X선과 같은 고에너지 방사선에 의한 DNA 손상 중 간접적인 손상을 확인하기 위하여 탄탈륨(Ta) 박막위에 동결건조 과정으로 만들어진 pGEM-3Zf(-) plasmid DNA 단일층(monolayer)의 박막을 만든 다음, 에너지가 1.5 keV인 Al $K{\alpha}$ X선을 0분, 3분, 7분, 10분 동안 초고진공 상태에서 이 DNA 단일층에 조사하여 평균 흡수선량(mean absorbed dose)의 변화에 따른 DNA 손상을 관찰하였다. 또한 3 eV의 낮은 에너지 전자선을 조사하여 그 결과를 X선을 조사한 경우와 비교하였다. X선과 낮은 에너지 전자선으로 조사된 plasmid DNA를 전기영동(electrophoresis) 방법을 이용해 supercoiled DNA와 unsupercoiled DNA로 분리한 후 각각을 정량적으로 분석하였다. Supercoiled DNA는 X선과 3 eV 전자선의 조사에 따른 평균흡수선량이 증가함에 따라 선형적으로 감소했다. 그와 반대로 circular DNA와 crosslinked form 1 DNA는 평균흡수선량이 증가함에 따라 선형적으로 증가했다. 이것은 supercoiled DNA가 낮은 에너지 전자와 상호작용하여 외가닥 절단(single strand break)을 일으켰고 그 결과 unsupercoiled DNA로 변화되었음을 보여준다. 본 실험을 통해 X선과 같은 고에너지 방사선에 의한 DNA의 간접적 손상이 일어남을 관찰할 수 있었고, DNA의 이온화 에너지보다 작은 에너지($0{\sim}10\;eV$)를 갖는 전자에 의해서도 DNA 손상이 일어날 수 있음을 확인할 수 있었다.
X선과 같은 고에너지 방사선에 의한 DNA 손상 중 간접적인 손상을 확인하기 위하여 탄탈륨(Ta) 박막위에 동결건조 과정으로 만들어진 pGEM-3Zf(-) plasmid DNA 단일층(monolayer)의 박막을 만든 다음, 에너지가 1.5 keV인 Al $K{\alpha}$ X선을 0분, 3분, 7분, 10분 동안 초고진공 상태에서 이 DNA 단일층에 조사하여 평균 흡수선량(mean absorbed dose)의 변화에 따른 DNA 손상을 관찰하였다. 또한 3 eV의 낮은 에너지 전자선을 조사하여 그 결과를 X선을 조사한 경우와 비교하였다. X선과 낮은 에너지 전자선으로 조사된 plasmid DNA를 전기영동(electrophoresis) 방법을 이용해 supercoiled DNA와 unsupercoiled DNA로 분리한 후 각각을 정량적으로 분석하였다. Supercoiled DNA는 X선과 3 eV 전자선의 조사에 따른 평균흡수선량이 증가함에 따라 선형적으로 감소했다. 그와 반대로 circular DNA와 crosslinked form 1 DNA는 평균흡수선량이 증가함에 따라 선형적으로 증가했다. 이것은 supercoiled DNA가 낮은 에너지 전자와 상호작용하여 외가닥 절단(single strand break)을 일으켰고 그 결과 unsupercoiled DNA로 변화되었음을 보여준다. 본 실험을 통해 X선과 같은 고에너지 방사선에 의한 DNA의 간접적 손상이 일어남을 관찰할 수 있었고, DNA의 이온화 에너지보다 작은 에너지($0{\sim}10\;eV$)를 갖는 전자에 의해서도 DNA 손상이 일어날 수 있음을 확인할 수 있었다.
We observed DNA damages as a function of mean absorbed dose to identify the indirect effect of high-energy radiation such as x-ray. Monolayer films of lyophilized pGEM-3Zf(-) plasmid DNA deposited on tantalum foils were exposed to Al $K{\alpha}$ X-ray (1.5 keV) for 0, 3, 7 and 10 min, res...
