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문제 정의
- 따라서 본 실험은 알려진 4종의 항산화제의 처리가 조혈모 줄기세포의 계대배양 및 냉동보존에 어떤 영향을 미치는지 확인하고 줄기세포의 최적 배양 및 냉동보존에 가장 효과적인 항산화제를 선별하고자 하였다.
제안 방법
- Ascorbic acid 처리군은 33.3 uM, 100 uM, 250 uM 처리군으로, coumarine 처리군은 3.3 uM, 10 uM, 25 uM 처리군으로, sodium selenite 처리군은 0.33 uM, 1 uM, 3.3 uM 처리군으로, α-tocopherol 처리군의 경우에는 75 uM, 150 uM, 225 uM 처리군으로 각각 나누어 줄기세포의 생존률을 측정하여 항동해제를 처리하지 않은 대조군과 비교분석하였다(Table 2).
- 각 항산화제의 농도별 처리결과를 바탕으로 줄기세포의 생존에 미치는 항산화제의 최적 처리농도를 찾기 위하여 1차 결과에서 확인한 각각의 항산화제에서 가장 높은 생존률을 나타낸 농도를 다시 각각 세 개의 농도로 세분화하여 연구를 진행하였다. Ascorbic acid 처리군은 33.
- 계대배양은 배양중인 세포를 Ca2+-free Hank's bicarbonate solution (HBS, Gibco)로 세척한 후 2 mL TrepLe (Gibco)를 첨가하여 37℃, 5% CO2가 공급되는 습윤한 배양기에서 2분간 처리하였고, 배양용기 바닥으로부터 세포가 90% 이상 분리된 것을 현미경을 통해 확인한 후 10 mL의 배양액을 첨가하여 400 g로 5분간 원심분리 하였다.
- 냉동보존 후 해동된 줄기세포는 2 uL/cm2의 cell adhesive solution (BD, Cell-Tak)으로 코팅된 커버글라스가 바닥에 부착된 배양접시(SPL)에 2.5×103개의 줄기세포로 접종하여 배양하였다.
- 냉동보존된 줄기세포의 생존률은 0.4% Trypan Blue (Gibco)를 사용하여 측정하였다. 냉동보존된 줄기세포를 해동 후 원심분리하여 냉동보존액을 제거하고 배양액 1 mL를 첨가하였다.
- 5×103개의 줄기세포로 접종하여 배양하였다. 배양 12시간이내에 배양액을 제거하고 0.5 ug/mL calcein/AM, 2 uL/mL ethidium homodimer, 2 ug/mL Hoechst 33342 (Sigma)을 DMEM-L 배양액에 첨가하여 37℃, 5% CO2가 공급되는 습윤한 배양기에서 30～45분간 염색하였다. 염색 후 PBS로 2～3회 세척된 세포에 2.
- 상층액 제거 후 1 mL의 배양액을 첨가하여 현탁시켜 세포수를 측정하고, 75 mL 배양용기 당 2×105개의세포를 접종하여 37℃, 5% CO2가 공급되는 습윤한 배양기에서 배양하였다.
- 해동 후 세포의 자동분화율 측정을 위해 배양 중인 세포가 배양접시내 80% 정도 증식하였을 때 배양접시의 상층액을 제거하고 Diff-Quik stain kit (Sysmex)을 사용하여 염색하였다. 상층액이 제거된 배양접시에 고정액을 1 mL 첨가하여 15초간 고정시킨 후 Diff-Quik solution Ⅰ과 Ⅱ 1 mL를 각각 1분 30초간 처리하여 염색한 후 수세하여 광학현미경으로 세포를 관찰하였다. 현미경 시야에서 관찰되는 실험은 3회이상 반복하여 측정하였다.
- 세포의 형태 및 세포막 손상은 LIVE/DEAD assay kit (Molecular Probe)를 사용하여 관찰하였다. 냉동보존 후 해동된 줄기세포는 2 uL/cm2의 cell adhesive solution (BD, Cell-Tak)으로 코팅된 커버글라스가 바닥에 부착된 배양접시(SPL)에 2.
- 5 ug/mL calcein/AM, 2 uL/mL ethidium homodimer, 2 ug/mL Hoechst 33342 (Sigma)을 DMEM-L 배양액에 첨가하여 37℃, 5% CO2가 공급되는 습윤한 배양기에서 30～45분간 염색하였다. 염색 후 PBS로 2～3회 세척된 세포에 2.5% glutaraldehyde가 첨가된 PBS를 첨가하여 빛이 차단된 5℃ 냉장실에서 30분간 고정한 후 상층액을 제거하였고 glycerol과 PBS를 1:1 비율로 혼합한 액체를 커버글라스가 충분히 잠기도록 첨가한 뒤 공초점 현미경(Leica, TCS SP@ AOBS)으로 검경하였다.
