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문제 정의
- 본 특별호는 상기 논문을 모두 취합하고 또한 표준시험방법의 소개에 부합되게 재편집하였고, 또한 기존 논문 출간 이후의 시험 자료를 분석하여 그 결과를 보충하여 작성하였다. 따라서 본 특별호 논문은 기존의 논문자료와 중복되는 측면은 있으나, 2002년부터 2006년까지 5년간에 걸쳐 개발한 해양생태독성시험방법을 일괄 정리하여, 특별호에제시하므로서 일반 독자들의 이용 편의성을 고려하였다.
- 따라서 우리나라 해양생태계를 고려하여 독성시험에 적합한 표준시험생물을 개발하고, 또한 각 시험생물에 적합한 생태 독성 시험 방법을 개발 또는 정립하였다. 표준시험방법은 해양생태계를 대표하는 분해자, 기초생산자 및 소비자 그룹별로 개발하였으며, 각 시험생물별 독성시험방법을 설정하였다.
제안 방법
- 각 시험생물의 선정은 생태적 대표성과 시험생물의 취득 및 실험실 배양 등이 용이한 종을 우선 선정하였으며, 시험생물별 시험 방법은 각 생물의 특성을 반영하여 선정하였다. 특히 실험 결과의 재현성(reproducibility)과 시험생물의 취득 용이성을 고려하였다.
- 최종 표준시험종은 다양한 후보 시험종으로부터 선정되었으며, 그 선정 기준은 Table 1과 같다. 그러나 선정 기준이 매우 다양하고 각각의 선정 기준을 모두 만족하는 시험종을 찾기는 매우 어려운 실정이므로 각각의 선정 요소를 고려하여 가장 부합되는 생물을 최종 표준 시험종으로 선정하였다(Table 2).
- 예로서 제초제와 같은 농약은 작용기작상 식물에 대한 영향이 상대적으로 크기 때문에, 동물플랑크톤이나 어류만으로 독성시험을 하는 경우, 독성이 낮게 평가될 수 있다. 따라서 대상물질의 독성시험시 기초생산자, 분해자 및 소비자를 각각 대표하는 최소 3개 생물군을 이용하여 독성시험을 수행해야 한다. 특히 본 시험법에서 제시하는 시험생물 이외에 다른 생물을 이용할 경우에는 시험생물의 분류체계, 채취 및 취득 과정에서부터 실험실 배양 또는 사육에 이르는 전 과정을 시험 결과에 반드시 포함하여야 한다.
- 표준시험생물인 녹조구멍갈파래는 생식 시기에 엽체에서 유주자(zoospore)가 방출되며, 그 결과로 엽체의 색깔이 변하게 된다. 따라서 독성물질에 노출된 엽체의 색깔이 변화된 면적을 endpoint로 설정하였다. 시험방법은 일정 크기의 엽체를 대상물질에 96시간 동안 노출한 후 엽체의 색깔이 변화된 면적을 영상분석 시스템이나 현미경 또는 육안으로 관찰하여, 그 면적을 환산하여 대조구와 비교한다.
- 또한 각 시험방법별 정확도를 검증하기 위하여 각 시험 방법별로 표준시험물질을 선정하였으며, 각각의 물질별 민감도 허용 범위를 실험을 통하여 설정하였다. 표준시험물질은 각 시험생물에 가장 강한 독성을 보이는 물질과 기존의 실험을 통하여 많은 자료가 확보되어 있는 물질로 선정하였다.
- 특히 실험 결과의 재현성(reproducibility)과 시험생물의 취득 용이성을 고려하였다. 또한 각 실험생물별로 시험 기준에 적합한지의 여부를 판정하는 “시험적합도 기준(test acceptability criteria)”을 제시하였으며, 또한 시험 생물의 민감도(sensitivity)를 검증하기 위하여 시험생물별 표준 독성물질을 선정하여 각각에 대한 민감도 범위를 제시하였다.
- 마지막으로 독성 시험 후 발생되는 자료를 통계적으로 처리하여무영향농도(NOEC, No Observed Effective Concentration), 최저영향농도(LOEC, Lowest Observed Effective Concentration), 반수 치사(LC50, Median Lethal Concentration) 또는 반수영향농도(EC50, Median Effective Concentration) 및 신뢰구간 등을 계산하는 통계처리 방법을 제시하였다.
- 본 시험방법은 현장에서 채취한 퇴적물 내의 내서생물을 모두 제거한 후 시험생물 10개체씩을 시험구별로 10일 동안 노출하여 대상 물질의 독성을 검증하는 방법이다. 본 방법은 미환경보호국에서 개발된 시험방법을 참고하였으나 시험생물은 국내종으로 대체하였다. 본 시험방법은 노출기간이 10일에 이를 정도로 비교적 장기간의 시험방법이나 퇴적물내의 독성물질과 시험생물의 충분한 반응 시간을 고려하여 노출시간을 설정하였다.
