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문제 정의
- 따라서. 동통 치료의 효과가 뛰어난 한약재를 중심으로 염증과 통증에 관련된 생체 유전자의 발현 조절 효과가 있는지를 검증할 수 있는 in vitro 분석 시스템을 개발한다면 뛰어난 치료 효과를 갖는 한약재의 광범위한 스크리닝이 가능하기 때문에 그 약리적 우수성을 과학적. 객관적으로 제시할 수 있으며 다양한 한약재로부터 류마티스 관절염과 같은 염증성 만성질환의 치료를 위한 최첨단 신약을 발굴할 수 있는 1차 스크리닝용 기반 기술을 확보할 수 있다고 사료된다.
- system을 제각하고. 이를 통해 #의 소염, 진통작용에 대하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이에 저자는 류마티스 관절염 등과같은 급, 만성 염증성 질환 치료에 사용될 효과적인 한약재의 개발을 위해, #을 비롯한 #,#,#에 대한 TNF-q와 COX-2 유전자의 mRNA 전사 효율을 측정할 수 있는 in vitro assay system을 제각하고. 이를 통해 #의 소염, 진통작용에 대하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
가설 설정
- RT—PCR Analyses of TNF-a and COX-2 in U—937 cells. Non-treated group (Cont), lane 1; LPS-treated group (LPS), lane 2; PMA-treated group (PMA), lane 3; PMA and LPS-treated group (PMA/LPS), lane 4. Each PGR product was normalized to GAPDH. The observed bands were correlated with the predicted size for GAPDH (579bp), TNF-a (344bp), COX-2 (341 bp).
제안 방법
- 5 mg/m의 농도로 丹蔘을 처리하였다. 24시간 후 PBS에 5mg/m로 녹여 진 MTT가 well당 10ul 씩 첨가되었고, 37C, 5% CO2 incubator에서 1시간 더 배양되어 MTT가 환원되도록 하였다. 배양종료 시 plate는 450g으로 5분간 워심 분리 후 상층액이 제거되었고 100U의 0.
- 2eg의 total RNA를 65'C에서 15분 동안 denaturation 시킨 후, 200U moloney murine leukemia virus reverse transcriptase(GIBCO BRL, MD, USA) 을 이용하여 최종 부피가 20μ1인 빈-응 혼합액에서 역전사 반응을 수행하여 cDNA mixture를 얻었다. cDNA는 10mM Tris-HCl(pH8.
- After cells were differentiated with 100nM PMA for 24 hours, cells were exposed to 0, 0.5, 0.1, 0.01 mg/ml SM for 24 hours. Data were presented as mean ±SEM.
- TNF-a와 COX-2 promoter는 제한효소 site인 Kpn I과 Hind Hl를 포함하여 디자인한 각각의 primer와 human chromosomal DNA를 template 로 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 각각의 PCR product들은 pGL3-basic vector(Promega Co.
- U-937 세포는 96 well plate에 1 x 104 cells/ well 씩 split 되 었고, 24시간 후 각각 0, 0.01, 0.1, 0.5 mg/m의 농도로 丹蔘을 처리하였다. 24시간 후 PBS에 5mg/m로 녹여 진 MTT가 well당 10ul 씩 첨가되었고, 37C, 5% CO2 incubator에서 1시간 더 배양되어 MTT가 환원되도록 하였다.
- 역전사 반응을 수행하여 cDNA mixture를 얻었다. cDNA는 10mM Tris-HCl(pH8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCh, 0.2mM dNTP, 0.4mM의 각 primer와 0.5U Taq polymerase(TaKaRa, Shiga, Japan)을 포함한 20μ1의 반응 혼합액 에서 PTC-100 Programmable Thermal Controller(MJ Research, Waltham, MA, USA)를 사용하여 증폭되었으며, 각각의 prime는 Genbank에 기록된 염 기 서 열을 토내로 적당한 부위를 선택하여 제작하였다(Table 1). 증폭된 DNA는 1.
- 0% agarose gel에서 전기 영동 하여 확인하였다. gel 상의 band intensity는 ImageMaster TotalLab(Amersham Biosceinces, Piscataway, NJ, USA)을 이용하여 분석하였고 내부 표준물질로 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 사용하여 유전자의 정량적 발현 수준을 보정하였다.
- 24시간 후 각 well에는 일정 양의 丹蔘, 桃仁, 黄氏, '牛.膝, PD98059, berberine chloride 또는 간은 양의 PBS가 첨가되었고, 2시간 후, 각 well 마다 5μg/ml의 LPS를 첨가하여 염증 반응을 유발 하였다. 염증 반응 유발 24시간 후 각 lysate 를 얻었고 Luciferase activie는 Luciferase Reporter Assay SystemTM(Promega Co.
