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문제 정의
- 이러한 결과는 아마도 Hur 등의 연구에서 이미 논의한 바와 같이 맥문동 부탄올 분획물 자체가 PC 12 세포에 직접 작용히는 NGF mimic 효과로 기인한다고 생각된다. 동물모델에서 신경성장인자(NGF) 분비 촉진 검색법 - In vh'o 마우스 모델에서 산지별 맥문동 부탄올 분획의 NGF 분비 효과를 확인하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 마우스에서 밀양 맥문동 부탄올 분획 투여군은 대조군에 비하여 100 mg/kg와 1 mg/kg의 투여 용량에서 NGF 분비를 각각 154%와 84% 증가시켰으며 ' 투여 용량에 비례하여 NGF 의 분비도 촉진되는 경향을 보여주었다.
- 최근 허등은 steroidal saponin의 하나인 spicatoside A가 맥문동의 신경성장인자 유도 효과의 주요성분으로 추정하였다.지 따라서 본 연구는 중국산 소엽맥문동, 국내산 청양 맥문동, 밀양 맥문동의 부탄올 분획과 steroidal saponin인 Spicatoside A의 함량과의 관계를 살펴보고 이들의 신경성장인자 유도 효과를 통하여 In vitro 실험과 In vivo 동물실험에서 비교하여 그 상관성 여부를 검증하고자 한다.
제안 방법
- spicatoside A의 peak를 얻었다. (data not shown) spicatoside A 표준품으로 calibration curve를 작성 하고 correlation coefficient『=0.999 의 직선성을 얻은 후, 산지별 맥문동 중 spicatoside A 의 농도를 구하였다. 밀양산 (MYL).
- NGF antibody에 의한 맥문동의 신경돌기 성장에 대한효과 - C6 glioma 세 포 (rat astrocyte cell)에 우태 아 혈청 (Fetal bovine serum 10%, v/v) 그리고 1% 페니실린 스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 포함된 DMEM 배지에 산지별 맥문동 부탄올분획 추출물을 각각 10 ㎍/ml 농도로처리한 후 24시간 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 상등액을 취한 후 NGF antibody를 0.
- NGF neutralization에 의한 맥문동의 신경돌기 성장에대한 효과 - 산지별 맥문동 부탄올 분획을 C6 glioma 세포 (rat astrocyte cell)에 가하여 생성된 NGF함유 배지에 NGF antibody 투여한 후 각각 PC 12 세포의 신경돌기 성장효과를 비교하였다. 중국산 맥문동 부탄올 분획물(CHI)의경우 antibody 투여군과 비투여군 모누 신경돌기 성장이 나타나지 않았다.
- 5 pig/ml 농도로 배양액에 가하고 4°C에서 24시간 반응시켰다. PC 12 세포를 NGF antibody를 가한 배양액으로 72시간 배양한 후 신경돌기 (neurite)의 길이를 도립 상대비 현미경(CK-2, Olympus, USA)을 이용하여 측정하였다. 신경돌기의 성장은 세포 몸체의 직경에 대한 신경돌기 길이의 비로 환산하였다.
- PC12 cell 에서 신경돌기 성장 효과 - 미분화 된 PC 12세포에서 시료의 신경돌기 성장에 미치는 영향을 알아보기위하여 PC 12 세포에 각 산지별 맥문동 부탄올 추출물을 10 |ig/ml 농도로 투여한 후 신경돌기의 성장 길이를 측정하여신경돌기 성장효과를 평가하였다. 신경성장인자(NGF)의 신경돌기 성장효과를 100%라고 히였을 때 밀양산 맥문동은 81%의 신경돌기 성장을 나타내 가장 높은 효과를 보였고' 청양산 맥문동은 54%.
- 이미 맥문동의 spicatoside A는 PC 12 세포에서 신경돌기 분화에 괸, 여히는 성분이고 이러한 작용이 내인성 NGF 분비에 기인한다고 보고하였다. 그래서 산지가 서로 다른 맥문동 부탄올 분획물의 PC 12 세포의 신경돌기 성장효과와 spicatoside A 함량과의 상관성을 분석히였다. 따라서 이러한 유의적인 상관계수는 산지별 맥문동 부탄올 분획물의 신경돌기분화능이 서로 상이하며 이러한 원인중 히나는 Spicatoside A 의 함량에 기인한다고 할 수 있을것 이다.
