적 조성은 iH-NMR(JNM-AL400, Jeol Ltd, Akishima, Japan) 을 통하여 분석하였다 또한 합성 전과 후의 분자결합의 구조적인 변화를 살펴보기 위하여 FT-IR(MAGNA 560 spectrometer, USA) 을 이용하여 분석하였다. KBr pellet법으로 시편을 만들었으며 400-4000 cm-1 범위에서 측정하였다.
- 고분자 미셀의 열적 특성. 합성된 고분자와 약물함유된 미셀의 열적 거동을 알아보기 위하여 시차주사 열량계 (DSC) 를 통하여 분석하였다(Figure 5). PEG2K의 경우 #은 58 ℃, PEG2K-PLA1K는 53 ℃, PEG2K-PLA2K는 47 ℃, PEG2K-PLGA0.
- 임계 미셀 농도 측정. 합성된 양친성 공중합체의 수용 액상에서 의미 셀이 형성되는 농도를 확인하기 위하여 형광측정기 (JASCO FP- 6500) 를 이용하여 분석하였다. Pyrene (Sigma- Aldrich) < 형광물질로 사용했으며 6.
대상 데이터
- 합성된 양친성 공중합체의 수용 액상에서 의미 셀이 형성되는 농도를 확인하기 위하여 형광측정기 (JASCO FP- 6500) 를 이용하여 분석하였다. Pyrene (Sigma- Aldrich) < 형광물질로 사용했으며 6.0X 10 M의 농도로 소량의 THF에 녹인 pyrene 용액을 2차 증류수에 희석하여 사용하였다 Pyrene용액 안의 THF의 제거를 위하여 65 ℃에서 3시간 열을 가해 주었으며 2차 증류수에 희석된 고분자용액에 pyrene 용액을 1 : l(v/v)로 넣어주었다. 또한, pyrene의 안정화를 위하여 측정전 samplee 상온에서 24시간 유지하였다.
- 후 시용하였다. 모델약물인 피오글리타존(Pioglitazone . HC1) 은 (주) 동우신테크에서 제공받아 사용하였다. 기타 사용된 모든 용매는 HPLC 등급을 사용하였으며, 그 외 시약들은 정제하지 않고 그대로 사용하였다
- 시약 및 재료 본 실험의 거대 개시제로서 methoxy poly (ethylene 이ycol) (PEG, =2000) 과 반응 촉매로서 stannous octoate (Sn (Oct) 2)는 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다 공중합 단량체로서 D, LTactide (LA) 와 읺ycolide(GA)는 Polyscience 에서 구입하였고 ethyl acetate (Samchun, HPLC 등급) 에 ] 회 재결정한 후 시용하였다. 모델약물인 피오글리타존(Pioglitazone .
- 약물이 봉입된 고분자 미셀의 약물 봉입능과 방출능을 알아보기 위하여 HPLC(NS-3000i, Futecs)측정을 통하여 분석하였다. 자동 샘플주입기 (NS-6000A, Futecs) 와 Prontosil C18-ace-EPS 컬럼 (250x4.6 mm, 5.0 Bischoff) 이 장착되어 있으며 이동상과 고정상 용매로 acetonitrile : 0.1 mol/L ammonium acetate : acetic acid (25 : 25 : 1) 를 사용하였다. Pioglitazone의 UV-흡수파장 269 nm에서 1 mL/min의 유속으로 상온에서 측정하였다.
이론/모형
- 합성된 PEG-PLA(또는 PLGA) 의화학적 조성은 iH-NMR(JNM-AL400, Jeol Ltd, Akishima, Japan) 을 통하여 분석하였다 또한 합성 전과 후의 분자결합의 구조적인 변화를 살펴보기 위하여 FT-IR(MAGNA 560 spectrometer, USA) 을 이용하여 분석하였다. KBr pellet법으로 시편을 만들었으며 400-4000 cm-1 범위에서 측정하였다. 고분자의 분자량 및 분자량 분포는 GPC (Agilent 1100 series, USA)를 통하여 분석하였다.
- 약물 봉입률. Pioglitazono을 봉입하기 위한 방법으로 고채분산법과 투석법이 사용되었으며 약물과 고분자의 무게비를 1 : 9, 1 : 19 로 하여 실험하였다. 약물이 봉입된 고분자 미셀은 동결건조 처리된 고체상 입자형태로 일정량을 고정상 용매에 녹인 뒤 HPLC 분석을 통하여 함유된 pioglitazone의 농도를 측정하였고 봉입률과 약물함량은 다음 식을 이용하여 결정하였다(식 (1), (2)).
