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문제 정의
- 이 유적에서 청동기에서 조선시대 이르기까지 여러 시기에 해당하는 다양한 유구가 발견되었으며 이는 아산시의 시대별 인류사와 문화상을 가늠해 볼 수 있는 중요한 문화유적 자료로 평가되고 있다. 본 연구는 제 9지점에서 발굴된 고려 말에서 조선시대 초로 추정되는 분묘 49기 가운데 17기에서 출토된 20개체의 인골을 대상으로 mtDNA 에 대한 고유전학적 분석을 수행함으로써 당시 아산 명암리에 거주하던 옛사람들의 유전적 특징과 친연관계를 규명하고 충청남도 서부 지역 옛 한국인에 대한 유전정보의 기초 자료를 확보하고자 하였다.
제안 방법
- PCR 반응액은 12.5p㏖ forward/reverse primer 4㎕, HotStart Taq polymerase 5unit, 2.5mM dNTP 3㎕, 10× buffer 5㎕, 1㎍/㎕ BSA 5㎕를 첨가한 후 최종 50㎕에 맞추어 제조하였다.
- 5mM dNTP 3㎕, 10× buffer 5㎕, 1㎍/㎕ BSA 5㎕를 첨가한 후 최종 50㎕에 맞추어 제조하였다. PCR 반응액을 증폭하기 위하여 95℃에서 predenaturation 15분 후, 95℃에서 denaturation 30초, 58℃에서 annealing 30초, 72℃에서 extension 30초를 40회 반복하고, 72℃에서 10분간 final extension의 조건으로 ABI veriti(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 PCR 반응을 실시하였다. 증폭된 DNA 산물은 전기영동장치 HDA-GT12(eGene, USA)를 이용하여 추출 여부를 확인한 후, PCR purification kit(Qiagen, Germany)를 이용 하여 정제하고 염기서열 자동 분석 장치인 ABI PRISM 3100(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 염기서열이 결정되었다.
- mtDNA HVR의 변이형을 결정하기 위하여 HVR을 모두 9 절편으로 나누어 증폭산물마다 양 말단이 인접 증폭 산물과 겹치도록 하였으며, 오랜 기간 동안 손상되었을 DNA의 특성을 고려하여 180bp 미만의 산물로 증폭되도록 primer를 고안 하였다(Figure 4). 출토 인골 20개체를 대상으로 각각 2회에 걸친 DNA의 추출과 PCR을 수행한 결과, 17개체에서 HVR 전체 부위가 완벽하게 증폭되었고 AM-09-02, AM-09-24, AM-09-37L 등 3개체는 HVR2의 H2-3 부분이 부분적으로 증폭되지 않았다(Figure 5).
- 모든 실험과정에 음성대조군을 설정하여 외부 DNA에 의한 오염여부를 확인하였다. 또한 본 연구와 관련된 실험자뿐만 아니라 실험실의 모든 출입인원에 대한 mtDNA를 분석하여 비교함으로써 실험자의 부주의 및 외부인에 의한 오염여부를 검증 하였다.13
- 분석 결과의 재현성 확인 및 검증을 위하여 동일한 시료에 대하여 1개월 간격으로 동일한 방법을 2차에 걸쳐서 실시하였다. 모든 실험과정에 음성대조군을 설정하여 외부 DNA에 의한 오염여부를 확인하였다. 또한 본 연구와 관련된 실험자뿐만 아니라 실험실의 모든 출입인원에 대한 mtDNA를 분석하여 비교함으로써 실험자의 부주의 및 외부인에 의한 오염여부를 검증 하였다.
- 본 연구에서는 기존의 출토 인골의 DNA 추출법으로 널리 사용되어 오던 페놀추출법을 이용하지 않고 실리카를 이용한 추출법을 적용하였다. 이 추출법은 DNA의 추출 과정을 간소화하고 오염 가능성을 최소화할 수 있을 뿐만 아니라 시료의 양에 따라 신축적으로 시약을 처리할 수 있기 때문에 페놀을 이용한 DNA 추출법보다 효율적이다.
- 출토 인골 시료의 전처리 및 DNA 추출의 전 과정과 PCR 반응액 조성 등의 모든 과정은 오염방지를 위하여 무균작업대에서 실행하였으며, 실험에 필요한 모든 시약과 삼차 증류수 및 용기는 고온 또는 자외선 조사에 의해 멸균하여 사용하였다. 분석 결과의 재현성 확인 및 검증을 위하여 동일한 시료에 대하여 1개월 간격으로 동일한 방법을 2차에 걸쳐서 실시하였다. 모든 실험과정에 음성대조군을 설정하여 외부 DNA에 의한 오염여부를 확인하였다.
