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문제 정의
- 본 연구에서는, 이미 확보한 자생 및 약용식물 추출물 900 여 종[9, 11, 20-2이을 대상으로 보리 및 토마토 등에서 횐가루병을 유발하는 #, 의 항진균 활성을 평가하였으며, 포자 발아억제활성 및 균사 성장억제활성 평가를 통해 산초, 당귀, 미국가막사리 및 백선피 추출물에서 우수한 항진균 활성을 확인하였다. 특히 산초의 경우 원재료의 대량확보가 용이하며, 식물체에 대한 약해가 거의 없으며, 부가적인 항세균 활성을 확인하여 실제적 이용가능성이 높은 것으로 판단되었다.
- 특히 산초의 경우 원재료의 대량확보가 용이하며, 식물체에 대한 약해가 거의 없으며, 부가적인 항세균 활성을 확인하여 실제적 이용가능성이 높은 것으로 판단되었다. 이러한 연구는 천연물 추출물의 개발을 통해, 농약 보완 및 대치 등을 통한 친환경 농작물 재배 및 과채류의 유통, 저장상의 안전성 향상이 가능함을 제시하고 있다.
- 의해 발병한다. 본 연구에서는 천연물 추출물을 이용한 식물병원성 곰팡이 제어가능성을 검토하기 위해, 보리 횐가루병에서 분리 된 Fusarium graminearum-i 대상으로 900 여종의 천연물 추출물의 항진균 활성을 평가하였다. 먼저 포자 발아 억제 활성평가 결과 산초' 당귀, 미국가막사리, 까마중, 오수유, 윤판나물' 미치광이풀' 떄죽나무, 백선, 방기, 정향, 멍석딸기, 호장근, 천황련, 작약, 대황, 모란, 달맞이꽃, 대극, 개박하 추출물을 1차 선별하였으며, 균사 생육억제 활성 원재료 확보 용이성 및 실제 적용 가능성 등을 고려하여 산초추출물을 최종 선정하였다.
제안 방법
- 본 연구에서는 천연물 추출물을 이용한 식물병원성 곰팡이 제어가능성을 검토하기 위해, 보리 횐가루병에서 분리 된 Fusarium graminearum-i 대상으로 900 여종의 천연물 추출물의 항진균 활성을 평가하였다. 먼저 포자 발아 억제 활성평가 결과 산초' 당귀, 미국가막사리, 까마중, 오수유, 윤판나물' 미치광이풀' 떄죽나무, 백선, 방기, 정향, 멍석딸기, 호장근, 천황련, 작약, 대황, 모란, 달맞이꽃, 대극, 개박하 추출물을 1차 선별하였으며, 균사 생육억제 활성 원재료 확보 용이성 및 실제 적용 가능성 등을 고려하여 산초추출물을 최종 선정하였다. 산초 추출물 조제 시 methanol 추출이 효율적이며, 순차적 유기용매 분획물의 경우 물 잔류물에서 항진균 활성이 나타났다.
- 11, 20-23]. 이미 보고한 바와 같이, 수집된 천연물들은 대한식물도감에서 검증하여 그늘에서 일주일간 건조 후 잘게 썰어 추출에 사용하였으며, 식물체 건조무게에 대해 10배 중량의 메탄올을 가하여 추출하고, 추출액을 여과, 감압 농축하여 메탄올 추출물을 제조하였다. 조제된 천연물 추출물은 사용 전까지 4℃ 냉장고에서 밀봉 보관하였으며, 필요에 따라 dimethylsulfoxide에 녹여 적당한 농도로 조정하여 사용하였다.
- 천연물의 항진균 활성은 먼저 포자 발아억제 활성을 96-welll plate를 이용하여 ]차 평가하였으며, 이후 disc paper 방법을 이용한 균사체 생육억제 활성을 평가하였다[Z8, 17]. 먼저 포자 발아억제 활성 평가의 경우, PDA배지에 F.
- , USA)를 이용하여 약 1(〃ml 농도로 현탁하였다. 이후, 180 μ1의 멸균 PDB 배지를 96 well plate의 각각의 well 에 가하고, 준비된 포자 현탁액 10 |il 및 조제된 천연물 추출물 10 μ1씩을 각각 첨가하였다. 이때, 천연물 추출물의 최종농도는 100 ng/ml 되도록 첨가하였으며, 30℃에서 5일간 배양한 후 생육 여부를 육안으로 판정하였다.