- 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 각각의 PCR product들은 pGL3-basic vector(Promega Co., Madison, WI) 에 subcloning중] 여 TNF-a와 COX-2 promoter에 의해 lucif&ase의 발현이 조절될 수 있도록 제작하였다(Fig. 1).
- 그러나, 이와는 별도로 PMA 자체가 TNF-a promoter의 강력한 유도신호로도 작용한다는 연구 결과와, 세포의 분화가 이루어지지 않은 상태에서 LPS 만으로도 TNF-a promoter가 유도된다는 연구 결과 등도 보고된 바 있으며 두 물질에 대한 염증 유발 기전이 다소 상이한 것으로 알려져 있다14-15). 따라서 본 연구에서는 PMA의 단독처리에 의한 분화 및 유전자 유도를 동시에 조성한 경우와 PMA로 분화시킨 후, LPS로 유도시킨경우의 두 가지 방법으로 접근하였다.
- 본 연구에서는 PMA의 단독 처리에 의한 분화 및 유전자 유도를 동시에 조성한 경우와 PMA로 분화시킨 후, LPS로 유도시킨 경우의 두 가지 방법으로 접근하였다. 실험에 앞서, 본 실험에 사용될 U-937 세포의 자체 TNF-a와 COX-2의 두 유전자가 Pml와 LPS에 의해 각각 어떤 양상으로 유도되는가를 확인히-기 위해 RT-PCR 분석법을 통한 검증 실험을 실시하였다.
- 본 연구의 표적 유전자로는 inflammation의 유발에 관여하는 생체 신호 전달 물질인 TNF-a와체일 및 통증 유발의 매개체인 prostagladin(PG) 합성에 관여하는 COX-2를 신정하였고 이 두 유전자의 transcription activity를 정량적으로 측정하기 위하여 실험적 분석이 용이한 luciferase 유전자를 각 promoter의 말단에 연결하고, 이를 U-937 세포에 주입하여 최종 분석 시스템을 구축하였다.
- 실험에 사용된 한약재들은 丹蔘(Sal.,ia miltiorrhiza, SM), 桃仁(Prunus persica, PP), aj:ii:(Astragalus membranaceus, AM), '-^(Achyranthes bidentata, AB) 등의 열탕 추출물들이 사용되었으며, PMA 또는 LPS에 의해 활성화되는 TNF-a와 COX-2 promoter들이 각각의 약재들에 의해 얼마나 억제되는지의 효과를 측정하였다. 실험에 사용된 약재들은 한의학을 기초로 하여 관절염과 염증, 통증 치료에 효과가 있다고 알려져 있는 한약재들을 중심으로 선정히였고, positive contr이로는 PD98059 (TNF-a의 전사 억제인자)와 berberine chloride (COX-2의 전사 억제인자, 黄浊 또는 英柏의 주요약리 성분)가 사용되었다.
- 접근하였다. 실험에 앞서, 본 실험에 사용될 U-937 세포의 자체 TNF-a와 COX-2의 두 유전자가 Pml와 LPS에 의해 각각 어떤 양상으로 유도되는가를 확인히-기 위해 RT-PCR 분석법을 통한 검증 실험을 실시하였다.
- 膝, PD98059, berberine chloride 또는 간은 양의 PBS가 첨가되었고, 2시간 후, 각 well 마다 5μg/ml의 LPS를 첨가하여 염증 반응을 유발 하였다. 염증 반응 유발 24시간 후 각 lysate 를 얻었고 Luciferase activie는 Luciferase Reporter Assay SystemTM(Promega Co., Madison, WI) kit 를 사용하여 측정하였다. data의 normalizatione 동일한 lysate로 P-galactosidase assay를 통해 이루어졌다 (Fig.
- 일반적으로 U-937 세포에서 TNF-a 와 COX-2 mRNA는 PMA 등에 의해 분화되지 않은 상태에서 LPS에 의해서만은 발현되지 않는다는 실험 결과가 보고되어 있다12-13). 이와 간은 기존의 연구들을 바탕으로 본 실험에서는 U-937 세포의 분화에는 PNe를, TNF-a와 COX-2 promote의 inducer 로는 LPS를 사용하여 염증 모델을 제작하기로 하였다. 그러나, 이와는 별도로 PMA 자체가 TNF-a promoter의 강력한 유도신호로도 작용한다는 연구 결과와, 세포의 분화가 이루어지지 않은 상태에서 LPS 만으로도 TNF-a promoter가 유도된다는 연구 결과 등도 보고된 바 있으며 두 물질에 대한 염증 유발 기전이 다소 상이한 것으로 알려져 있다14-15).