- 혈청 중 신경성장인자는 ELISA Kit (R&D system,USA )방법에 의해 측정하였다. 대조군, 밀양, 청양, 중국산 맥문동 부탄올 분획 추출물을 각각 100mg/kg, 1mg/kg 용량으로 웅성 아이씨알 마우스 7주령에 1회 경구투여하고 12시간 후 안정맥에서 혈청을 채취하여 내인성 신경성장인자 양을 측정하였다.
- PC 12 세포는 37°C, 5% CO, 조건의 배양기에서 말 혈청(Horse serum 10%, v/v), 우태아 혈청 (Fetal bovine serum 5%, v/v) 그리고 1% 페니실린 스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 포함된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 미분화 된 PC 12세포에서 시료의 신경돌기 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여, PC 12 세포를 폴리-D-라이신(Poly-D-lysine)으로 코팅한 6 웰 플레이트에 2% 말 혈청(horse serum), 1% 페니실린 스트렙토마이신 5x1O4개로 분주하여, 24시간 후에 에탄올 lOW/ml, 밀양, 청양, 중국산 맥문동 부탄올 분획 추출물을 각각 10 ㎛/ml 와 NGF 50 ng/ml 을 각각 처리하였다. 신경돌기(neurite)의 길이는 시료 처리 후 4^시간 후에 도립 상대비 현미경(CK-2, Olympus, USA)을 이용하여 측정하였다.
- 미분화 된 PC 12세포에서 시료의 신경돌기 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여, PC 12 세포를 폴리-D-라이신(Poly-D-lysine)으로 코팅한 6 웰 플레이트에 2% 말 혈청(horse serum), 1% 페니실린 스트렙토마이신 5x1O4개로 분주하여, 24시간 후에 에탄올 lOW/ml, 밀양, 청양, 중국산 맥문동 부탄올 분획 추출물을 각각 10 ㎛/ml 와 NGF 50 ng/ml 을 각각 처리하였다. 신경돌기(neurite)의 길이는 시료 처리 후 4^시간 후에 도립 상대비 현미경(CK-2, Olympus, USA)을 이용하여 측정하였다. 신경돌기의 성장은 세포 몸체의직경에 대한 신경돌기 길이의 비로 환산하였다.
대상 데이터
- epinephrine, norepinephrine등 신경전달물질의분비가 활발하여 신경계 연구에 많이 사용되고 있다. PC 12 세포는 37°C, 5% CO, 조건의 배양기에서 말 혈청(Horse serum 10%, v/v), 우태아 혈청 (Fetal bovine serum 5%, v/v) 그리고 1% 페니실린 스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 포함된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 미분화 된 PC 12세포에서 시료의 신경돌기 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여, PC 12 세포를 폴리-D-라이신(Poly-D-lysine)으로 코팅한 6 웰 플레이트에 2% 말 혈청(horse serum), 1% 페니실린 스트렙토마이신 5x1O4개로 분주하여, 24시간 후에 에탄올 lOW/ml, 밀양, 청양, 중국산 맥문동 부탄올 분획 추출물을 각각 10 ㎛/ml 와 NGF 50 ng/ml 을 각각 처리하였다.
- 맥문동부탄올분획 제조 - 밀양맥문동, 청양맥문동, 중국산 소엽맥문동은 각각 경동시장(Seoul, Korea)에서 구입하였고, 경희대학교 육창수 교수의 감정 후 실험에 사용 하였으며, 표품은 경희대학교 동서의학대학원(표본 번호 LP 0401, 04-02, 04-03)에 보관하였다.
- 산지별 맥문동 Spicatoside A의 HPLC 분석 - 밀양, 청양, 중국 맥문동 부탄올 건조 추출물을 각각 50 mg^ 칭량하여 메탄올 5 ml에 녹인 후 여과하여 HPLC 분석용 검액으로 사용하였다. Spicatoside A 1 mg을 메탄올 1 ml에 녹인 후 여과하여 HPLC 분석용 표준액으로 사용하였다.