- 본 방법은 미환경보호국에서 개발된 시험방법을 참고하였으나 시험생물은 국내종으로 대체하였다. 본 시험방법은 노출기간이 10일에 이를 정도로 비교적 장기간의 시험방법이나 퇴적물내의 독성물질과 시험생물의 충분한 반응 시간을 고려하여 노출시간을 설정하였다. 어류를 이용한 독성시험방법은 자어의 7일 사망률을 endpoint로 설정하였다.
- 본 연구에서 개발된 표준시험방법은 개체 또는 개체군의 사망 및 성장의 변화를 바탕으로 한 시험방법이다. 따라서 본 시험 방법은 분자생물학적 단계나, 군집 및 생태계를 이용한 좀더 포괄적인 독성시험 방법이 누락되어 있다.
- , 2005a, 2005b)에 대한 논문이 발표되었다. 본 특별호는 상기 논문을 모두 취합하고 또한 표준시험방법의 소개에 부합되게 재편집하였고, 또한 기존 논문 출간 이후의 시험 자료를 분석하여 그 결과를 보충하여 작성하였다. 따라서 본 특별호 논문은 기존의 논문자료와 중복되는 측면은 있으나, 2002년부터 2006년까지 5년간에 걸쳐 개발한 해양생태독성시험방법을 일괄 정리하여, 특별호에제시하므로서 일반 독자들의 이용 편의성을 고려하였다.
- 따라서 독성물질에 노출된 엽체의 색깔이 변화된 면적을 endpoint로 설정하였다. 시험방법은 일정 크기의 엽체를 대상물질에 96시간 동안 노출한 후 엽체의 색깔이 변화된 면적을 영상분석 시스템이나 현미경 또는 육안으로 관찰하여, 그 면적을 환산하여 대조구와 비교한다. 엽체의 색깔에 변화가 없거나, 사멸하는 경우가 독성이 강하다.
- 정밀성(precision)을 검증하여야 한다. 시험의 정밀도는 동일한 노출 농도에 대한 반복수를 두어 시험하므로서 검증할 수 있고, 정확도는 표준독성시험물질(reference materials)을 이용하여 검증한다. 따라서 각 시험생물별로 노출구에 대한 반복수는 3~5로 설정하였다.
- 시험종은 해양생태계의 영양학적 역할(trophic role)을 고려하여 분해자, 기초생산자 및 소비자로 구분하여 각 영양단계에 최소 1종 이상을 포함하도록 선정하였다.
- 본 시험방법은 노출기간이 10일에 이를 정도로 비교적 장기간의 시험방법이나 퇴적물내의 독성물질과 시험생물의 충분한 반응 시간을 고려하여 노출시간을 설정하였다. 어류를 이용한 독성시험방법은 자어의 7일 사망률을 endpoint로 설정하였다. 본 시험의 경우 자어를 대상물질에 노출하여 4일 후부터 사망률이 급증하게 되며, 시험생물의 조기 사망이 이루어져 충분한 독성이 반영된 경우에는 시험기간을 단축할 수 있다.
- 고려하여 선정하였다(Table 2). 우선 해양성 발광박테리아를 이용한 시험은 독성물질에 노출된 발광박테리아가 15분 및 30분 후에 발광이 감소되는 정도를 endpoint로 설정하였다. 본 시험 방법은 미국의 SDI(Strategic Diagnostic Inc, USA) 및 한국의 네오엔비즈에서 시험생물 및 발광측정기기를 공급하고 있으며, 시험의 정확도 및 정밀도 등이 우수하여 국제적으로 통용되는 시험방법이다.
- 본 시험 방법은 동일한 생물을 이용하여 급성 및 만성독성을 검증할 수 있다는 장점이 있다. 저서성 요각류를 이용한 시험은 배양중인 개체군중에서 일정크기(100~200µm) 만을 체를 이용하여 선별한 후 48시간 사망률을 endpoint로 설정하였다. 따라서 해양의 1차 소비자를 이용한 시험방법은 주로 초기생활사 단계를 이용한 시험 방법으로 설정하였다.
- 각 생물의 특성을 반영하여 선정하였다. 특히 실험 결과의 재현성(reproducibility)과 시험생물의 취득 용이성을 고려하였다. 또한 각 실험생물별로 시험 기준에 적합한지의 여부를 판정하는 “시험적합도 기준(test acceptability criteria)”을 제시하였으며, 또한 시험 생물의 민감도(sensitivity)를 검증하기 위하여 시험생물별 표준 독성물질을 선정하여 각각에 대한 민감도 범위를 제시하였다.