- 이를 다시 5-6 조각으로 절단 한 후, 6%차아염소산나트륨을 시료가 잠길 정도로 분주하여 상온에서 15분간 교반한 다음, 멸균 증류수로 2-3회 세척하였다. 세척한 시료를 무균상자 안에서 5시간 이상 자연 건조 시켜 시료의 수분을 완전히 제거한 후, 시료의 각 표면에 자외선을 40분간 조사하여 표면 오염원을 제거하였다. 오염물이 제거된 인골 시료는 분말제조기 MM 301(Retsch, Germany)로 30초 동안 분쇄하여 분말 제조한 후, DNA 추출 전까지 -20℃에서 보관하였다.
- 청동기시대에서 조선시대에 이르는 주거지 및 수혈유구가 발굴되었으며, 고려말에서 조선시대 초에 조성된 것으로 추정되는 분묘 49기가 발굴 되었다. 이 가운데 합장을 포함한 회곽묘 18기에서 21개체의 인골이 출토되었으며, 보존상태가 양호한 20개체의 인골을 대상으로 mtDNA 분석을 수행하였다(Table 1). 발굴된 인골은 별도의 전처리 및 수세과정 없이 멸균된 시료봉투에서 실험직전까지 30-40%의 습도와 상온 상태를 유지하면서 보관되었다.
- PCR 반응액을 증폭하기 위하여 95℃에서 predenaturation 15분 후, 95℃에서 denaturation 30초, 58℃에서 annealing 30초, 72℃에서 extension 30초를 40회 반복하고, 72℃에서 10분간 final extension의 조건으로 ABI veriti(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 PCR 반응을 실시하였다. 증폭된 DNA 산물은 전기영동장치 HDA-GT12(eGene, USA)를 이용하여 추출 여부를 확인한 후, PCR purification kit(Qiagen, Germany)를 이용 하여 정제하고 염기서열 자동 분석 장치인 ABI PRISM 3100(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 염기서열이 결정되었다. HVR의 9개 부분에 대한 contig assay는 Vector NTI version 8.
- 추출된 mtDNA를 주형으로 과변이부위(HVR1, HVR2, HVR3)를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭하였다. PCR에 사용된 primer 는 Table 2에서와 같이 9쌍의 primer를 사용하였으며, 중합효소로는 HotStart Taq(Qiagen, Germany)를 사용 하였다.
- 출토 인골 시료의 전처리 및 DNA 추출의 전 과정과 PCR 반응액 조성 등의 모든 과정은 오염방지를 위하여 무균작업대에서 실행하였으며, 실험에 필요한 모든 시약과 삼차 증류수 및 용기는 고온 또는 자외선 조사에 의해 멸균하여 사용하였다. 분석 결과의 재현성 확인 및 검증을 위하여 동일한 시료에 대하여 1개월 간격으로 동일한 방법을 2차에 걸쳐서 실시하였다.
대상 데이터
- com/)를 통해 mtDNA 표준염기서열(Cambridge Reference Sequence, CRS)과 비교 분석되었다.12 Haplogroup의 결정은 mtDNAmanager(http://mtmanager.yonsei.ac.kr)가 이용되었다.
- 아산 명암리 출토 인골에서 확인된 각각의 변이가 현대 한국인 집단과 세계 지역 집단에서 출현하는 빈도를 Figure 6와 같이 분석하였다. African(1388), West Eurasian(2857), East Asian(1557), Admixed(1288) 등 7090개의 mtDNA 조절 부위의 염기서열에 대한 데이터베이스를 근간으로 East Asian Data에 포함되어 있는 한국인 593명을 별도로 추출하여 분석하였다. 아산 명암리 출토 인골에서 나타난 변이는 모두 56개로 다양 하게 나타났으며, HVR2의 489, 523d, 524d가 동아시아인보다 약간 높게 나타난 것을 제외하고 대부분의 변이가 동아시아인과 현대 한국인에서 거의 비슷한 빈도로 나타나는 것을 확인하였다.
- Figure 5. Capillary gel electrophoresis analysis for segmental amplicons of mtDNA HVR1 (H1-1, H1-2, H1-3, H1-4), HVR2 (H2-1, H2-2, H2-3, H2-4) and HVR3 (H3-1) by PCR from 20 individuals. The H1-1 amplicons of AM-09-25 and AM-09-28L were amplified by Hs1-3F and Hs1-3R primers (Table 2).
- 본 연구는 2008년도 국립문화재연구소 박사후 연수과정 지원사업에 의해 이루어졌다.