- 제작된 luciferase reporter vector는 U-937 세포에 주입되어 형질전환시키는데 사용되는데 이때 transient transfection 빙법을 시용하였으며 Effectene™ (Qiagen Co., Valencia, CA) kit를 이용하여 제조된 reporter vector 2ug고] transfection control vector로서 pSV B-gal vector(Promega Co., Madison, WI) lug을 섞은 후, 5 x 106개의 u-937 세포에 co-transfection하여 이루어졌다. PMA-induced 염증 모델의 경우, transfection된 세포들은 24시간 후 PBS로 세척되었고 丹囈, 桃仁, .
대상 데이터
- 사용하였다. 丹蔘(Sal.,ia miltiorrhiza, SM), 桃仁(Prunus persica Batsch, PP), vnet:(Astragalus membranaceus, AM), ^^(Achyranthes bidentata, AB) 등의 약재는 동국내 학교 한방병원에서 구입하여 정해진 protocol 에 따라 열탕 추출하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 세포주는 human leukemia monocyte의 일종인 U-937 세포로서 서울내학교의과내학 부설, (사)한국 세포주 은행으로부터 구입하였으며 세포배양은 RPMI1640 최소배지(Gibco, Ltd, UK) 에 10%(v/v) fetal bovine serum, penicillin 100 units/ml, streptomycin 100pg/ml 등을 첨가하여 만든 배지를 이용하여 37C의 5% CO2를 유지하는 배양기에서 수행하였다.
- 세포 실험에 사용한 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate), LPS(lipopolysaccharide from Escheichia coli), PD98059, berberine chloride 등의 시약은 Sigma(St Louis, MO, USA) 제품을 구입하였고, pGL3-basic vector는 Promega제품을 사용하였다. 丹蔘(Sal.
- ,ia miltiorrhiza, SM), 桃仁(Prunus persica, PP), aj:ii:(Astragalus membranaceus, AM), '-^(Achyranthes bidentata, AB) 등의 열탕 추출물들이 사용되었으며, PMA 또는 LPS에 의해 활성화되는 TNF-a와 COX-2 promoter들이 각각의 약재들에 의해 얼마나 억제되는지의 효과를 측정하였다. 실험에 사용된 약재들은 한의학을 기초로 하여 관절염과 염증, 통증 치료에 효과가 있다고 알려져 있는 한약재들을 중심으로 선정히였고, positive contr이로는 PD98059 (TNF-a의 전사 억제인자)와 berberine chloride (COX-2의 전사 억제인자, 黄浊 또는 英柏의 주요약리 성분)가 사용되었다.
이론/모형
- Transcriptional activities of TNF-a and COX-2 promoter in U-937 cells were assessed by measuring luciferase activities. Data were normalized by 8-galactosidase assay. PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate; SM, Sal.
- U-937 세포에 내한 丹蔘의 독성 여부는 세포 활성 측정법인 MTT assay를 이용하여 수행하였다. U-937 세포는 96 well plate에 1 x 104 cells/ well 씩 split 되 었고, 24시간 후 각각 0, 0.
- U-937 세포에서의 TNF-q와 COX-2 promoter 의 활성 억제 효과를 보인 丹蔘이 세포에 어느 정도의 독성을 가지고 있는지 MTT assay ::- 이용하여 측정하였다.
- , Madison, WI) kit 를 사용하여 측정하였다. data의 normalizatione 동일한 lysate로 P-galactosidase assay를 통해 이루어졌다 (Fig. 2).
- 제조된 각각의 vector로 transient transfection된 U-937 세포에서의 TNF-a와 COX-2 promoter의 활성은 luciferase assay를 통해 측정되었다. 실험에 사용된 한약재들은 丹蔘(Sal.
성능/효과
- 1. U-937 세포의 TNF-q와 COX-2 mRNA는 평소에는 발현되지 않다가 PMA를 치리하여 분화시켰을 때 발현되었고, 분화된 세포에 LPS를 처리했을 경우 그 발현양은 두 배가량 증가됨을 RT-PCR 분석법을 통해 확인하였다.