- and Use Guidelines of Kyunghee University, Kore의 규정에 따라 수행하였다. 실험 동물은 ICR 마우스 웅성 7 주령을 중앙 실험동물(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용했다. 모든 동물들은 22±2°C으로 조절된 온도에서 12시간 간격으로 조명을 켠 환경에서 사육하였다.
- 실험재료 및 실험동물 - Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI 1640, fetal bovine serum (FBS), horse seium (HS), penicilline-streptomycin (PS), and NGF 는 Gibco-BRL (Gaitiiersburg, MD, USA)에서 구입하였고, NGF mouse antibody는 Chemicon (Temecula, CA, USA)에서 구입하였다. 기타 시약들은 ACS 급 시약을 사용하였다.
데이터처리
- 통계처리 - 통계처리는 Prism 4.0 (GraphPad Software, Inc. USA) 프로그램을 시용하였고' 모든 데이터는 mean± standard error mean (S.E.M.)으로 나타내었고' 유의성 검정은 Student's t-testS. 수행하였으며 p<0.
이론/모형
- 기타 시약들은 ACS 급 시약을 사용하였다. Spicatoside A는 Kang의 방법”)으로 분리하여 표준품으로 사용하였다.
- 동물모델에서 신경성장인자(NGF) 분비 촉진 검색법 - 마우스의 혈청 중 신경성장인자는 ELISA Kit (R&D system,USA )방법에 의해 측정하였다. 대조군, 밀양, 청양, 중국산 맥문동 부탄올 분획 추출물을 각각 100mg/kg, 1mg/kg 용량으로 웅성 아이씨알 마우스 7주령에 1회 경구투여하고 12시간 후 안정맥에서 혈청을 채취하여 내인성 신경성장인자 양을 측정하였다.
- 모든 동물실 험 과정 은 Principle of Laboratory Animal Care (NIH publication, #85-23, revised 1985)와 Animal Care and Use Guidelines of Kyunghee University, Kore의 규정에 따라 수행하였다. 실험 동물은 ICR 마우스 웅성 7 주령을 중앙 실험동물(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용했다.
성능/효과
- 1. 각 시료중의 스테로이드성 시포닌의 하나인 Spicatoside A 의 함량은 밀양산 맥문동이 청양산 맥문동 보다 2배 많이높았고, 중국산 맥문동의 경우 Spicatoside A 를 함유 하지 않았다.
- 2. PC 12 cell 에서 신경돌기 성장 효과는 밀양산>청양산 > 중국산 맥문동 부탄올 분획 순서대로 그 효과가 높았다.
- 향신 경성 인자는 뇌 유래 신경성장인자(brain-deFived neurotrophic factor, BDNF), 신경성인자(neurotrophin-3, NT-3), NT-4, NF5등이있다.3) 이러한 신경성장인자들은 그 종류에 따라 합성되는곳이나 분화, 발현되는 양상이 다르고 표적장소가 다르다. 향신경성 인자는 신경세포의 사멸을 억제하며 , 향신경성 인자의 결핍은 이들의 단백질 합성(cell death related genes)에의존하는 세포사멸을 발생시킨다.
- 3. NGF neutralization0, ] 의한 맥문동의 신경돌기 성장에 대한 효과는 청양산 맥문동과 밀양산 맥문동 부탄올 분획에서 유의적으로 증가하였다.
- 4. In vivo 동물모델에서 신경성장인자(NGF) 분비 촉진효과는 밀양산>청양산>중국산 순서로 신경성장인자 분비 유도를 증가 시켰다.
- 중국산 맥문동 부탄올 분획 투여군의 경우 NGF 분비량이 대조군과 차이가 없었으며 투여용량에 따른 NGF분비에도 차이가 없음을 보여 주었다. 그리고 맥문동 부탄올 분획을 경구 투여할 때 NGF 분비능은 중국, 청양, 밀양산 맥문동 순서로 승가히-여 Spicatoside A 함량과 용량의존적인 상관성을 보여주었다.