- 냉동보존된 줄기세포를 해동 후 원심분리하여 냉동보존액을 제거하고 배양액 1 mL를 첨가하였다. 줄기세포 현탁액은 trypan blue 용액과 1:4의 비율로 혼합하여 5분 동안 방치한 후 hemocytometer를 이용하여 줄기세포의 생존률을 측정하였다. 줄기세포의 생존률은 총 8회 이상의 반복측정하였다.
- 줄기세포 현탁액은 trypan blue 용액과 1:4의 비율로 혼합하여 5분 동안 방치한 후 hemocytometer를 이용하여 줄기세포의 생존률을 측정하였다. 줄기세포의 생존률은 총 8회 이상의 반복측정하였다.
- 줄기세포의 형태 및 세포막 손상 정도를 확인하기 위하여 항상화제 처리 후 동결시킨 줄기세포를 해동하고 배양하여 LIVE/DEAD assay kit로 염색하여 공초점 현미경으로 관찰하였다(Fig. 1). 관찰된 모든 세포의 세포질에서 esterase 활성을 나타내는 녹색 형광을 확인할 수 있어 살아있는 세포로 판단되었다.
- 현미경 시야에서 관찰되는 실험은 3회이상 반복하여 측정하였다. 총 세포수와 형태적으로 변형된 세포수를 각각 계수하여 분화율을 계산하였다.
- 항산화제가 처리된 세포의 냉동보존은 DMEM‐L에 5% DMSO, 10% FBS가 함유된 냉동보존액을 사용하여 실시하였다. 회수된 줄기세포는 냉동보존액 첨가 후 현탁시켜 10분간 방치하였고, 2 mL의 cryovial당 5×105/mL개의 세포를 넣어 isopropyl alcohol이 채워진 cryogenic container (Nalgene)에 옮긴 후 －80℃ 초저온 냉동고에 넣어 2시간 동안 방치하였고, 이후 －196℃ 액체질소가 담긴 저장탱크로 옮겨 보관하였다.
- 항산화제는 4종(ascorbic acid, coumarine, sodium selenite, α-tocopherol)을 선정하였으며, 줄기세포의 배양 및 냉동보존에 가장 효과적인 항산화제와 최적농도를 조사하고자 하였다.
- 해동 후 세포의 자동분화율 측정을 위해 배양 중인 세포가 배양접시내 80% 정도 증식하였을 때 배양접시의 상층액을 제거하고 Diff-Quik stain kit (Sysmex)을 사용하여 염색하였다. 상층액이 제거된 배양접시에 고정액을 1 mL 첨가하여 15초간 고정시킨 후 Diff-Quik solution Ⅰ과 Ⅱ 1 mL를 각각 1분 30초간 처리하여 염색한 후 수세하여 광학현미경으로 세포를 관찰하였다.
- 해동된 줄기세포는 400 g에서 5분간 원심분리하여 냉동보존액을 제거한 후 1 mL의 배양액을 첨가하여 다음 실험을 위해 배양기 속에 보관하거나, 10% FBS(Gibco), 100 U/mL penicilin, 100 mg/mL streptomycin를 첨가한 DMEM‐L 배양액을 사용하여 배양용기 당 2×105개의 세포를 접종하여 37℃, 5% CO2가 공급되는 습윤한 배양기에 배양하였다.
- 상층액이 제거된 배양접시에 고정액을 1 mL 첨가하여 15초간 고정시킨 후 Diff-Quik solution Ⅰ과 Ⅱ 1 mL를 각각 1분 30초간 처리하여 염색한 후 수세하여 광학현미경으로 세포를 관찰하였다. 현미경 시야에서 관찰되는 실험은 3회이상 반복하여 측정하였다. 총 세포수와 형태적으로 변형된 세포수를 각각 계수하여 분화율을 계산하였다.
대상 데이터
- 가 공급되는 습윤한 배양기에서 배양하였다. 배양액은 10% FBS (Gibco), 100 U/mL penicilin, 100 mg/mL streptomycin이 첨가된 DMEM‐L (Gibco)을 사용하였으며, 배양용기에 세포가 80～90% 정도 증식하였을 때 계대배양을 시행하였다. 계대배양은 배양중인 세포를 Ca2+-free Hank's bicarbonate solution (HBS, Gibco)로 세척한 후 2 mL TrepLe (Gibco)를 첨가하여 37℃, 5% CO2가 공급되는 습윤한 배양기에서 2분간 처리하였고, 배양용기 바닥으로부터 세포가 90% 이상 분리된 것을 현미경을 통해 확인한 후 10 mL의 배양액을 첨가하여 400 g로 5분간 원심분리 하였다.