- 2. 내조구과 비교할 때 丹囈은 in vitro assay system에서 TNF-q와 COX-2 mRNA 발현 정도를 유의성 있게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
- Luciferase reporter assay를 이용하여 丹慈(Sa/via miltiorrhiza, SM), 桃仁(Prunus persica, PP), 黄氏 (Astragalus membranaceus, AM), 膝(Achyranthes bidentata, AB)의 염증억제 효과를 분석한 결고], 丹蔘의 경우 PMA에 의해 증가된 두 유전자의 promoter활성을 약 50%정도 저해하는 강력한 소염, 진통 작용을 보였다. 그러나, 비교 천연 약물로 사용된 桃仁, 英氏, 牛膝 등의 추출물들은 두유 전자 모두의 promoter 활성에 거의 영향을 주지 읺-는 것으로 나타났다.
- MTT assay를 이용하여 丹蔘의 세포 독성 측정한 실험에서는 U-937 세포에 丹囈을 각각 0.01, 0.1, 0.5 mg/ml 의 농도로 24시간 처리하였으나, 세포의 생존율이 丹蔘을 처리하지 않은 군에 비해 크 게, 감소하지 않은 것으로 나타났다. 이 니던- 결과를 통해 丹蔘 추출물이 세포의 성장을 유의성 있게 저해하거나 촉진시키지 않는 것으로 사료된다.
- Pml에 의한 단독 효과로 U-937 세포의 분화와 염증 반응을 동시에 일으킨 경우, U-937 세포의 분화되지 않은 정상 세포는 luciferase 활성이 거의 감지되지 않았으나 PMA 처리 세포의 경우, 약 10 배 수준의 luciferase 활성 증가를 확인하였다.
- 이 -, PMA에 의해 분화된 세포에서도 같은 결과를 보였다. 결론적으로 丹蔘 추출물은 세포의 성장을 유의성 있게 저해허시니 족진시키지 않는 것으로 확인되었다(Table 5, Fig. 6).
- 진통 작용을 보였다. 그러나, 비교 천연 약물로 사용된 桃仁, 英氏, 牛膝 등의 추출물들은 두유 전자 모두의 promoter 활성에 거의 영향을 주지 읺-는 것으로 나타났다. 또한, PMA와 LPS를 연속적으로 처리하여 분화와 염증반응을 단계적으로 유도한 실험의 경우에서도 丹蔘의 소염, 진통 효과는 PD98059와 berberine chloride의 효과에 비해 상당히 우수한 것으로 확인되었다.
- 또한, PMA 또는 LPS에 의해 활성화되는 TNF -a와 COX-2 promoter들에 내한 억제효과를 측정한 결과, #을 제외한 나머지 안약재들에서는 PM와 LPS에 의해 유발된 TNF-q와 COX-2 promoter의 활성을 억제하지 못하거나 오히려 증가시키는 것을 볼 수 있었지만, 丹囈을 처리한 군에서는 그 활성이 현저히 감소한 것으로 나타났다. 이상의 결과와 같이 본 연구에서 류마티스 관절염 치료에 사용될 효과적인 한약재의 발굴을 위해 제작한, 한약재의 유무에 따른 TNF-q와 COX-2 mRNA의 전사율을 측정할 수 있는 assay systeme 앞으로 염증 관련 질병 치료제 발굴에 있어서 유용하게 사용이 가능할 것으로 예상되며.
- 그러나, 비교 천연 약물로 사용된 桃仁, 英氏, 牛膝 등의 추출물들은 두유 전자 모두의 promoter 활성에 거의 영향을 주지 읺-는 것으로 나타났다. 또한, PMA와 LPS를 연속적으로 처리하여 분화와 염증반응을 단계적으로 유도한 실험의 경우에서도 丹蔘의 소염, 진통 효과는 PD98059와 berberine chloride의 효과에 비해 상당히 우수한 것으로 확인되었다. 그러나 丹蔘의 농도에 따른 소염, 진통효과의 비교 및 3종류의 한약재와의 비교에 의한 결과라는 제한점이 있었다.
- 본 실험의 positive contr이로 시용한 PD98059 화합물의 경우 TNF-a의 promoter 활성(luciferase 의 역가로 표현됨)을 약 50% 저해하는 inhibition 효과를 발휘하였으나 항암, 소염 작용이 있다고 알려진 천연 추출물인 berberine chloride의 경우에는 COX-2 promoter의 활성을 약 10% 정도 inhibition하는데 그쳤다. 하지만 본 실험을 통해 발굴된 丹蔘의 경우 증류 추출된 천연물임에도 불구하고 PeA에 의해 증가된 두 유전자의 promoter 활성을 약 50%정도 저해하는 강력한 소염, 진통작용을 보였다.
