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제안 방법
- L-J배지에서의 배양은 7건의 표본에서 집락이 형성되어 나타났다. L-J배지에서 배양된 집락이 NTM인지 확인하기 위하여 배지에서 균 집락을 멸균된 loop로 각각 채취하여 acid-fast 염색과 간접 PCR-RFLP를 시행하였다. Acid-Fast 염색 결과 7건 모든 표본에서 양성반응을 보였다(Fig .
- Thermal cycler의 반응조건은 94℃에서 5분간 반응시킨 후 변성(94℃에서 20초), 결합(58℃에서 20초), 신장(72℃에서 60초)반응을 45 cycle 시행한 후, 72℃에서 10분 동안 최종 신장반응을 시행하였다. PCR 반응산물의 결과 확인은 2% agarose gel을 준비하고, DNA size marker(20-bp ladder)와 PCR 반응산물 5 μL를 150 volt에서 20분간 전기영동 하였다. Etidium bromide로 DNA를 염색하여 UV transilluminator에서 360 bp의 반응산물을 확인하였다(Telenti 등, 1993).
- PCR-RFLP Assay kit(M&D, Korea)를 이용하였다. PCR 증폭 과정은 마이코박테리아의 RNA 중합효소 β-소단위를 코딩하는 rpoB 유전자의 일정부위(rpoB 유전자의 902~1261번 염기까지, 총 360 bp)를 다량 증폭시켰다. 증폭 과정에 사용된 primer set는 5’-TCAAGGAGAAGCGCTACGA-3’(RPO5’) 그리고 5’-GGATGTTGATCAGGGTCTGC-3’(RPO3’)을 이용하였다(Kim 등, 1999).
- PCR 반응액 조성은 PCR premix(Bioneer, Korea)에 추출된 DNA 5 μL와 8-MOP solution 18 μL를 첨가하여 최종 50 μL 반응액을 만들어 실험에 이용하였다. Thermal cycler의 반응조건은 94℃에서 5분간 반응시킨 후 변성(94℃에서 20초), 결합(58℃에서 20초), 신장(72℃에서 60초)반응을 45 cycle 시행한 후, 72℃에서 10분 동안 최종 신장반응을 시행하였다. PCR 반응산물의 결과 확인은 2% agarose gel을 준비하고, DNA size marker(20-bp ladder)와 PCR 반응산물 5 μL를 150 volt에서 20분간 전기영동 하였다.
- 목욕탕 물 표본은 수도권 내 대중목욕탕 32곳에서 각각 200 mL씩 채수했다. 그 후 4,500 rpm, 30분 원심한 후 침전물은 4% NaOH로 20분 처리하여 acid-fast 염색, L-J 배지접종 그리고 직접 PCR 분석에 이용했다.
- 따라서 위에서 언급했던 내용을 기초로 하여, 저자들은 대중이 이용하는 목욕탕 물에 NTM이 존재하는지 여부를 조사하기로 결정했으며 수도권 32개 목욕탕을 대상으로 채수를 시행했다. 그 후 AFB염색, L-J 배지에서의 배양 그리고 PCR을 이용하여 동정했다.
- 5 μL를 각각의 반응액에 넣은 후 37℃ thermal cycler에서 15시간 반응시켰다. 그 후 RFLP분석을 위하여 20 bp DNA size marker 10 μL와 제한효소 반응산물 10 μL를 4% Nusieve gel, 150 volt에서 35분간 전기영동 하였다. 결과는 UV transilluminator에서 restriction enzyme recognition site를 확인하고, 판독은 제조사에서 제시한 ‘마이코박테리아 및 노카디아 동정 알고리즘’을 참조하여 동정하였다.
- 집락 생성유무는 6주 동안 매일 관찰하여 확인했다. 그리고 집락이 형성된 표본은 acid-fast 염색을 시행하였고, acid-fast 염색에서 양성으로 염색된 표본은 간접 PCR에 응용했다.
- 저자는 현재까지 발표된 사례는 없지만 대중이 이용하는 목욕탕 물에 NTM이 존재한다면 심각한 사회적 문제가 야기될 것으로 판단하고 목욕탕 물에 대한 NTM 존재유무를 조사하기로 결정하였다. 따라서 수도권 32개 대중목욕탕 물을 채수하여 조사했으며 NTM 검출을 위하여 acid-fast 염색, Löwenstein-Jensen(L-J) 배지에서의 배양 그리고 PCR-RFLP 방법을 이용하여 대중 목욕탕 물의 NTM 오염정도 및 오염 균종을 동정하였다.