We observed DNA damages as a function of mean absorbed dose to identify the indirect effect of high-energy radiation such as x-ray. Monolayer films of lyophilized pGEM-3Zf(-) plasmid DNA deposited on tantalum foils were exposed to Al $K{\alpha}$ X-ray (1.5 keV) for 0, 3, 7 and 10 min, respectively, in a condition of ultrahigh vacuum state. We compared DNA damages by X-ray irradiation with those by 3 eV electron irradiation. X-ray photons produced low-energy electrons (mainly below 20 eV) from the tantalum foils and DNA damage was induced chiefly by these electrons. For electron beam irradiation, DNA damage was directly caused by 3 eV electrons. Irradiated DNA was analyzed by agarose gel electrophoresis and quantified by ImagaQuant program. The quantities of remained supercoiled DNA after irradiation were linearly decreased as a function of mean absorbed dose. On the other hand, the yields of nicked circular (single strand break, SSB) and interduplex crosslinked form 1 DNA were linearly increased as a function of mean absorbed dose. From this study, it was confirmed that DNA damage was also induced by low energy electrons ($0{\sim}10\;eV$) even below threshold energies for the ionization of DNA.
We observed DNA damages as a function of mean absorbed dose to identify the indirect effect of high-energy radiation such as x-ray. Monolayer films of lyophilized pGEM-3Zf(-) plasmid DNA deposited on tantalum foils were exposed to Al $K{\alpha}$ X-ray (1.5 keV) for 0, 3, 7 and 10 min, respectively, in a condition of ultrahigh vacuum state. We compared DNA damages by X-ray irradiation with those by 3 eV electron irradiation. X-ray photons produced low-energy electrons (mainly below 20 eV) from the tantalum foils and DNA damage was induced chiefly by these electrons. For electron beam irradiation, DNA damage was directly caused by 3 eV electrons. Irradiated DNA was analyzed by agarose gel electrophoresis and quantified by ImagaQuant program. The quantities of remained supercoiled DNA after irradiation were linearly decreased as a function of mean absorbed dose. On the other hand, the yields of nicked circular (single strand break, SSB) and interduplex crosslinked form 1 DNA were linearly increased as a function of mean absorbed dose. From this study, it was confirmed that DNA damage was also induced by low energy electrons ($0{\sim}10\;eV$) even below threshold energies for the ionization of DNA.
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문제 정의
이 연구에서는 X선에 의해 발생될 수 있는 DNA의 간접적 손상, 특히 10 eV이하의 낮은 에너지 2차전자에 의한 손상을 확인하고 이를 정량화하고자 한다. 또한, X선 조사에 따른 plasmid DNA 손상을 전자선 조사에 따른 plasmid DNA 손상과 비교하여 낮은 에너지 전자가 DNA에 미치는 손상에 대하여 살펴보고자 한다.
우리가 알고 있는 바로는 국내에서 수행되는 방사선 손상에 관한 대부분의 실험들은 엑스선, 감마선, 중성자 빔, 100 eV이상의 에너지를 갖는 전자선 등 상대적으로 고에너지 방사선에 의한 직접적인 영향에 관한 것이다. 본 연구는 국내에서 수행되지 않았던 20 eV보다 낮은 에너지 전자선에 의한 생체 분자의 간접적인 영향에 관한 첫 시도에 의의를 둘 수 있으며, 간접적 손상 과정을 구체적으로 밝히는 데 중점을 두고 있다.
이 연구에서는 X선에 의해 발생될 수 있는 DNA의 간접적 손상, 특히 10 eV이하의 낮은 에너지 2차전자에 의한 손상을 확인하고 이를 정량화하고자 한다. 또한, X선 조사에 따른 plasmid DNA 손상을 전자선 조사에 따른 plasmid DNA 손상과 비교하여 낮은 에너지 전자가 DNA에 미치는 손상에 대하여 살펴보고자 한다.
제안 방법
1kb DNA Marker와 준비된 DNA 샘플을 TAE 버퍼(40 mM Tris· acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0)가 채워진 1% 아가로즈 젤에 로딩 후 7분 동안 100 V, 68분 동안 75 V의 전압을 걸어 전기 영동을 한다.
O 12 µl를 이용하여 plasmid DNA를 탄탈륨 박막으로부터 회수한다. DNA 회수율 평가는 동결 건조 전후의 DNA에 파장이 260 nm인 UV spectrophotometer(Hitachi U-2000)를 이용하여 UV 흡광도를 비교하여 평가한다. 이때 평가된 DNA 회수율은 약 98% 정도이다.
