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문제 정의
- 4 뼈 세포의 경우 지지체가 100~350 pirn 크기의 공극을 가질 때 재생이 잘 되었다.5 따라서 본 연구에서는 공극간의 연결성에 제한이 있는 염침출법 (salt-leaching process) 의 한계를 극복하고 기계적 강도가 향상된 세포의 증식에 적합한 다양한 공극의 크기를 가진 interconnected 한 구조의 tailor-made 지지체를 제작하고자 PCL을 원료로 바이오플로팅 방법을 이용하여 3차원 구조의 지지체를 만들었고, 이에 세포를 배양하여 초기 부착 상태를 확인하여 보았다.
가설 설정
- Figure 2는 모든 조건은 동일한 상태에서 PCL의 용융 온도 변화가 3차원 지지체의 제작에 미치는 영향을 비교한 사진이다. (b) 사진은 전체적으로 설계된 형태로 형상이 구현된 모습인 반면, (a) 사진은 layer가 쌓여 가면 서구 조기. 무너진 형태를 나타내고 있다.
제안 방법
- 3D PCL 지지체의 기계적 특성 분석. 10X10X5 mm 크기의 3 차원 구조의 PCL 지지체의 공극률 변화에 따른 기계적 강도를 측정하기 위해 DMA (dynamic mechanical analyzer, TA Instru- ment)를 이용하여 l~10 Hz의 frequency sweep으로 compressive modulus를 즉정하였다. 기존 염침줄법으로 동일한 모양의 3차원 구조의 PCL 지지체를 제작하여 측정한 값과 바이오 플로터를 이용한 3차원 구조의 PCL 지지체의 값도 함께 비교하였다.
- 나타낸 그래프이다. 3가지 종류의 노즐(200, 250, 330 ㎛)로 제작된 다양한 공극 크기의 지지체 샘플들 중에서 가장 대조적인 공극 크기를 갖는 샘플을 3가지 선택하여 테스트를 진행하였다. 각각의 경우 샘플의 공극 크기는 130, 240, 320 ㎛로 공극의 크기가 작을수록 압축강도가 정비례하여 증가하고 있다.
- 3차원 구조의 PCL 지지체 샘플들은 가로, 세로, 높이가 각각 10X10*5 mm의 크기를 가지며 공극의 크기는 150~400 ㎛까지 갖도록 strand간의 간격을 조정하여 제작하였다. 일반적으로 제작시간은 지지체의 크기와 노즐의 이동속도에 따라 다르며 10X10X5 mm의 크기 제작시 약 15~20분 정도가 필요하게 된다.
- 3D PCL 지지체의 제작. 3차원 구조의 지지체는 PCL을 재료로 노즐의 내부 직경에 맞춰 100도~120도로 용융하여 제작된 바이오 플로터를 이용하여 압출하여 만들었다 PCL 용융시 열분해 (degra- dation) 를 고려하여 모든 지지체 제작은 PCL 주입 후 약 30분 후 제작되 었다.
- 10X10X5 mm 크기의 3 차원 구조의 PCL 지지체의 공극률 변화에 따른 기계적 강도를 측정하기 위해 DMA (dynamic mechanical analyzer, TA Instru- ment)를 이용하여 l~10 Hz의 frequency sweep으로 compressive modulus를 즉정하였다. 기존 염침줄법으로 동일한 모양의 3차원 구조의 PCL 지지체를 제작하여 측정한 값과 바이오 플로터를 이용한 3차원 구조의 PCL 지지체의 값도 함께 비교하였다.
- 바이오플로터의 노즐의 크기가 작으면 용융된 재료의 원활한 압출을 위해 온도를 올려주어 viscosity를 낮춰줘야 하나, 온도가 높아질수록 냉각 시간이 길어지면서 형성된 구조물의 형상 변화가 생기게 된다. 또 온도가 변함에 따라 swelling 현상에 의해 strand의 diameter가 변하게 되는데, tailor-made 지지체를 만들기 위해 변형을 줄이도록 이러한 조건들을 조정하며 제작하였다. 여러 diameter의 strand로 주기와 공극의 크기를 변화시켜가며 현미경을 이용하여 공극률, 공극의 크기와 정밀도를 확인하였다.