- 실험에 앞서, 본 실험에 사용될 U-937 세포의 자체 TNF-a와 COX-2의 두 유전자가 Pml와 LPS 에 의해 각각 어떤 양상으로 유도되는가를 확인 위해 RT-PCR 분석법을 통한 검증 실험을 실시한결고I, U-937 세포에서의 전체적인 TNF-a 와 COX-2 mRNA 발현 양상은 유사하였다. 내 조군과 LPS만 처리한 세포의 경우 각 mRNA의 발현은 거의 불 수 없었고, PMA만 처리한 세포에서는 약 40%, PMA로 분화시킨 후 LPS로 자극을 주었을 경우 약 75%의 TNF-a와 COX-2 mRNA가 각각 발현되었다.
- 내 조군과 LPS만 처리한 세포의 경우 각 mRNA의 발현은 거의 불 수 없었고, PMA만 처리한 세포에서는 약 40%, Pml로 분화시킨 후 LPS로 자극을 주었을 경우 약 75%의 TNF-a와 COX-2 mRNA가 각각 발현되었다. 이 결과를 분석해 불 때 U-937 세포는 Pml에 의해 염증 반응이 유발되고, PMA로 분화한 이후에도 LPS로 지-극을 주었을 때 추가적 인 염증 반응이 유발되는 것을 알 수 있었다(Table 2, Fig. 3).
- 내 조군과 LPS만 처리한 세포의 경우 각 mRNA의 발현은 거의 불 수 없었고, PMA만 처리한 세포에서는 약 40%, PMA로 분화시킨 후 LPS로 자극을 주었을 경우 약 75%의 TNF-a와 COX-2 mRNA가 각각 발현되었다. 이 결과를 분석해 불 때 U-937 세포는 Pml에 의해 염증 반응이 유발되고, PMA로 분화한 이후에도 LPS로 지-극을 주었을 때 추가적 인 염증 반응이 유발되는 것을 알 수 있었다.
- 그쳤다. 하지만 본 실험을 통해 발굴된 丹蔘의 경우 증류 추출된 천연물임에도 불구하고 PeA에 의해 증가된 두 유전자의 promoter 활성을 약 50%정도 저해하는 강력한 소염, 진통작용을 보였다. 비교 천연 약물로 사용된 桃仁, 英氏, 牛.
후속연구
- 동통 치료의 효과가 뛰어난 한약재를 중심으로 염증과 통증에 관련된 생체 유전자의 발현 조절 효과가 있는지를 검증할 수 있는 in vitro 분석 시스템을 개발한다면 뛰어난 치료 효과를 갖는 한약재의 광범위한 스크리닝이 가능하기 때문에 그 약리적 우수성을 과학적. 객관적으로 제시할 수 있으며 다양한 한약재로부터 류마티스 관절염과 같은 염증성 만성질환의 치료를 위한 최첨단 신약을 발굴할 수 있는 1차 스크리닝용 기반 기술을 확보할 수 있다고 사료된다.
- 이상의 결과와 같이 丹蔘이 in vitro 상에서 염증 및 통증 반응을 억제하는 것이 관찰됨에 따라류마티스 관절염과 같은 염증성 만성질환 치료제로서의 가능성이 제시되었으며, 세포독성도 매우 적어 추출물 자체 혹은 약침용 제제로의 사용할 수 있을 것이다. 한편 본 연구에 사용된 screening systeme 기타 염증 관련 질병 치료제 발굴에 있어서 1차 스크리닝 방법으로 유용하게 사용될 수 있다고 사료된다.
- 다. 이상의 결과와 같이 본 연구에서 류마티스 관절염 치료에 사용될 효과적인 한약재의 발굴을 위해 제작한, 한약재의 유무에 따른 TNF-q와 COX-2 mRNA의 전사율을 측정할 수 있는 assay systeme 앞으로 염증 관련 질병 치료제 발굴에 있어서 유용하게 사용이 가능할 것으로 예상되며. 이 system을 적용하여 발굴한 #은 in vitro 상에서 염증 반응을 억제하는 약리작용이 유의성 있게 관찰됨에 따라, 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환 치료에 응용 가능하리라 생각되며.
- 이 system을 적용하여 발굴한 #은 in vitro 상에서 염증 반응을 억제하는 약리작용이 유의성 있게 관찰됨에 따라, 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환 치료에 응용 가능하리라 생각되며. 이침액 등으로의 개발을 위해서는 앞으로 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 있을 것이다. 한편 본 연구에 사용된 screening systeme 기타 염증 관련 질병 치료제 발굴에 있어서 1차 스크리닝 방법으로 유용하게 사용될 수 있다고 사료된다.
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