- 이때, 천연물 추출물의 최종농도는 100 ng/ml 되도록 첨가하였으며, 30℃에서 5일간 배양한 후 생육 여부를 육안으로 판정하였다. 한편 균사체 생육 억제 활성의 경우, PDA 배지에서 disc-paper (지름 6 mm, Whatman No. 2)를 이용한 생육저지환의 크기를 측정하여 평가하였다[17, 20, 22]. 대조구로는 시판농약 성분인 difenocona- zole, thiopanate-methyl, mancozeb (K-company, Korea) 및 miconazole (Sigma Co.
- 구입하였다. 지상부의 음건물을 파쇄한 후, 각각 10배 중량의 methanol, ethanol(95%, 주정), ethylacetate 및 hexane을 가하여 상온에서 24시간 추출하였다. 한편 물 추출의 경우에는 18시간 동안 상온에서 추출하였으며, 열수 추출의 경우에는 100℃에서 4 시간 동안 추출하였다.
- 한편 물 추출의 경우에는 18시간 동안 상온에서 추출하였으며, 열수 추출의 경우에는 100℃에서 4 시간 동안 추출하였다. 각각의 추출액은 여과 후 60℃ 이하에서 감압농축하여 분말화한 후, 활성 및 수율을 평가하였다. 한편 추출물의 활성분획은 산초 methanol 추출물을 물에 현탁 한 후, hexane, ethylacetate, 및 n-butanol을 사용하여 순차적으로 분획하였으며, 최종적으로 물 분획을 회수하였다.
- 각각의 추출액은 여과 후 60℃ 이하에서 감압농축하여 분말화한 후, 활성 및 수율을 평가하였다. 한편 추출물의 활성분획은 산초 methanol 추출물을 물에 현탁 한 후, hexane, ethylacetate, 및 n-butanol을 사용하여 순차적으로 분획하였으며, 최종적으로 물 분획을 회수하였다. 회수된 분획물은 동일한 방법으로 감압농축하여 분말로 조제한 후, 수율과 흰가루병 곰팡이 성장억제 활성을 측정하였다.
- 한편 추출물의 활성분획은 산초 methanol 추출물을 물에 현탁 한 후, hexane, ethylacetate, 및 n-butanol을 사용하여 순차적으로 분획하였으며, 최종적으로 물 분획을 회수하였다. 회수된 분획물은 동일한 방법으로 감압농축하여 분말로 조제한 후, 수율과 흰가루병 곰팡이 성장억제 활성을 측정하였다.
- muianse- 이용하였다. 각각의 세균을 Nutrient broth (Difco Co., USA)에 16시간 배양한 후 Nutrient agar 배지 (Difco Co., USA) 에 도말하고, disc-paper (지름 6 mm, Whatman No. 2)를 이용한 생육저지환의 크기를 측정하여 평가하였다[17, 20, 22]. 이때 대조구로는 streptomycin sulfate (Sigma Co.
- 산초 추출물 및 분획물의 실제적 이용가능성을 검토하기 위해, 먼저 약해정도를 평가하였다. 토마토 종자(감복 제품-완숙토마토, 대목: 헬파-M)를 부농상토 3호(부농산업사 제품) 에파종하여, 5엽기까지 온실조건(온도 20~40℃, 자연광, 자연 습도, 수돗물 분무 관수)에서 재배한 다음, 식물생장 조절기 (Daehan UbTech, LS-103-2)3.
- 이때 식물 생장 조절기의 조건은 25~27℃, 12시간 채광(2,000 Lux, 06:00-18:00, 암조건 18:00-06:00), 습도 70%로 조절하였다. 산초 메탄올 추출물의 물 분획물을 증류수에 용해하여 500 pg/ml, 1,000 pg/ml, 10, 000 μg/ml의 농도로 조제하여 수압식 손분무기를 이용하여 흘러내릴 정도로 분무하고 식물 생장 조절기에서 재배하였다. 분무 7일 후 약해 정도와 증상을 확인하였으며, 이때 처리 당 반복수는 5반복으로 하였다.
- 산초 메탄올 추출물의 물 분획물을 증류수에 용해하여 500 pg/ml, 1,000 pg/ml, 10, 000 μg/ml의 농도로 조제하여 수압식 손분무기를 이용하여 흘러내릴 정도로 분무하고 식물 생장 조절기에서 재배하였다. 분무 7일 후 약해 정도와 증상을 확인하였으며, 이때 처리 당 반복수는 5반복으로 하였다.
- 먼저 조제된 천연물 시료 900여 종을 대상으로 F. gratni- nearum 포자발아 억제 활성을 평가하였다. 96 well plate를 사용하여 대량의 시료를 빠르고 효율적으로 활성을 검색할 수 있었으며, 사용시료 및 배지의 절감할 수 있었다.