- 배양 실험. 본 연구에서 제작된 3차원 세포지지체의 내부공극 사이의 세포 성장을 알아보기 위해 세포 배양 실험을 수행하였다. 10X10X5 mm 크기의 지지체를 70% 알코올에 담근 후, 자외선에서 멸균 처리하였다.
- 본 연구에서는 바이오플로팅 방법을 이용하여 생체친화적이면서 생분해성인 고분자 물질인 PCL을 사용하여 화학적 용해과정 없이 고온으로 용융시켜 target plate에 직접 압출시켜 3차원 구조의 세포 재생용 지지체를 제작하였다. 같은 재료가 이용된 기존의 염침출법에 의한 지지체보다 기계적 강도가 월등히 향상되었음을 확인할 수 있었고, 원하는 형상의 외형에 전체적인 내부는 interconnected pore 구조를 갖는 tailor-made 지지체를 제작할 수 있음을 확인하였고 세포배양을 통해 이러한 구조가 세포의 재생에 유용하게 이용되고 있음을 알 수 있었다.
- 또 온도가 변함에 따라 swelling 현상에 의해 strand의 diameter가 변하게 되는데, tailor-made 지지체를 만들기 위해 변형을 줄이도록 이러한 조건들을 조정하며 제작하였다. 여러 diameter의 strand로 주기와 공극의 크기를 변화시켜가며 현미경을 이용하여 공극률, 공극의 크기와 정밀도를 확인하였다.
- 분리된 연골 세포는 충분한 세포 수를 확보하기 위해 3대 계대배양한 세포를 사용하였으며, 시편당 5X105 cells을 접종하였다 배양액은 1% 항생제가 포함된 DMEM-HG를 사용하였으며, 37 ℃ 하에서 5% CO2 인큐베이터에서 일주일간 배양하였다. 연골 세포가 배양된 지지체 샘플은 4% 포름알데히드(formaldehyde)를 이용하여 고정하였고, 탈수과정을 거친 후, 전자주사현미경 (SEM)을 이용하여 관찰하였다.
- 염침출법에 의한 3D PCL 지지체와의 비교. 기존 염침출법에 의한 3D PCL 지지체는 스폰지구조를 가지고 있으며, 이로 인하여 외부응력이 가해졌을 때 응력을 지지해줄 기계적 강도가 약하다는 단점이 있는 반면, 바이오플로팅을 통하여 얻어진 지지체는 외부 응력의 집중화를 분산시킬 수 있는 구조물로 제작될 수 있기 때문에 기계적인 강도를 변화시킬 수 있는 장점을 가지고 있다.
- 다양한 부분의 인체 조직을 대체하려면 그에 대응하는 기계적 강도를 형성할 수 있어야 한다. 이에 따라 3D PCL 지지체의 공극률을 변화시켜 가면서 기계적 강도를 측정하여 보았다.
대상 데이터
- 노즐의 크기는 27G(200 ㎛), 25G(250 pirn), 23G(330 ㎛)을이용하였각각의 노즐로 300-700 ㎛의 주기를 갖는 strand 를 90도 직각으로 교차시키며 층으로 쌓아 전체적으로 연결되는 Figure 4와 같은 모습의 다공성 형태로 샘플들을 제작하였다. 3차원 구조의 PCL 지지체 샘플들은 가로, 세로, 높이가 각각 10X10*5 mm의 크기를 가지며 공극의 크기는 150~400 ㎛까지 갖도록 strand간의 간격을 조정하여 제작하였다.
- 재료. 바이오플로터를 통한 세포 재생용 지지체 제작시 사용된 재료는 PCL(poly-ε-caprolactone, Mn ca. 80000 g - mol-1, mp.= 60 ℃) 로 미국 Aldlich chemical사의 제품이 사용되었다.
- 실험에 사용된 바이오 플로팅 시스템은 Figure 3과 같은 구조의 PED (precision extruding deposition) 방식으로 알갱이 상태의 PCL 을 가열 챔버 안에 넣어 화학적 용해 없이 고온으로 용융시켜 정밀한 나사의 회전에 따른 압력으로 밀어내어 미세한 바늘을 통해 XYZ 스테이지로 이동하며 target plate에 그려낸다.
