본 연구는 남세균 고유의 프로모터를 포함하는 유전자간 염기서열에 기반하여 환경위해성 검출용 바이오센서를 개발하고자 시도되었다. 포도당 처리에 의해서 유도되는 8종의 유전자 (atpI, ndbA, ctaD1, tkt, pgi, pdh, ppc, 그리고 rydA)의 프로모터 부위를 리포터 유전자의 일종인 발광유전자 (luxAB) 벡터 pILA (Genbank: AJ251840)에 도입시켜 재조합 벡터를 제조한 후 Synechocystis sp. PCC6803을 형질전환시킨 결과, pILA 벡터만을 포함하고 있는 대조구에 비해서 포도당 처리에 의해서 생물발광량이 5-25배 정도 현저히 증가함을 확인하였다. 또한 $Hg^{2+}$, $Cu^{2+}$, $Zn^{2+}$과 같은 중금속, $CN^-$, DCMU, DBMIB와 같은 제초제, 그리고 클로람페니콜이나 리팜피신과 같은 항생제에 의해서 생물발광이 현저히 억제되었다.
본 연구는 남세균 고유의 프로모터를 포함하는 유전자간 염기서열에 기반하여 환경위해성 검출용 바이오센서를 개발하고자 시도되었다. 포도당 처리에 의해서 유도되는 8종의 유전자 (atpI, ndbA, ctaD1, tkt, pgi, pdh, ppc, 그리고 rydA)의 프로모터 부위를 리포터 유전자의 일종인 발광유전자 (luxAB) 벡터 pILA (Genbank: AJ251840)에 도입시켜 재조합 벡터를 제조한 후 Synechocystis sp. PCC6803을 형질전환시킨 결과, pILA 벡터만을 포함하고 있는 대조구에 비해서 포도당 처리에 의해서 생물발광량이 5-25배 정도 현저히 증가함을 확인하였다. 또한 $Hg^{2+}$, $Cu^{2+}$, $Zn^{2+}$과 같은 중금속, $CN^-$, DCMU, DBMIB와 같은 제초제, 그리고 클로람페니콜이나 리팜피신과 같은 항생제에 의해서 생물발광이 현저히 억제되었다.
In this study, glucose-inducible intergenic sequences were used to generate bioreporters of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that could monitor environmental pollutants. Luciferase genes LuxAB from the marine bacterium Vibrio fischeri under the control of glucose-inducible intergenic se...
In this study, glucose-inducible intergenic sequences were used to generate bioreporters of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that could monitor environmental pollutants. Luciferase genes LuxAB from the marine bacterium Vibrio fischeri under the control of glucose-inducible intergenic seqeucens of eight genes (atpI, ndbA, ctaD1, tkt, pgi, pdh, ppc, and cydA) were successfully expressed in the cyano-bacterial transformants, showing 5-25 fold increases in biolumeniscence upon exposure to glucose. In addition, glucose-inducible cyanobacterial bioreporters were very sensitive to various chemicals such as heavy metals ($Hg^{2+}$, $Cu^{2+}$, $Zn^{2+}$), electron transport inhibitors (DCMU, DBMIB, $CN^-$), and antibiotics (chloramphenicol and rifampicin). These glucose-inducible cyanobacterial bioreporters would be useful to develop biosensors for rapid screening of environmental samples.
In this study, glucose-inducible intergenic sequences were used to generate bioreporters of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that could monitor environmental pollutants. Luciferase genes LuxAB from the marine bacterium Vibrio fischeri under the control of glucose-inducible intergenic seqeucens of eight genes (atpI, ndbA, ctaD1, tkt, pgi, pdh, ppc, and cydA) were successfully expressed in the cyano-bacterial transformants, showing 5-25 fold increases in biolumeniscence upon exposure to glucose. In addition, glucose-inducible cyanobacterial bioreporters were very sensitive to various chemicals such as heavy metals ($Hg^{2+}$, $Cu^{2+}$, $Zn^{2+}$), electron transport inhibitors (DCMU, DBMIB, $CN^-$), and antibiotics (chloramphenicol and rifampicin). These glucose-inducible cyanobacterial bioreporters would be useful to develop biosensors for rapid screening of environmental samples.
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문제 정의
본 연구에서는 Synechocystis sp. PCC6803에서 탄수화물 대사와 호흡에 관련된 포도당 유도성 유전자의 프로모터 부위를 발굴하여 환경 위해 물질 감지능력이 향상된 남세균 바이 오리 포터를 개발하고자 시도되었다.