- 코어스템(주)으로부터 공급받은 인간 조혈모 줄기세포를 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과의 통계적 유의성은 Student t-test를 사용하여 검정하였다.
이론/모형
- 항산화제 처리 후 냉동보존, 해동된 줄기세포를 배양하여 Diff‐Quik 염색법을 이용하여 분화율을 측정하였다(Fig. 2). 냉동보존 후 해동된 대조군의 분화율은 10.
성능/효과
- α-tocopherol 처리군은 모든 처리군에서 대조군보다 높은 생존률을 나타냈으며, 특히 150 uM의 농도에서 72.1±5.0%의 생존율을 보여 항산화제 처리군 중에서 가장 높은 생존률을 보였다.
- Ascorbic acid는 모든 처리농도에서 항산화제를 처리하지 않은 대조군(61.0±5.0%)에 비해 높은 생존률을 보였으며, 특히 0.1 mM 처리군에서 69.2±19.0%로 가장 높은 생존률을 보였다.
- Coumarine 3.3 uM 처리군과 ascorbic acid 100 uM 처리군에서 각각 61.4±6.0%와 60.5±7.0%의 생존률을 보여 62.7±8.0%의 생존률을 보인 대조군에 비해 약간 낮은 생존률을 보였으나, α-tocopherol 225 uM 처리군과 ascorbic acid 33.3 uM 처리군에서는 각각 68±8.0%와 68.8±6.0%의 생존률을 보여 대조군에 비해 높은 생존률을 보였다.
- Sodium selenite 처리군의 경우, 1 uM 처리군에서만 66.6±10.0%의 생존률을 보여 대조군보다 높은 생존률을 보였으며, 5 uM과 20 uM 처리군에서는 각각 56.9±6.0%와 60.3±9.0%의 생존률을 보여 대조군에 비해 낮은 생존률을 보였다.
- 1). 관찰된 모든 세포의 세포질에서 esterase 활성을 나타내는 녹색 형광을 확인할 수 있어 살아있는 세포로 판단되었다. 해동 후 세포의 형태적 변화를 비교한 결과, coumarine 10 uM과 α-tocopherol 75 uM, ascorbic acid 250 uM, sodium selenite 3.
- 그러나 단일 ascorbate 투여군에서는 비타민 E의 함량이 감소하였으나, α-tocopherol과 ascorbate 혼합 투여군에서는 α-tocopherol 투여군에서보다 정액 내 비타민 E 함량이 더욱 많이 증가되었다.
- , 2004). 그러나 본 실험결과, selenium 처리군의 생존률은 대조군에 비해 약간 높게 나타났으나 거의 차이가 없는 것으로 사료된다. 이러한 결과로 보아 selenium의 자체 항산화 활성보다는 selenoprotein을 통한 항산화 작용이 일어나는 것으로 생각된다.
- , 2008). 그러므로 본 실험결과와 위의 보고들로 보아 selenium은 비타민 E와 혼합 사용하는 것이 보다 향상된 항산화제 효과를 보일 것으로 사료된다.
- 냉동보존 후 해동된 조혈모 줄기세포의 세포막 손상 유무 확인 결과, 대조군을 포함한 모든 실험군에서 약간의 형태적 차이는 관찰되었으나(Fig. 1), 세포막 손상의 표지자인 ethidium homidiner에 염색되지 않은 것으로 보아 대조군 및 항산화제 처리군 모두에서 세포막 손상은 일어나지 않은 것으로 관찰되었다. 그러나 손상이 관찰되지 않은 이유가 항동해제 처리에 따른 해동 초기 냉동보존에 의한 손상들이 회복이된 결과인지 회복 불가능한 세포들이 배양되는 동안 사멸하여 없어진 결과인지는 추후 실험을 통해 확인할 필요가 있다고 생각된다.
- 냉동보존 후 해동된 조혈모 줄기세포의 자동분화율 측정결과(Table 3)에서 모든 α-tocopherol 처리군에서 대조군보다 낮은 분화율을 보였다.
- 또한, coumarine을 처리한 실험군의 경우 10 uM 처리군에서 67.9±16.0%의 생존률을 보여 대조군에 비해 높은 생존률을 나타내었다.
- 본 실험결과(Table 1, 2), 선별된 항산화제를 처리 후 냉동 보존된 조혈모 줄기세포의 생존률은 ascorbic acid와 α-tocopherol 처리군에서 대조군에 비해 향상된 생존률을 나타내었으나, coumarine과 sodium selenite 처리군에서는 대조군과 거의 비슷하게 나타났다.