X선 발생장치는 PHI Model 04-548 Dual Anode X-ray Source(Perkin-Elmer)를 사용했으며, 음극 전압과 전류는 각각 4 kV, 1.1 mA로 일정하게 유지되도록 조절하였다. 이때 방출되는 X선은 에너지가 1.
본 저자의 다른 논문은 DEA를 통한 DNA 손상 과정을 밝히기 위한 것으로, DNA 구성 성분 중 당(sugar)에서 DEA를 통해 일어날 수 있는 DNA 손상의 정도를 알아보기 위해 9 eV이하의 에너지 전자를 이용하여 당고리 유사체인 tetrahydrofuran(THF)에 대한 충전 포획 단면적(charge trapping cross section C ) T 을σ측정하였다.
의 실험은 낮은 에너지의 전자 중 어떤 에너지를 갖는 전자가 우세한 역할을 했는가를 ECS로 알 수 있지만 손상된 DNA 중 몇 %가 circular DNA로 바뀌었는지 또는 몇 %가 linear DNA로 바뀌었는지 그 에너지에서의 손상 기여도는 알 수 없다[18]. 본저자는 이러한 단점을 보완하기 위하여 단일층의 DNA 박막을 제작하여 X선 조사와 전자선 조사를 통해 DNA 손상 정도를 정량적으로 비교하였다. 그러나 한번의 수행으로 신뢰도 높은 결과를 얻는 것은 매우 어려우므로 반복 수행을 통한 통계적 결과가 보다 더 신뢰도를 높일 것이다.
두 챔버 사이에는 게이트(gate) 밸브를 설치하여 샘플 로딩 챔버에 있는 샘플을 주 챔버의 샘플 홀더에 로딩할 경우에만 밸브를 열어 두 챔버의 진공이 연결되고 평소에는 밸브를 닫아두어 차동 펌핑(differential pumping)을 하게 된다. 샘플 로딩 챔버는 두 개의 회전 linear feedthrough가 설치되어 있어 최대 16개 샘플까지 로딩할 수 있게 설계되었다. 주 챔버에 설치된 X선 발생장치에서 방출된 X선은 탄탈륨 박막과 충돌하여 박막으로부터 전자를 방출한다.
그러나 한번의 수행으로 신뢰도 높은 결과를 얻는 것은 매우 어려우므로 반복 수행을 통한 통계적 결과가 보다 더 신뢰도를 높일 것이다. 우선 이러한 비교실험의 첫 단계로 3 eV 자선과 X선으로 조사된 DNA를 비교하여 그 영향을 살펴보았다. 단일층의 DNA 박막에 X선을 조사하면 대부분의 광자는 투과하게 되므로 광자에 의한 손상은 무시할 수 있고 탄탈륨에서 생성된 전자에 의해 손상을 받는다고 생각할 수 있다.
Panajotoviec al.은 pGEM-3Zf(-) plasmid DNA를 이용하여0.1~4.7 eV와 10 eV 에너지의 전자에 의해 생성되는 외가닥 절단에 대한 유효단면적(effective cross section: ECS)측정을하였다[18]. 이실험은 낮은 에너지(0.
탄탈륨 박막위에 동결건조 방법으로 제작된 pGEM-3Zf(-) plasmid DNA 단일층에 고에너방지사선인 Al Kα X-ray (1.5 keV)를 0분, 3분, 7분, 10분 동안 조사하여 평균 흡수선량에 따른 DNA 손상을 관찰하였다.
주 챔버에 설치된 X선 발생장치에서 방출된 X선은 탄탈륨 박막과 충돌하여 박막으로부터 전자를 방출한다. 탄탈륨 으로부터 생성되는 전자의 전류는 Keithley 610C solid-state electrometer를 사용하여 측정하였다. 이때 측정된 총 전류는 0.
대상 데이터
탄탈륨 박막은 두께가 0.025 mm로 동일하지만 X선 조사의 경우 크기가 25×7 mm2인 것을 사용했고, 전자선 조사의 경우 크기가 14×14 mm2인 것을 사용했다.