개발된 바이오센서가 ATP 생산을 억제하는 여러 가지의 대사물질에 의해 민감하게 영향을 받는지를 조사하였다. 광합성 기구의 광계2에 작용하는 제초제 디우론(diuron)의 일종인 DCMU (dichlorophenyl dimethyl urea: D), 호흡 전자전달계의 NAD (P) H 탈 수소효소의 작용을 억제하는 Hg좌 (H) 와로테논 (R), 시토크롬 b6/f 복합체 환원을 억제하는 DBMIB (dibromothymoquinone: B), 말단 시 토크롬 옥시다제를 억제하는 CN' (C), 전자전달에 의한 양성자기울기 발달을 억제하는 짝풀림인자인 CCCP (carbonylcyanide m-chlorophenyl-hydrazone: CP) 등 (Ryu et al.
본 연구는 남세균 고유의 프로모터를 포함하는 유전자 간염 기서 열에 기반하여 환경 위해성 검출용 바이오센서를 개발하고자 시도되었다. 포도당 처리에 의해서 유도되는 8종의 유전자 (atpl, ndbA, ctaDl, tkt, pgi, pdh, ppc, 그리고 cyda) 의프로모터 부위를 리포터 유전자의 일종인 발광유전자 (IwcAB)
제안 방법
5% bacto 아가가 포함된 BG-11과 섞에 0 mM 포도당이 포함되거나 (+ Glucose) 포함되지 않은 (- Glucose) BG-11 고체 배지 위에 얹고 균주 유지용 저온 배양기에서 배양하였다. 36 시간 (+이ucose)이나 48시간(-Glucose) 배양 후 최종 농도 5 Hg mF가 되도록 항생제를 고체 배지 아래쪽에 항생 제 농도구배가 생기도록 도 말하여 항생제 저항성 콜로니 (colony)가나 올 때까지 약 2주간 배양한 후 새로운 배지로 3-4회의 추가 분리 (segregation)하였다.
LuxA/LuxB 유전자를 포함하는 플라스미드 pILA 를 갖는 균주를 대조구로 하여 프로모터 부위를 포함하는 형질전환 균주에 각각 10 inM의 포도당을 생장 광 조건 하에서 1시간 처리한 후 생물발광량을 측정하였다. Fig.
2007)의 프로모터 부위를 포함하는 유전자 간 염 기서열 (intergenic sequences) (Table 1) 을 야생종 Synechocystis sp. PCC6803에서 추출한 DNA를 주형으로 하여 제한효소 Pst I과 Kpnl 서열의 링커를 붙인 프라이 머 (Table 1)를 이용하여 PCR한 후, 제한효소 Pst I/Kpnl 로 절단된 pILA 벡터 (Genbank AJ251840)에 클로닝하였다.
광합성 기구의 광계2에 작용하는 제초제 디우론(diuron)의 일종인 DCMU (dichlorophenyl dimethyl urea: D), 호흡 전자전달계의 NAD (P) H 탈 수소효소의 작용을 억제하는 Hg좌 (H) 와로테논 (R), 시토크롬 b6/f 복합체 환원을 억제하는 DBMIB (dibromothymoquinone: B), 말단 시 토크롬 옥시다제를 억제하는 CN' (C), 전자전달에 의한 양성자기울기 발달을 억제하는 짝풀림인자인 CCCP (carbonylcyanide m-chlorophenyl-hydrazone: CP) 등 (Ryu et al. 2004)을 10 mM 포도당으로 12시간 처리된 ila와 pdh 균주에 처리하였다. Fig.
5가 되게 세포를 수확한 후 100 UL의 BG11 배지에 재현 탁하였다. 여기에 루시 페라제의 기질인데칸을 10을 첨가하여 10초씩 루미노미터 (20/20°, 터너 바이오시스템즈(Turner Biosystems, USA)를 사용하여 인광을 측정하였다. 포도당 첨가에 의한 발광 증가는 세포에 10 mM 포도당을 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 후 측정하였다.
우리나라 하천 호소 및 해역에서 유해/오염물질로 분류되는 항목 중 시안(0.01 ppm), 수은(0.0005 ppm), 아연(0.1 ppm) 및 구리(0.02 ppm)의 기준치(환경정책기본법 제10조 동법시행령 제2조) 조건에서 개발된 남세균 리포터가 이들을 검출할 수 있는지를 조사하였다. 기준치 농도에서 각 유해물질을 각 각 4시간 처리한 후 발광을 측정한 결과(Fig.