- 본 실험의 결과에서는 Jeong 등(2006)의 연구결과와 같이 α-tocopherol과 ascorbic acid 처리군이 대조군에 비해 10～20% 정도의 줄기세포 생존률 향상의 효과를 나타내었고, α-tocopherol 처리군이 ascrobic acid 처리군에 비해 높은 생존률을 보였다.
- 그러나 본 실험결과, selenium 처리군의 생존률은 대조군에 비해 약간 높게 나타났으나 거의 차이가 없는 것으로 사료된다. 이러한 결과로 보아 selenium의 자체 항산화 활성보다는 selenoprotein을 통한 항산화 작용이 일어나는 것으로 생각된다. 닭에게 selenium과 비타민 E의 혼합투여는 유기인산계 살충제인 말라티온 노출에 따라 일어나는 지질 산화를 막는 ROS scavenger로 작용하여 해로운 영향을 극복할 수 있는 항산화적 시너지 효과를 보인다고 하였다(Sodhi et al.
- 특히 α-tocopherol 150 uM 처리군에서 70.5±7.0%의 생존율을 보여 항상화제 중에서 가장 높은 결과를 보였다(p<0.05).
- 해동 후 세포의 형태적 변화를 비교한 결과, coumarine 10 uM과 α-tocopherol 75 uM, ascorbic acid 250 uM, sodium selenite 3.3 uM을 각각 처리한 그룹들에서 냉동보존하지 않은 대조군의 경우와 비슷한 형태의 세포질이 양극으로 가지친 섬유아세포의 형태를 보인 반면 coumarine 3.3 uM 및 25 uM 처리군과 α-tocopherol 150 uM 및 225 uM 처리군, 그리고 sodium selenite 0.33 uM 처리군에서는 모두 대조군과는 다른 둥근형태의 세포가 관찰되어 세포의 형태가 변화한 것으로 확인되었다.
후속연구
- , 2006). 그러나 본 실험결과에서 ascorbic acid 처리군은 자동분화율이 좋지 않은 결과(Table 3)를 나타낸 것으로 보아 줄기세포의 배양 및 냉동보존시에 ascorbic acid를 항산화제로 사용하는 것에 주의를 기울여야 할 것으로 사료된다.
- 이러한 형태는 표본제작 과정과 검경과정에서 배양용기로부터 세포가 분리될 때나 또는 커버글라스에 세포를 부착시키기 위해 사용된 cell adhesive solution이 세포의 형태에 영향을 미친 것으로 생각된다. 그러나 상기 현상이 일시적인 결과인지 줄기세포의 형태 및 향후 증식배양에 심각한 영향을 줄 것인지에 대해서는 좀 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 1), 세포막 손상의 표지자인 ethidium homidiner에 염색되지 않은 것으로 보아 대조군 및 항산화제 처리군 모두에서 세포막 손상은 일어나지 않은 것으로 관찰되었다. 그러나 손상이 관찰되지 않은 이유가 항동해제 처리에 따른 해동 초기 냉동보존에 의한 손상들이 회복이된 결과인지 회복 불가능한 세포들이 배양되는 동안 사멸하여 없어진 결과인지는 추후 실험을 통해 확인할 필요가 있다고 생각된다. 해동 후 배양된 세포의 형태는 3.
- 본 실험결과를 종합하면, 조혈모 줄기세포의 냉동보존에는 150 uM의 α-tocopherol의 사용이 조혈모 줄기세포의 냉동보존 면에서 항산화제로서의 역할과 냉동보존의 효율 향상에 많은 역할을 할 것으로 생각되며, 향후 냉동보존의 첨가제로서의 α-tocopherol의 효능 및 해동 후 배양과정에서의 항산화적 영향 평가 연구가 지속적으로 수행되어 냉동보존 시 항산화제의 역할이 정확히 규명된다면 보다 효율적인 줄기세포의 냉동보존 프로토콜 정립이 가능하게 될 것으로 사료된다.
- 냉동보존 후 해동된 조혈모 줄기세포의 자동분화율 측정결과(Table 3)에서 모든 α-tocopherol 처리군에서 대조군보다 낮은 분화율을 보였다. 이 결과는 일반적으로 냉동보존제에 흔히 쓰이는 DMSO가 신경분화인자로 작용함이 잘 알려져 있으며, ethylene glycol 등의 항동해제가 동물 난자의 성숙과정에서 세포의 분열과도 밀접한 연관이 있는 액틴 필라멘트의 중합 및 탈중합에 심각한 영향을 준다는 보고(Rojas et al., 2004; Le Gal et al., 2000) 등에 비추어볼 때 냉동보존의 결과 손상된 미세소관이나 미세섬유의 회복 또는 사멸 억제의 기작과 연관되어 항산화제가 세포에 영향을 준 것으로 생각되나, 향후 이와 연관된 정밀한 실험을 통한 확인이 필요할 것으로 사료된다.
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