- 그러나 배양 시간이 길어지면서 포자 발아에 따른 균사체의 과도한 성장이 나타나는 경우, 인접 well로 균사체가 이행되는 경우가 나타나는 문제점도 있었다. 따라서 본 실험에서는 5일간의 배양동안 매일 발아정도를 확인하였으며' 오염 및 배지 증발을 최소화하기 위해 가장자리 well들은 사용하지 않았다. 활성평가 결과' 포자의 발아억제 활성이 없는 경우 well 에 곰팡이의 생육이 가득하였으며, 포자가 발아하지 못한 경우 곰팡이의 성장은 나타나지 않았다(Fig.
- 그러나 물 잔류물의 활성 역시 methanol 추출물의 활성보다 상대적으로 약해, 활성 성분이 다양하게 존재하리라 추측되며, 실제적 이용을 위해서는 methanol 추출물이 더욱 유리하리라 판단되었다. 한편 산초 잎의 경우, ethanol 추출물 5 mg/disc 농도에서 항세균활성이 보고[6]되어 있어, 본 실험의 산초 음건물의 methanol 추출물 및 이의 분획물의 다양한 병원성 세균 및 식중독 부패세균에 대한 항세균 활성을 250 pg/disc 농도에서 평가하였다. 대조구로 사용된 streptomycin의 경우 250 /disc 농도에서 강력한 항세균 활성을 나타내었으며, 산초의 경우 hexane 및 n-butanol 분획에서 항세균 활성이 인정되었으나, ethylacetate 분획에서는#를 제외한 다른 세균에서는 활성이 나타나지 않았다(Table 4).
- 반면 까마중, 오수유, 윤판나물* 미치광이풀, 때죽나무, 방기, 정향' 멍석딸기, 호장근, 천황련' 작약, 대황, 모란, 달맞이꽃, 대극, 개박하 추출물에서는 100 ug /disc 농도에서 생육억제환의 크기가 9 mm 이하의 미약한 활성을 나타내었다(결과 미제시). 따라서 F. graminearum 제어를 위한 천연물로 산초 추출물을 최종적으로 선별하였으며, 산초 추출물의 대량 조제를 위해 추출용매 검토와 활성분획을 조제하였다. 먼저 hot water, water (30℃), methanol, 95% ethanol, ethylacetate 및 hexane 추출 시 각각의 추출효율은 15.
대상 데이터
- 실험에 사용한 시료는 본 연구팀에서 2002년에서 2006년에 걸쳐 조제, 보고한 900 여종의 자생, 약용식물 추출물을 사용하였다[9, 11, 20-23]. 이미 보고한 바와 같이, 수집된 천연물들은 대한식물도감에서 검증하여 그늘에서 일주일간 건조 후 잘게 썰어 추출에 사용하였으며, 식물체 건조무게에 대해 10배 중량의 메탄올을 가하여 추출하고, 추출액을 여과, 감압 농축하여 메탄올 추출물을 제조하였다.
- 조제된 천연물 추출물은 사용 전까지 4℃ 냉장고에서 밀봉 보관하였으며, 필요에 따라 dimethylsulfoxide에 녹여 적당한 농도로 조정하여 사용하였다. 한편 흰가루병 곰팡이로는 보리 흰가루병 원인균으로 알려진 Fusarium graminearum Schwabe KACC 41040을 한국농용미 생물보존센터 에서 분양받아 사용하였으며 potato dextrose agar 배지 (PDA, Difco Co., USA)에 접종하여 30℃에서 계대배양하며 사용하였다.
- 2)를 이용한 생육저지환의 크기를 측정하여 평가하였다[17, 20, 22]. 대조구로는 시판농약 성분인 difenocona- zole, thiopanate-methyl, mancozeb (K-company, Korea) 및 miconazole (Sigma Co., USA)을 dimethylsulfoxide에 녹여 사용하였다. Disc-paper를 포함한 생육저지환의 크기가 8 mm 이상인 경우 항진균 활성을 인정하였으며, 모든 실험은 3회 반복하여 결과를 나타내었다.
- 산초 추출물을 대량으로 조제하기 위해, 산초나무 뿌리 부분을 제외한 산초나무 지상부(산초나무 가지 및 줄기가 포함된 열매 및 잎)의 음건물을 안동 재래시장에서 구입하였다. 지상부의 음건물을 파쇄한 후, 각각 10배 중량의 methanol, ethanol(95%, 주정), ethylacetate 및 hexane을 가하여 상온에서 24시간 추출하였다.