- 10X10X5 mm 크기의 지지체를 70% 알코올에 담근 후, 자외선에서 멸균 처리하였다. 실험에 사용된 세포는 돼지로부터 콜라게네이즈 효소처리를 하여 분리한 연골 세포를 사용하였다. 분리된 연골 세포는 충분한 세포 수를 확보하기 위해 3대 계대배양한 세포를 사용하였으며, 시편당 5X105 cells을 접종하였다 배양액은 1% 항생제가 포함된 DMEM-HG를 사용하였으며, 37 ℃ 하에서 5% CO2 인큐베이터에서 일주일간 배양하였다.
성능/효과
- 갖도록 interconnected?!: 지지처〕가 제작되었고, 실제 측정된공극률도 3% 이내의 오차를 가지며 그래프의 점선에 잘 따르고 있음을 확인할 수 있다.
- 지지체를 제작하였다. 같은 재료가 이용된 기존의 염침출법에 의한 지지체보다 기계적 강도가 월등히 향상되었음을 확인할 수 있었고, 원하는 형상의 외형에 전체적인 내부는 interconnected pore 구조를 갖는 tailor-made 지지체를 제작할 수 있음을 확인하였고 세포배양을 통해 이러한 구조가 세포의 재생에 유용하게 이용되고 있음을 알 수 있었다.
- 바뀜을 확인할 수 있다. 바이오 플로터를 이용하여 ND = 200 ㎛, SP=300 ㎛를 갖는 샘플과 ND = 250 ㎛, SP=500 ㎛, 그리고 ND=330 ㎛, SP=700 ㎛를 갖는 3D PCL 지지체를 제작하여 compressive modulus# 측정한 값은 각각 11.37, 4.28, 3.43 MPa로 동일한 고분자 재료를 사용하였음에도 염 침출법에 의한 PCL 지지체의 0.18 MPa 보다 월등히 향상되었음을 알 수 있다.
- 확인하였다. 이는 생체 재생 공학에서 다양한 부위의 신체 조직 대체를 가능케 하며, 기존의 동일한 고분자 물질을 가지고도 다양한 기계적 강도와 특성을 갖는 세포 재생용 지지체의 개발이 가능함을 보여주었다.
- 많은 수의 세포가 세포 배양용 지지체의 표면에 부착하는데 성공하면 높은 증식률을 나타내고 지지체의 표면 형상과 공극의 크기는 세포의 초기 부착률에 영향을 미친다. 이러한 이유로 근육 세포의 경우 평평한 바닥에서 보다 마이크로 크기의 고분자 물질이 깔린 바닥에서 잘 증식했고 마이크로 이하 크기의 구조물을 가진 바닥에서는 더 높은 증식률을 나타냈다.4 뼈 세포의 경우 지지체가 100~350 pirn 크기의 공극을 가질 때 재생이 잘 되었다.
- 일반적으로 염침출법으로 제작된 3차원 구조의 지지체는 내부에 세포가 침투해 들어가지 못하는 단점이 있으나, 본 연구에서 제작된 지지체는 균일한 공극을 가지고 있으며, 공극사이에 침투된 세포들이 지지체의 strand들에 부착되어 interconnected한 공극의 연결 구조를 이용하여 이동되면서 증식되고 있음을 확인하였고, 이러한 구조는 균일한 조직 재생을 유도하는데 유리함을 알 수 있다.
- 제작된 지지체의 strand diameter, 주기를 변화시키면서 다양한 세포에 적합하도록 공극의 크기를 조정할 수 있었고 이를 이용하여 porosity의 변화와 넓은 범위의 기계적 강도를 갖도록 조정할 수 있음을 확인하였다. 이는 생체 재생 공학에서 다양한 부위의 신체 조직 대체를 가능케 하며, 기존의 동일한 고분자 물질을 가지고도 다양한 기계적 강도와 특성을 갖는 세포 재생용 지지체의 개발이 가능함을 보여주었다.
후속연구
- 이로써, 지지체의 기계적 압축 강도는 이러한 공극률에 비례하여 변화함을 확인할 수 있었고 이를 이용하여 원하는 기계적 강도를 갖도록 하여 다양한 신체조직을 대체할 수 있는 지지체의 개발도 가능함을 알 수 있다.
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