- 충청남도 아산시 탕정면 명암리 아산 테크노콤플렉스 지방산업단지 조성 부지는 충남대학교박물관(5, 9지점), 충청매장문화재연구원(현 충청문화재연구원)(3-1, 2, 11지점), 충남대학교백제연구소(6지점)에 의하여 2000년에서 2001년까지 발굴 조사 되었다(Figure 1). 이 유적에서 청동기에서 조선시대 이르기까지 여러 시기에 해당하는 다양한 유구가 발견되었으며 이는 아산시의 시대별 인류사와 문화상을 가늠해 볼 수 있는 중요한 문화유적 자료로 평가되고 있다.
데이터처리
- 증폭된 DNA 산물은 전기영동장치 HDA-GT12(eGene, USA)를 이용하여 추출 여부를 확인한 후, PCR purification kit(Qiagen, Germany)를 이용 하여 정제하고 염기서열 자동 분석 장치인 ABI PRISM 3100(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 염기서열이 결정되었다. HVR의 9개 부분에 대한 contig assay는 Vector NTI version 8.0(Informax, USA)으로 수행하였으며, mtDNA의 haplotype 간 네트워크 모델은 NETWORK version 4.502(http://www.fluxus-technology.com/)를 통해 mtDNA 표준염기서열(Cambridge Reference Sequence, CRS)과 비교 분석되었다.12 Haplogroup의 결정은 mtDNAmanager(http://mtmanager.
이론/모형
- 인골 시료의 mtDNA를 추출하기 위해 실리카 추출법을 사용하였다.11 분말 상태의 인골 시료를 0.
성능/효과
- 1C는 코카시아인에서 높은 빈도를 보이는 haplogroup K에서만 나타난다. 반복된 추출과 실험에서 연구자에 의한 오염, 시료 간 교차 오염의 가능성을 검증하였으며 모두 동일한 결과를 확보였다. Haplogroup K와 HVR2의 114 변이는 현대 한국인과 동아시아 집단에서 거의 출현 하지 않는다.
- 이 가운데 합장을 포함한 회곽묘 18기에서 21개체의 인골이 출토되었으며, 보존상태가 양호한 20개체의 인골을 대상으로 mtDNA 분석을 수행하였다(Table 1). 발굴된 인골은 별도의 전처리 및 수세과정 없이 멸균된 시료봉투에서 실험직전까지 30-40%의 습도와 상온 상태를 유지하면서 보관되었다.
- African(1388), West Eurasian(2857), East Asian(1557), Admixed(1288) 등 7090개의 mtDNA 조절 부위의 염기서열에 대한 데이터베이스를 근간으로 East Asian Data에 포함되어 있는 한국인 593명을 별도로 추출하여 분석하였다. 아산 명암리 출토 인골에서 나타난 변이는 모두 56개로 다양 하게 나타났으며, HVR2의 489, 523d, 524d가 동아시아인보다 약간 높게 나타난 것을 제외하고 대부분의 변이가 동아시아인과 현대 한국인에서 거의 비슷한 빈도로 나타나는 것을 확인하였다.
- 아산 명암리 출토 인골에서 동정된 haplogroup은 대체로 동아시아인 집단에서 자주 출현하는 haplogroup과 일치했으며, 다양성이 높은 것으로 분석되었다. 일반적으로 D, B, G haplogroup은 아시아인에게서 높은 빈도로 나타나는데, 최근의 한국인에 대한 연구에서 D, B, G haplogroup이 각각 32.
- mtDNA HVR의 변이형을 결정하기 위하여 HVR을 모두 9 절편으로 나누어 증폭산물마다 양 말단이 인접 증폭 산물과 겹치도록 하였으며, 오랜 기간 동안 손상되었을 DNA의 특성을 고려하여 180bp 미만의 산물로 증폭되도록 primer를 고안 하였다(Figure 4). 출토 인골 20개체를 대상으로 각각 2회에 걸친 DNA의 추출과 PCR을 수행한 결과, 17개체에서 HVR 전체 부위가 완벽하게 증폭되었고 AM-09-02, AM-09-24, AM-09-37L 등 3개체는 HVR2의 H2-3 부분이 부분적으로 증폭되지 않았다(Figure 5).
후속연구
- 또한 AM-09-29와 AM-09-32가 동일 세대가 아니라면 모계 혈연관계가 성립할 수도 있다. 그러나 수세대 차이가 나도 이론적으로 동일한 haplotype을 공유할 수 있기 때문에 피장자들의 정확한 혈연관계 규명을 위하여 부가적인 친연관계 분석(kinship analysis) 등의 추가 실험이 요구된다. AM-09-28, AM-09-37, AM-09-38, AM-09-49는 부부합장묘로서 전통적인 매장방식에 의하면 피장자를 기준으로 왼편이 여성, 오른편이 남성인 것으로 볼 수 있다.
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