- 산초 추출물 및 분획물의 항세균 활성 평가에 사용된 세균은 식중독균인 Staphylococcus aureus KACC 10196, Salmonella typhimurium KCTC 1926, Proteus vulgaris KCTC 2433, Esdterichia coli H7Q157 ATCC43895균과 아토피 관련 병원성균인 Pseudomonas aeroginosa KACC 10186, 충치원인균인 Streptococcus muianse- 이용하였다. 각각의 세균을 Nutrient broth (Difco Co.
- 이는 사용시료가 산초열매 뿐만 아니라, 잎, 줄기를 포함하고 있기 때문으로 판단되며, 산초의 초임계용매 추출 125] 등과 같이 추출방법에 따라서도 영향을 받을 것으로 판단된다. 본 실험에서는 각각의 용매 추출물 50 ng/disc 농도로 균사 성장억제 활성을 평가한 결과, methanol 추출물에서 가장 우수한 활성을 나타내어 대량 시료 조제를 위한 추출용매로 methanol을 선정하였다(Table 2). Hexane, ethylacetate 및 n-butan이을 이용한 순차적 분획의 경우, n-butanol 분획물이 가장 많았으며(41.
성능/효과
- 먼저 포자 발아 억제 활성평가 결과 산초' 당귀, 미국가막사리, 까마중, 오수유, 윤판나물' 미치광이풀' 떄죽나무, 백선, 방기, 정향, 멍석딸기, 호장근, 천황련, 작약, 대황, 모란, 달맞이꽃, 대극, 개박하 추출물을 1차 선별하였으며, 균사 생육억제 활성 원재료 확보 용이성 및 실제 적용 가능성 등을 고려하여 산초추출물을 최종 선정하였다. 산초 추출물 조제 시 methanol 추출이 효율적이며, 순차적 유기용매 분획물의 경우 물 잔류물에서 항진균 활성이 나타났다. 그러나 methanol 추출물에 비해 분획물의 활성이 다소 감소하여 다양한 물질이 보완적으로 항진균 활성을 나타냄을 추측할 수 있으며, 미 약하지만 methanol 추출물 및 분획물에서 항세균 활성도 확인하였다.
- , USA)을 dimethylsulfoxide에 녹여 사용하였다. Disc-paper를 포함한 생육저지환의 크기가 8 mm 이상인 경우 항진균 활성을 인정하였으며, 모든 실험은 3회 반복하여 결과를 나타내었다.
- gratni- nearum 포자발아 억제 활성을 평가하였다. 96 well plate를 사용하여 대량의 시료를 빠르고 효율적으로 활성을 검색할 수 있었으며, 사용시료 및 배지의 절감할 수 있었다. 그러나 배양 시간이 길어지면서 포자 발아에 따른 균사체의 과도한 성장이 나타나는 경우, 인접 well로 균사체가 이행되는 경우가 나타나는 문제점도 있었다.
- 따라서 본 실험에서는 5일간의 배양동안 매일 발아정도를 확인하였으며' 오염 및 배지 증발을 최소화하기 위해 가장자리 well들은 사용하지 않았다. 활성평가 결과' 포자의 발아억제 활성이 없는 경우 well 에 곰팡이의 생육이 가득하였으며, 포자가 발아하지 못한 경우 곰팡이의 성장은 나타나지 않았다(Fig. 1). 횐가루병 곰팡이 #의 포자 발아억제 활성은 산초, 당귀, 미국가막사리, 까마중' 오수유, 윤판나물, 미치광이풀, 때죽나무, 백선, 방기, 정향, 멍석딸기, 호장근, 천황련' 작약, 대황, 모란, 달맞이꽃, 대극' 개박하 추출물의 20종에서 우수하였다.
- 1). 횐가루병 곰팡이 #의 포자 발아억제 활성은 산초, 당귀, 미국가막사리, 까마중' 오수유, 윤판나물, 미치광이풀, 때죽나무, 백선, 방기, 정향, 멍석딸기, 호장근, 천황련' 작약, 대황, 모란, 달맞이꽃, 대극' 개박하 추출물의 20종에서 우수하였다. 이는 최 등[2]이 67종의 식물 열매로 조제한 추출물의 보리횐가루병 곰팡이 Blumeria graminis f.