- 표준독성시험방법은 시험의 용이성 및 결과의 일관성을 우선적으로 고려하여 선정하였다(Table 2). 우선 해양성 발광박테리아를 이용한 시험은 독성물질에 노출된 발광박테리아가 15분 및 30분 후에 발광이 감소되는 정도를 endpoint로 설정하였다.
- 따라서 우리나라 해양생태계를 고려하여 독성시험에 적합한 표준시험생물을 개발하고, 또한 각 시험생물에 적합한 생태 독성 시험 방법을 개발 또는 정립하였다. 표준시험방법은 해양생태계를 대표하는 분해자, 기초생산자 및 소비자 그룹별로 개발하였으며, 각 시험생물별 독성시험방법을 설정하였다.
- 표준시험생물의 선정은 각 시험생물별로 생태적 대표성과 생물취득의 용이성 등을 고려하여 선정하였다. 최종 표준시험종은 다양한 후보 시험종으로부터 선정되었으며, 그 선정 기준은 Table 1과 같다.
- 해양생태계의 기초생산자를 이용한 시험 방법중 식물플랑크톤을 이용한 시험방법은 개체군성장저해율(population growth inhibition) 을 endpoint로 설정하였다. 독성물질에 노출된 식물플랑크톤의 개체군이 72~96시간 후에 대조구에 비하여 개체군성장이 저해된 정도를 독성 평가에 이용하는 방법이다.
- 해양퇴적물 독성시험방법으로는 저서성 단각류의 10일 사망률을 endpoint로 설정하였다. 본 시험방법은 현장에서 채취한 퇴적물 내의 내서생물을 모두 제거한 후 시험생물 10개체씩을 시험구별로 10일 동안 노출하여 대상 물질의 독성을 검증하는 방법이다.
- 또한 노출 시간이 72~96시간에 이르므로 식물플랑크톤의 세대기간(generation time)을 고려할 때 대상물질의 독성을 충분히 반영할 수 있다는 장점이 있다. 해조류를 이용한 독성시험은 해조류의 생식특성을 이용한 시험방법을 설정하였다. 표준시험생물인 녹조구멍갈파래는 생식 시기에 엽체에서 유주자(zoospore)가 방출되며, 그 결과로 엽체의 색깔이 변하게 된다.
대상 데이터
- 본 종은 우리나라 동서남해 연안에 널리 분포하는 종이며, 한국 해양 미세조류은행을 통하여 시험종을 공급 받을 수 있다. 또한 실험실에서 배양이 용이하고 국제표준기구(ISO)에서 생태독성 평가용 표준시험생물로 선정한 종이다. 또한 녹조구멍갈파래는 우리나라 동서남해안에 분포하는 대표적 해조류이며, 실험실에서 전 생활사를 배양하기는 불가능하나, 현장에서 상시 채취가 가능하고, 또한 채취한 엽체를 실험실에서 2~3개월 정도 보관이 가능하므로 시험생물의 공급 측면에서 어려움이 없을 것으로 판단된다.
- 우선 송사리는 담수산 생물로 알려져 있으나, 서식환경이 담수에서 해수 및 염전에 이르는 매우 다양한 분포를 보인다. 또한 실험실에서 소규모 공간을 이용하여 사육이 가능하므로 광염성인 송사리를 시험생물로 선정하였다. 반면 넙치는 실험실에서 사육하기에는 그 크기 때문에 어려움이 있으나, 국내 연안 생태계의 주요 어종이며, 또한 국내 양식생물의 대표종으로서 넙치 종묘배양시설을 통하여 연중시험생물의 공급이 가능하다.
- 및 타 실험실로부터 분양받아 6개월 이상 장기간 배양/사육 하여 이용하였다. 발광박테리아는 동결 건조된 상용화된 제품을 이용하였으며, 해산규조류는 한국해양미세조류은행(Korea Marine Microalgae Culture Center)으로부터 분양받아 실험실에서 6개월 이상 계대 배양하였다. 윤충류 및 저서요각류는 강릉대학교 해양생명공학부 먹이생물연구실에서, 송사리는 한국화학연구원 안전성평가연구소 및 환경부 국립환경과학원에서 분양받아 실험실에서 최소 6개월 이상 사육하여 실험에 이용하였다.