이론/모형
전기영동 후, 블루 형광 모드(450 nm)의 STORM860 (Molecular Dynamics)으로 젤 이미지를 찍는다. Plasmid DNA의 손상된 정도는 ImageQuant (Molecular Dynamics)를 사용하여 정량적으로 분석하였다.
성능/효과
)는 colJiM109 박테리아에서 배양 후 추출하여 QIAfilter Plasmid Giga Kit(Qiagen)으로 정제하였다. 1% 아가로즈 젤 전기영동 분석을 통하여 추출된 plasmid DNA는 95%의 supercoiled DNA와 5%의 unsupercoiled DNA로 구성되어 있음을 확인했다. X선과 전자선의 조사는 실험장비 구성상의 어려움으로 각각 다른 실험장치에서 수행되었다.
그러나 3 eV 전자는 비록 DNA 손상에 제한적이긴 하지만 지속적인 상호작용으로 가닥 절단을 일으킬 수 있다. Circular DNA와 crosslinked DNA 1의 변화율을 보면 평균 흡수선량이 증가함에 따라 X선 조사, 전자선 조사 모두 Circular DNA의 변화가 우세함을 알 수 있다. 그리고 그림 3 (c), (f) 변화량의 비교를 통해, 3 eV 전자는 전체 circular DNA 변화의 대략 5%정도에 해당되는 것을 알 수 있다.
493%였다. Unsupercoiled DNA 중 외가닥 절단에 의한 circular DNA가 평균 흡수선량의 증가에 대해 가장 두드러지는 변화를 보였는데 0분 조사시 3.754%에서 10분 조사시 9.374%로 대략 2.5배 증가했다. 물론 crosslinked form 1 역시 같은 시간 동안1.
X선 조사와 전자선 조사 두 경우 모두 평균 흡수선량이 증가함에 따라 supercoiled DNA는 선형적으로 감소하고 unsupercoiled DNA는 줄어든 supercoiled DNA 양만큼 선형적으로 증가함을 알 수 있다. X선 조사의 경우 평균 흡수선량이 0 ~ 2.
그 결과 THF 분자에 가장 우세하게 포획될 수 있는 전자는 1 eV 근처의 에너지를 갖는 전자이고 그때의 충전 포획 단면적은 σCT = 3.83×10-17 cm2로 측정되었다.
5 keV)를 0분, 3분, 7분, 10분 동안 조사하여 평균 흡수선량에 따른 DNA 손상을 관찰하였다. 그 결과 평균 흡수선량이 증가할수록 외가닥 절단에 의한 supercoiled DNA는 선형적으로 줄어드는 것을 확인할 수 있었고, circular, crosslinked form 1 DNA와 같 은 unsupercoiled DNA는 줄어든 supercoiled DNA 양만큼 증가하는 것을 확인할 수 있었다. Supercoiled DNA의 외가닥 절단은 X선 조사에 의해 탄탈륨 박막에서 생성된 낮은 에너지(10 eV이하) 전자에 기인한다.
Supercoiled DNA의 외가닥 절단은 X선 조사에 의해 탄탈륨 박막에서 생성된 낮은 에너지(10 eV이하) 전자에 기인한다. 단색의 3 eV 전자선으로 직접 조사한 경우, 3 eV 전자는 DNA 외가닥 절단과 양가닥 절단에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 X선에 의해 탄탈륨에서 생성된 다중의 에너지 전자에 의한 것보단 그 영향이 작다는 것을 확인할 수 있다.
본 실험을 통해 고에너지 방사선에 의한 DNA 간접적 손상이 일어남을 관찰할 수 있었고, DNA 간접적 손상은 DNA의 이온화 에너지보다 작은 에너지(0~10 eV)를 갖는 전자에 의해서도 일어날 수 있음을 확인할 수 있었다. 앞으로 낮은 에너지 전자에 의한 간접적인 영향을 정확하게 정량화하기 위해 0~20 eV 에너지를 갖는 전자선으로 DNA 간접 손상 실험을 계속 수행할 계획이고 DNA와 단백질의 복합체(DNA complex)를 이용한 실험도 수행할 예정이다.