- graminearum 제어를 위한 천연물로 산초 추출물을 최종적으로 선별하였으며, 산초 추출물의 대량 조제를 위해 추출용매 검토와 활성분획을 조제하였다. 먼저 hot water, water (30℃), methanol, 95% ethanol, ethylacetate 및 hexane 추출 시 각각의 추출효율은 15.82, 13.17, 9.91, 3.12, 1.82 및 0.68% (w/w)로 나타나, 기존 보고156]와 달리 추출효윰이 다소 낮게 나타났으며, 특히 정유 식물에 비해 지용성 성분이 상대적으로 적음을 알 수 있었다. 이는 사용시료가 산초열매 뿐만 아니라, 잎, 줄기를 포함하고 있기 때문으로 판단되며, 산초의 초임계용매 추출 125] 등과 같이 추출방법에 따라서도 영향을 받을 것으로 판단된다.
- 22%를 나타내었다. 그러나 항진균 활성평가 결과 물 잔류물에서 활성이 나타났으며, 다른 분획물에서는 매우 미약한 활성이 나타났다(Table 3). 그러나 물 잔류물의 활성 역시 methanol 추출물의 활성보다 상대적으로 약해, 활성 성분이 다양하게 존재하리라 추측되며, 실제적 이용을 위해서는 methanol 추출물이 더욱 유리하리라 판단되었다.
- 한편 산초 잎의 경우, ethanol 추출물 5 mg/disc 농도에서 항세균활성이 보고[6]되어 있어, 본 실험의 산초 음건물의 methanol 추출물 및 이의 분획물의 다양한 병원성 세균 및 식중독 부패세균에 대한 항세균 활성을 250 pg/disc 농도에서 평가하였다. 대조구로 사용된 streptomycin의 경우 250 /disc 농도에서 강력한 항세균 활성을 나타내었으며, 산초의 경우 hexane 및 n-butanol 분획에서 항세균 활성이 인정되었으나, ethylacetate 분획에서는#를 제외한 다른 세균에서는 활성이 나타나지 않았다(Table 4). 이는 산초잎의 경우 ethanol 추출물의 ethylacetate 분획에서 우수한 항세균 활성을 보고[6]한 경우와 상이한 결과이나, 사용농도, 추출용매 및 추출 부위의 차이로 이해된다.
- 한편 산초 추출물의 실제적 이용가능성을 검토하기 위해 토마토 묘목을 이용하여 산초 물 분획물의 약해를 평가하였으며, 그 결과 500-1,000 ng/ml 농도에서는 분무 후 7일 동안 약해가 나타나지 않았으며, 10, 000 ng/ml 농도에서는 토마토 잎 가장자리에서 부분적인 고사현상이 나타났다(결과 미제시). 따라서 실제적 이용농도범위인 500-1,000 gg/ml 농도에서는 식물 약해가 나타나지 않으리라 판단되며, 이러한 결과는 실제 재배지의 효능평가를 위한 기초자료로 사용될 것이다.
- 산초 추출물 조제 시 methanol 추출이 효율적이며, 순차적 유기용매 분획물의 경우 물 잔류물에서 항진균 활성이 나타났다. 그러나 methanol 추출물에 비해 분획물의 활성이 다소 감소하여 다양한 물질이 보완적으로 항진균 활성을 나타냄을 추측할 수 있으며, 미 약하지만 methanol 추출물 및 분획물에서 항세균 활성도 확인하였다. 토마토 묘목을 이용한 산초 추출물의 활성 분획물의 약해 평가 결과 1,000 ng/ml 농도 처리 시에도 특이한 약해는 나타나지 않았다.
- 토마토 묘목을 이용한 산초 추출물의 활성 분획물의 약해 평가 결과 1,000 ng/ml 농도 처리 시에도 특이한 약해는 나타나지 않았다. 본 연구결과는 F. gmmiMawwn에 의해 나타나는 횐가루병 제어에 산초 주출물이 유용함을 제시하고 있다.
- 활성을 확인하였다. 특히 산초의 경우 원재료의 대량확보가 용이하며, 식물체에 대한 약해가 거의 없으며, 부가적인 항세균 활성을 확인하여 실제적 이용가능성이 높은 것으로 판단되었다. 이러한 연구는 천연물 추출물의 개발을 통해, 농약 보완 및 대치 등을 통한 친환경 농작물 재배 및 과채류의 유통, 저장상의 안전성 향상이 가능함을 제시하고 있다.
후속연구
- 따라서 실제적 이용농도범위인 500-1,000 gg/ml 농도에서는 식물 약해가 나타나지 않으리라 판단되며, 이러한 결과는 실제 재배지의 효능평가를 위한 기초자료로 사용될 것이다. 본 연구결과는 #에 의해 나타나는 흰가루병 제어에 산초 추출물이 이용가능함을 제시하고 있으며' 현재 항진균 활성물질의 정제 및 산초 메탄올 추출물을 이용한 재배지의 식물곰팡이 제어평가가 진행 중에 있다.
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