- 저자는 현재까지 발표된 사례는 없지만 대중이 이용하는 목욕탕 물에 NTM이 존재한다면 심각한 사회적 문제가 야기될 것으로 판단하고 목욕탕 물에 대한 NTM 존재유무를 조사하기로 결정하였다. 따라서 수도권 32개 대중목욕탕 물을 채수하여 조사했으며 NTM 검출을 위하여 acid-fast 염색, Löwenstein-Jensen(L-J) 배지에서의 배양 그리고 PCR-RFLP 방법을 이용하여 대중 목욕탕 물의 NTM 오염정도 및 오염 균종을 동정하였다.
- L-J 배지 접종은 10 μL 물 표본을 L-J 배지 위에 접종 했으며(Difco, USA), 그 후 37℃에서 배양했다. 집락 생성유무는 6주 동안 매일 관찰하여 확인했다. 그리고 집락이 형성된 표본은 acid-fast 염색을 시행하였고, acid-fast 염색에서 양성으로 염색된 표본은 간접 PCR에 응용했다.
대상 데이터
- NTM은 사람에서만 검출되는 것이 아니라 생수, 수도물 및 기타 환경에서도 발견될 수 있음이 밝혀지고 있으며 전 세계적으로 분포하고 있다(Falkinham, 1996; Chang 등, 2002). 따라서 위에서 언급했던 내용을 기초로 하여, 저자들은 대중이 이용하는 목욕탕 물에 NTM이 존재하는지 여부를 조사하기로 결정했으며 수도권 32개 목욕탕을 대상으로 채수를 시행했다. 그 후 AFB염색, L-J 배지에서의 배양 그리고 PCR을 이용하여 동정했다.
- 목욕탕 물 표본은 수도권 내 대중목욕탕 32곳에서 각각 200 mL씩 채수했다. 그 후 4,500 rpm, 30분 원심한 후 침전물은 4% NaOH로 20분 처리하여 acid-fast 염색, L-J 배지접종 그리고 직접 PCR 분석에 이용했다.
- 목욕탕 물에서의 NTM 존재를 증명하기 위하여 수도권 32곳의 공중 대중목욕탕에서 각각 물 표본을 채수하여 실험에 이용했다. Acid-fast 염색 결과는 32건의 표본 중 2건에서 양성을 보여 6.
- 본 실험에서는 양성 대조로 M. tuberculosis를 사용하였고, 제한효소는 MspⅠ과 HaeⅢ를 이용하였으며, 제한효소 반응액은 PCR반응산물 15 μL, 10x buffer 2 μL, 멸균증류수 2.5 μL의 혼합액에 MspⅠ(10 U/ μL) 0.5 μL와 HaeⅢ(10 U/μL) 0.5 μL를 각각의 반응액에 넣은 후 37℃ thermal cycler에서 15시간 반응시켰다. 그 후 RFLP분석을 위하여 20 bp DNA size marker 10 μL와 제한효소 반응산물 10 μL를 4% Nusieve gel, 150 volt에서 35분간 전기영동 하였다.
- PCR 증폭 과정은 마이코박테리아의 RNA 중합효소 β-소단위를 코딩하는 rpoB 유전자의 일정부위(rpoB 유전자의 902~1261번 염기까지, 총 360 bp)를 다량 증폭시켰다. 증폭 과정에 사용된 primer set는 5’-TCAAGGAGAAGCGCTACGA-3’(RPO5’) 그리고 5’-GGATGTTGATCAGGGTCTGC-3’(RPO3’)을 이용하였다(Kim 등, 1999).
이론/모형
- Acid-fast의 염색은 고전적인 Kinyoun 방법을 이용해서 수행했다(Koneman 등, 1997). Slide 는 98% ethanol로 깨끗이 닦은 후, 각 물 표본 10 μL 적하시켜 건조 고정 후 염색을 했다.
- 그 후 RFLP분석을 위하여 20 bp DNA size marker 10 μL와 제한효소 반응산물 10 μL를 4% Nusieve gel, 150 volt에서 35분간 전기영동 하였다. 결과는 UV transilluminator에서 restriction enzyme recognition site를 확인하고, 판독은 제조사에서 제시한 ‘마이코박테리아 및 노카디아 동정 알고리즘’을 참조하여 동정하였다.
- 마이코박테리아 신속 동정은 중합효소연쇄반응-제한절편길이다형성(PCR-RFLP)방법을 이용하였으며(Bödding-haus 등, 1990), Myco-ID® PCR-RFLP Assay kit(M&D, Korea)를 이용하였다. PCR 증폭 과정은 마이코박테리아의 RNA 중합효소 β-소단위를 코딩하는 rpoB 유전자의 일정부위(rpoB 유전자의 902~1261번 염기까지, 총 360 bp)를 다량 증폭시켰다.
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