후속연구
본저자는 이러한 단점을 보완하기 위하여 단일층의 DNA 박막을 제작하여 X선 조사와 전자선 조사를 통해 DNA 손상 정도를 정량적으로 비교하였다. 그러나 한번의 수행으로 신뢰도 높은 결과를 얻는 것은 매우 어려우므로 반복 수행을 통한 통계적 결과가 보다 더 신뢰도를 높일 것이다. 우선 이러한 비교실험의 첫 단계로 3 eV 자선과 X선으로 조사된 DNA를 비교하여 그 영향을 살펴보았다.
본 실험을 통해 고에너지 방사선에 의한 DNA 간접적 손상이 일어남을 관찰할 수 있었고, DNA 간접적 손상은 DNA의 이온화 에너지보다 작은 에너지(0~10 eV)를 갖는 전자에 의해서도 일어날 수 있음을 확인할 수 있었다. 앞으로 낮은 에너지 전자에 의한 간접적인 영향을 정확하게 정량화하기 위해 0~20 eV 에너지를 갖는 전자선으로 DNA 간접 손상 실험을 계속 수행할 계획이고 DNA와 단백질의 복합체(DNA complex)를 이용한 실험도 수행할 예정이다.
이것은 역으로 10 eV보다 작은 에너지를 갖는 전자에 의한 DNA 간접 손상은 3 eV 전자선외에 다른 에너지도 가닥 절단에 영향을 준다는 것을 알 수 있다. 이번 실험만으론 낮은 에너지 전자가 어느 곳을 절단하여 손상을 미치는지 알 수 없고 보다 다양한 에너지의 전자선을 이용하여 DNA 구조를 이루는 분자에 대해 많은 실험을 수행하여 DNA 손상 과정을 밝혀야할 것으로 생각된다. 지금까지 밝혀진 DNA 간접 손상 과정은 DEA를 통해 이루어지는데, 고에너지 방사선에 의해 인체에서 생성된 낮은 에너지 전자가 DNA 염기 또는 당의 π* 궤도에 흡착되어 TNI를 형성하고 일정 수명 후π* 음이온(anion)이 생성되어 당-인산기의 C-O 결합을 끊거나 들뜬 상태의 π* 궤도 에너지를 C-O 결합에 전달하여 가닥 절단을 일으키는 것으로 보고 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
X선을 포함한 고에너지 방사선이 초래하는 것은?
X선을 포함한 고에너지 방사선은 DNA를 이온화시키거나 여기 상태로 만들어 염기와 당의 변형, 염기의 결손, 외가닥 절단(single strand breaks: SSBs), 양가닥 절단(double strand breaks: DSBs)등과 같은 DNA 손상을 초래할 수 있다[1-3]. 고에너지 방사선에 의한 DNA 손상은 직접적인 손상과 간접적인 손상으로 나눌 수 있다.
직접적인 손상이란?
고에너지 방사선에 의한 DNA 손상은 직접적인 손상과 간접적인 손상으로 나눌 수 있다. 직접적인 손상은 고에너지 방사선에 의한 DNA 이온화 혹은 DNA에 결합된 물분자에 영향을 주어 생성되는 것이고, 간접적인 손상은 고에너지 방사선의 경로를 따라 생성된 래디칼(radical), 양이온, 음이온, 2차 전자와 같은 2차종(secondary species)이 DNA와 상호작용하여 생성된다[4-6]. 19세기 초 방사선이 발견된 후 방사선 손상에 관한 연구는 고에너지 방사선 위험이라는 전제 아래 직접적인 손상에 초점을 맞춰왔다.
간접적인 손상에 대한 연구의 대표적인 예는?
그러나 최근 DNA 이온화 에너지 보다 작은 에너지를 갖는 2차종에 의해서도 DNA가 손상을 받는다는 연구결과가 발표되면서 간접적인 손상에도 많은 관심을 가지게 되었다. 그 중 대표적인 것이 Sanche그룹에서 최근 발표한 논문으로 DNA 이온화 에너지보다 낮은 에너지를 갖는 전자에 의해서도 DNA 손상이 초래될 수 있다는 것이다[3]. 특히 그들이 관심을 갖는 낮은 에너지 전자는 고에너지 방사선에 의해 생성되는 2차종들 중 가장 대표적인 것으로서, 이 2차전자들 대부분은 20 eV보다 낮은 에너지를 갖고 1 MeV의 입사 에너지당 대략 5×10 4 개가 생성된다.
참고문헌 (20)
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