- 동물모델에서 신경성장인자(NGF) 분비 촉진 검색법 - In vh'o 마우스 모델에서 산지별 맥문동 부탄올 분획의 NGF 분비 효과를 확인하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 마우스에서 밀양 맥문동 부탄올 분획 투여군은 대조군에 비하여 100 mg/kg와 1 mg/kg의 투여 용량에서 NGF 분비를 각각 154%와 84% 증가시켰으며 ' 투여 용량에 비례하여 NGF 의 분비도 촉진되는 경향을 보여주었다. 청양 맥문동 부탄올 분획 투여군은 대조군과 비교히여 100 mg/kg와 1 mg/kg 의 투여용량에서 각각 64%와 27% NGF 분비가 증가하였고 투여용량에 비례히는 NGF 분비 효능을 보여 주었다 (Fig.
- 성장효과를 평가하였다. 신경성장인자(NGF)의 신경돌기 성장효과를 100%라고 히였을 때 밀양산 맥문동은 81%의 신경돌기 성장을 나타내 가장 높은 효과를 보였고' 청양산 맥문동은 54%. 중국산 맥문동은 22%의 신경돌기성장촉진 효과를 나타냈다.
- 2). 이 결과는 청양 맥문동(CHE)과 밀양 맥문동(MYL)의 NGF 분비를 촉진시키는 작용이 PC 12 세포의 신경돌기를성장시키는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 Spicatoside A의 함량과 NGF 분비능력은 용량의존적 상관성을 보여주지 못하였다.
- 01 %를 함유히고 있었으며' 중국산 맥문동은 spshinicatoside A가 검출되지 않았다(Table II). 이러한 결과는 shin의 한국산 맥문동과 중국산 맥문동의 사포닌 성분 비교연구에서 중국산 소엽 맥문동(Ophiopogon japotiicus)으I 부탄올 분획 추출물을 HPLC분석 하였을 때 Spicatoside A 가 검출되지 않았다는 결과와 일치함을 보여주었다. 그리고 맥문동의 기원과 산지의 차이는 사포닌 성분에 차이를 나타내므로 맥문동의 여러가지 약리작용에 영향을 줄 것으로 사료된다.
- 마우스에서 밀양 맥문동 부탄올 분획 투여군은 대조군에 비하여 100 mg/kg와 1 mg/kg의 투여 용량에서 NGF 분비를 각각 154%와 84% 증가시켰으며 ' 투여 용량에 비례하여 NGF 의 분비도 촉진되는 경향을 보여주었다. 청양 맥문동 부탄올 분획 투여군은 대조군과 비교히여 100 mg/kg와 1 mg/kg 의 투여용량에서 각각 64%와 27% NGF 분비가 증가하였고 투여용량에 비례히는 NGF 분비 효능을 보여 주었다 (Fig. 3). 중국산 맥문동 부탄올 분획 투여군의 경우 NGF 분비량이 대조군과 차이가 없었으며 투여용량에 따른 NGF분비에도 차이가 없음을 보여 주었다.
- 밀양산 (MYL). 청양산(CHE)' 중국산(CHI) 맥문동 중 spicatosideA의 함량은 0.02% 인 밀양산이 가장 높고 청양산 맥문동은 0.01 %를 함유히고 있었으며' 중국산 맥문동은 spshinicatoside A가 검출되지 않았다(Table II). 이러한 결과는 shin의 한국산 맥문동과 중국산 맥문동의 사포닌 성분 비교연구에서 중국산 소엽 맥문동(Ophiopogon japotiicus)으I 부탄올 분획 추출물을 HPLC분석 하였을 때 Spicatoside A 가 검출되지 않았다는 결과와 일치함을 보여주었다.
후속연구
- 5. 따라서 산지별 맥문동 부탄올 분획의 신경성장인자 분비 효과는 스테로이드성 사포닌의 하나인 Spicatoside A 의함량과 상관성이 있을 것으로 추정되며 명확한 상관성을 확인하기 위해서는 spicatoside A 단일 물질로 연구를 추후 수행함이 필요할 것 이다.
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