성능/효과
- 83 ppm에서 확인되었다. ’H-NMR 분석을 통한 PLA 의 분자량 계산은 PEG의 에틸렌에 대한 PLA의 메틸 피크의 proton 면적비를 비교하여 계산하였고, PLGA의 분자량 계산은 PEG의 에틸렌에 대한 PLA의 메틸 피크와 PGA의 메틸렌 피크의 proton 면적 비를 비교하여 계산하였다 합성된 고분자의 분자량 분포(#/M) 는 GPC 분석을 통하여 1.07~1.29의 좁은 분산도를 가짐을 확인하였으며 1H-NMR 계산 값과 거의 유사한 GPC 분자량 값을 가짐을 확인할 수 있었다 합성된 고분자의 화학적 조성을 Table 1에 요약하였다 또한 Figure 3의 FT-[R분석을 통하여 합성된 고분자는 PEG에서는 볼 수 없었던 카보닐 그룹(C=o) 의 파장을 PLA는 1756 cm"1, PLGA는 1762 cm"1에서 각각 확인할 수 있었으며 2750-3029 cm-1(—OH), 2850—2990 cm 1 (―CH3, —CH2—), 1456 cm 1 (-CH3), 1070-1280 cmfC-O-C) 의 각각의 파장영역에 해당되는 고분자의 특정사슬결합이 존재함을 확인하였다.
- 이는 순수한 PEG 그룹에 PLA (또는 PLGA) 블록이 결합하면서 결정성을 다소 감소시키는 원인이 되었고 또한 분자량이 증가함에 따라 더욱 , 이 감소함을 알 수 있었다 그리고 약물이 공중합체 내부에 봉입된 미셀과 봉입하지 않고 임의적으로 혼합된 시료의 DSC 결과를 Figure 5(c), (d)에 나타내었다. Pioglitazone의 # 201 ℃에서 관찰되었고 PEG-PLA(또는 PLGA)와 약물을 임의적으로 혼합된 시료에서는 PEG와 pioglitazone의 # 피크가 모두 관찰되는 반면에 동일한 양의 약물이 봉입된 미셀을 측정한 시료에서는 미셀 표면을 둘러싸고 있는 PEG의 7^ 피크만 관찰될 뿐 pioglitazone의 특성 용융피크는 관찰되지 않았다 그 이유는 약물이 미셀 내부에 봉입되어 소수성 PLA(또는 PLGA)와 힘께 무정형상태를 이루어 혼합되어 있음을 확인할 수 있었다.
- Table 2 에서 볼 수 있듯이 PEG2K-PLA1K, PEG2K-PLA2K 의 봉입 미셀인 경우에 투석법은 0.07±0.05%의 약물이 함유된 반면에 고체분산법에서는 2.93±0.76%로 약물 함량이 보다 우수함을 알 수 있었다. 봉입 효율 역시 1.
- 5 土 16%로 투석법보다는 고체분산법에서 약물 봉입률이 더욱 향상됨을 확인하였다. 또한, PEG2K-PLGA0.8K, PEG 2K-PLGA1.4K에서는 약물 함량이 PEG-PLA에서 보다 증가된 5.67±1.0%이었고 봉입률도 80.86 ±22.0%의 높은 값을 가짐을 확인할 수 있었다. 이는 LA 와 GA 의 공중합체인 PLGA가 PLA 보다 약물과의 분자간 상호작용이 보다 좋아 같은 조건에서 약물 봉입효율이 더 높은 것으로 사료된다.
- 4인 PBS 용액에서 생체 외 방출거동을 관찰하였다. 방출된 약물의 농도를 확인하기 위하여 HPLC측정을 하였으며 그 결과는 Figure 8에 나타내었다 일반적으로 미셀을 이루는 고분자의 소수성 블록 길이가 증가 할수록 약물 방출거동이 느려지는 것을 확인할 수 있었다. 이는 소수성 블록길이가 증가하면서 미셀 코어의 소수성 또한 증가하여 확산에 의한 약물의 방출속도가 느려진 것으로 사료된다.
- 76%로 약물 함량이 보다 우수함을 알 수 있었다. 봉입 효율 역시 1.06±0.6%에서 42.5 土 16%로 투석법보다는 고체분산법에서 약물 봉입률이 더욱 향상됨을 확인하였다. 또한, PEG2K-PLGA0.
- 0x10-3 mg/mL로 측정되었다. 이러한 결과들로부터 소수성이 보다 큰 PLA블록의 경우 PLGA블록보다 임계미셀 농도가 상대적으로 작은 값을 갖음을 알 수 있고 같은 고분자블록인 경우 소수성 블록고분자의 분자량 크기에 반비례하여 임계미셀 농도는 작아지는 경향을 볼 수 있었다. 이는 블록의 소수성 그룹이 증가함에 따라 소수성 상호작용 힘에 의해 사슬간 자기집합이 더 낮은 농도에서도 이루어질 수 있으므로 수용액 내 콜로이드 인정성이 보다 높을 것으로 기대된다.
- 합성하였다. 합성된 고분자는 소수성 블록과 친수성 블록을 모두 함유하고 있어 수용액 상어)서 수십 나노 크기의 자기조립 미셀 구조를 형성할 수 있었다 PLGA로 이루어진 소수성 core를 갖는 미셀의 봉입률이 PLA core보다 높았으며, 투석법보다는 고체 분산법이 보다 효과적으로 약물을 가용화시킬 수 있었다 결과적으로 고분자의 화학적 조성 변화를 통해 약물 봉입률을 극대화할 수 있고, 방출속도 또한 제어가 가능할 수 있음을 보여주었다. 효과적인 가용화 방법과 함께 약물 함유 미셀의 안정성이 보다 오래 지속될 수 있도록 하는 제형 화 또한 중요하므로 관련 연구가 진행 중에 있다.
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