- 본 실험에 이용된 각종 시험생물은 야외에서 채집하거나 또는 종자은행 및 타 실험실로부터 분양받아 6개월 이상 장기간 배양/사육 하여 이용하였다. 발광박테리아는 동결 건조된 상용화된 제품을 이용하였으며, 해산규조류는 한국해양미세조류은행(Korea Marine Microalgae Culture Center)으로부터 분양받아 실험실에서 6개월 이상 계대 배양하였다.
- 본 종은 우리나라 동서남해 연안에 널리 분포하는 종이며, 한국 해양 미세조류은행을 통하여 시험종을 공급 받을 수 있다. 또한 실험실에서 배양이 용이하고 국제표준기구(ISO)에서 생태독성 평가용 표준시험생물로 선정한 종이다.
- 시험생물의 선정은 해양생태계의 분해자, 기초생산자 및 소비자를 대표하는 생물로 선정하였으며, 시험 대상 물질에 대하여 최소 3개 영양학적 역할군을 포함할 것을 권장한다. 특정 시험물질의 경우 시험생물의 종류에 따라서 그 영향이 간과될 수 있으므로 이에 대한 세심한 주의가 필요하다.
- 우선 분해자를 대표하여 세계적으로 많은 독성시험이 이루어진 해산 발광박테리아인 Vibrio fischeri를 선정하였다. 본 종은 동결 건조된 상태나 배양중인 상태로 시험생물의 공급이 가능하며, 독성물질에 노출된 후 발광량의 변화를 이용하여 독성의 상대적 크기를 진단하는 시험기법이다.
- 발광박테리아는 동결 건조된 상용화된 제품을 이용하였으며, 해산규조류는 한국해양미세조류은행(Korea Marine Microalgae Culture Center)으로부터 분양받아 실험실에서 6개월 이상 계대 배양하였다. 윤충류 및 저서요각류는 강릉대학교 해양생명공학부 먹이생물연구실에서, 송사리는 한국화학연구원 안전성평가연구소 및 환경부 국립환경과학원에서 분양받아 실험실에서 최소 6개월 이상 사육하여 실험에 이용하였다. 이외에 녹조 구멍 갈파래 및 저서단각류는 야외에서 채집한 후 일정 조건의 실험실에서 사육하였다.
- 용이성 등을 고려하여 선정하였다. 최종 표준시험종은 다양한 후보 시험종으로부터 선정되었으며, 그 선정 기준은 Table 1과 같다. 그러나 선정 기준이 매우 다양하고 각각의 선정 기준을 모두 만족하는 시험종을 찾기는 매우 어려운 실정이므로 각각의 선정 요소를 고려하여 가장 부합되는 생물을 최종 표준 시험종으로 선정하였다(Table 2).
- 선정하였으며, 각각의 물질별 민감도 허용 범위를 실험을 통하여 설정하였다. 표준시험물질은 각 시험생물에 가장 강한 독성을 보이는 물질과 기존의 실험을 통하여 많은 자료가 확보되어 있는 물질로 선정하였다. 표준시험물질을 이용한 독성 시험은 표준시험생물의 민감도를 검증하기 위한 수단이며, 모든 실험시 반드시 포함되어야할 사항은 아니지만 시험생물별로 연간 2회 정도의 표준물질 독성시험을 수행하여 시험생물이 독성물질에 민감하게 반응하는지를 검증하여야 한다.
- 해양 퇴적물 독성시험을 위해서는 저서단각류를 이용한 시험 방법을 선정하였으며, 표준시험생물로는 Mandibulophoxus mai와 Monocorophium acherusicum을 선정하였다. M.
- 해양생태계의 1차 소비자인 동물플랑크톤 중에서는 해산 윤충류인 Brachionus plicatilis를 선정하였다. 본 종은 우리나라 하구 역에서 주로 발견되며, 염분에 대한 내성이 매우 광범위하다.
- 해양생태계의 2차 소비자인 어류는 송사리(Oryzias latipes)와 넙치(Paralichthys olivaceus)를 표준시험생물로 선정하였다. 우선 송사리는 담수산 생물로 알려져 있으나, 서식환경이 담수에서 해수 및 염전에 이르는 매우 다양한 분포를 보인다.
- 해양의 기초생산자를 대표하는 식물플랑크톤 중에서는 국내 연안 생태계의 대표종인 해산규조류, Skeletonema costatum을 선정하였다. 본 종은 우리나라 동서남해 연안에 널리 분포하는 종이며, 한국 해양 미세조류은행을 통하여 시험종을 공급 받을 수 있다.
성능/효과
- acherusicum을 선정하였다. M. acherusicume 서남해안 일대의 다양한 입도에 서식하며, 본 연구를 통하여 실험실 사육 방법을 개발하여 상시 공급이 가능하다. 반면 M.
- 따라서 시험생물의 전환에 따른 시험생물의 배양/사육, 시험 방법 및 과정과 시험적합도기준 등은 시험생물에 적합하게 재설정하였으며, 모든 시험방법은 시험의 편이성과 일관성을 위하여 시험생물별로 차이는 있으나 Table 4에 제시된 정보가 기본적으로 제 공된다. 각각의 시험방법을 시험종의 취득, 시험방법의 용이성, 시험 비용 등을 고려하여 점수화한 결과, 비교적 효용성이 우수한 시험법은 발광박테리아, 식물플랑크톤, 동물플랑크톤 및 저서 성 단각류(M. acherusicum)로 나타났다(Table 5). 상기 시험방법은 시험생물의 취득이 용이하고 또한 시험방법이 비교적 간단한 특징을 갖는다.
- 독성물질에 노출된 식물플랑크톤의 개체군이 72~96시간 후에 대조구에 비하여 개체군성장이 저해된 정도를 독성 평가에 이용하는 방법이다. 본 시험방법은 개체군 변화를 관찰하기 위하여 24시간 간격으로 식물플랑크톤 개체군의 세포 수를 측정해야하는 번거로움이 있으나 단일종 시험이므로 엽록소농도를 형광측정기로 측정하거나 영상분석 장치가 부착된 현미경을 이용할 경우 세포수 변화를 관찰하기에 매우 용이하다. 또한 노출 시간이 72~96시간에 이르므로 식물플랑크톤의 세대기간(generation time)을 고려할 때 대상물질의 독성을 충분히 반영할 수 있다는 장점이 있다.
- 본 연구 결과로 제시된 해양생태독성시험방법은 미 환경보호국이나 국제기구에서 개발된 시험방법을 근거로 하였으나, 표준시험생물은 국내 서식 생물로 대체하여 별도로 개발 또는 설정된 시험 방법이다. 따라서 시험생물의 전환에 따른 시험생물의 배양/사육, 시험 방법 및 과정과 시험적합도기준 등은 시험생물에 적합하게 재설정하였으며, 모든 시험방법은 시험의 편이성과 일관성을 위하여 시험생물별로 차이는 있으나 Table 4에 제시된 정보가 기본적으로 제 공된다.
후속연구
- 그러나 이러한 단계의 독성시험 방법은 아직 세계적으로도 검증된 방법이 개발되지 않았다. 단 우리나라에서 분자생물학적 독성 검증 방법이나 해양인공생태계를 이용한 유해물질 독성평가 방법을 시도하고 있으므로 앞으로 5년 이내에 이 분야에 대한 가시적 성과가 있을 것으로 생각된다.
- 따라서 본 시험방법은 이를 뒷받침하는 학문적 기반과 실용적 방법을 제공하는데 기여할 것으로 생각된다.
- 특히 본 시험법에서 제시하는 시험생물 이외에 다른 생물을 이용할 경우에는 시험생물의 분류체계, 채취 및 취득 과정에서부터 실험실 배양 또는 사육에 이르는 전 과정을 시험 결과에 반드시 포함하여야 한다. 또한 해당 생물군에 해당되는 표준시험 법상의 표준독성시험물질을 이용하여 생물의 민감도 및 정밀도에 대한기초 자료도 함께 제시하므로서 시험결과의 신뢰성을 확보하고, 또한 추가적인 표준시험생물로서의 등재도 가능하다. 해양생태 독성시험 결과는 국내 실정한 적합한 한국해양독성 DB시스템을 구축하여 등재할 예정이다.
- 표준시험물질은 각 시험생물에 가장 강한 독성을 보이는 물질과 기존의 실험을 통하여 많은 자료가 확보되어 있는 물질로 선정하였다. 표준시험물질을 이용한 독성 시험은 표준시험생물의 민감도를 검증하기 위한 수단이며, 모든 실험시 반드시 포함되어야할 사항은 아니지만 시험생물별로 연간 2회 정도의 표준물질 독성시험을 수행하여 시험생물이 독성물질에 민감하게 반응하는지를 검증하여야 한다. 각각의 시험방법별 시험적합도 기준, 표준물질의 종류를 Table 3에 제시하였다.
- 또한 해당 생물군에 해당되는 표준시험 법상의 표준독성시험물질을 이용하여 생물의 민감도 및 정밀도에 대한기초 자료도 함께 제시하므로서 시험결과의 신뢰성을 확보하고, 또한 추가적인 표준시험생물로서의 등재도 가능하다. 해양생태 독성시험 결과는 국내 실정한 적합한 한국해양독성 DB시스템을 구축하여 등재할 예정이다.
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