지수 생장기의 Synechocystis 야생종을 2 ml (3-5 |ig Chi a) 수확하여 200 Hi의 액체 BG-11 배지로 재현탁시킨 후, 최종 1 Hg mF 가 되도록 카나마이 신 항생제 카세트가 삽입된 8종의 재조합 플라스미드 DNA를 섞어준 후 28-30C 암소에서 4-6시간 방치하여 형질전환 시켰다. 형질전환이 이루어진 세포를 포함한 현탁액은 40℃ 이하로 식힌 3 ml의 0.
여기에 루시 페라제의 기질인데칸을 10을 첨가하여 10초씩 루미노미터 (20/20°, 터너 바이오시스템즈(Turner Biosystems, USA)를 사용하여 인광을 측정하였다. 포도당 첨가에 의한 발광 증가는 세포에 10 mM 포도당을 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 후 측정하였다.
포도당 특이적으로 유전자 발현이 증가하는 호흡 관련 유전자 (Lee et al, 2007) 중에서 pgi, cydA, ppc, atpl, ndbA, pdh, th 및 c/aW 의 프로모터 부위를 포함하는 유전자 간 염기 (intergenic sequence)/]- 바이오센서로 이용될 수 있는지를 조사하였다. LuxA/LuxB 유전자를 포함하는 플라스미드 pILA 를 갖는 균주를 대조구로 하여 프로모터 부위를 포함하는 형질전환 균주에 각각 10 inM의 포도당을 생장 광 조건 하에서 1시간 처리한 후 생물발광량을 측정하였다.
대상 데이터
남세균 Synechocystis sp. PCC 6803 (Synechocystis) 야생종과 바이오리포터를 본 연구의 실험 재료로 사용하였다. 각 균주를 5 mM pH 완충액 N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethane-sulfonic acid (TES)-NaOH (pH 8.
성능/효과
LuxA/LuxB 유전자를 포함하는 플라스미드 pILA 를 갖는 균주를 대조구로 하여 프로모터 부위를 포함하는 형질전환 균주에 각각 10 inM의 포도당을 생장 광 조건 하에서 1시간 처리한 후 생물발광량을 측정하였다. Fig. 1에 나타낸 바와 같이, pILA 대조구균주에 비해 포도당 유도성 유전자의 프로모터 부위를 함유하는 균주는 적게는 2배에서 많게는 약 40배까지 포도당 처리에 의해 생물발 광양이 증가하였으며, pdh와 tkt 프로모터 부위를 함유하는 균주가 가장 강력한 활성을 나타내었다. 이러한 포도당 유도성 생물 발광량 증가 결과는 남세균 고유의 포도당 유도성 프로모터를 활용한 생물검정용 바이오센서가 개발되었음을 의미한다.
후 Synechocystis sp. PCC6X03을 형질전환시킨 결과, pILA 벡터만을 포함하고 있는 대조구에 비해서 포도당 처리에 의해서 생물발광량이 5-25배 정도 현저히 증가함을 확인하였다. 또한 Hgz+, Cu2+, 과 같은 중금속, CN; DCMU, DBMIB와 같은 제초제, 그리고 클로람페니콜이나 리팜 피신
02 ppm)의 기준치(환경정책기본법 제10조 동법시행령 제2조) 조건에서 개발된 남세균 리포터가 이들을 검출할 수 있는지를 조사하였다. 기준치 농도에서 각 유해물질을 각 각 4시간 처리한 후 발광을 측정한 결과(Fig. 3), 유해물질이 처리되지 않은 대조구(Co)에 비해서 pdh 유전자의 프로모터를 포함하는 바이오센서 모두에서 수은 (Hg2+), 시안 (CN) 및 아연Zn2+)에 대해 약 50-70%의 억제를 보였다. 따라서 포도당 유도성 프로모터를 갖는 Synechocystis 바이오센서는 우리나라 수환경의 유해물질을 검출하는 데 적용될 수 있을 것으로 판단된다.
한편, 전자 전달억제제의 처리에 의해 생물발광량이 감소하였는데 , 특히 DCMU와 Hg2+가 동시에 처리된 경우(DH) 현저하게 억제되었다. 또한, mRNA 합성과 단백질 생합성 억제제인 리팜피신 (Rf)과 클로람페니콜(CR)이 처리되었을 경우에도 각각 20%와 50%의 저해 효과를 보여주었다. 유전자 발현 억제제가 대사 억제제에 비해서 저해 효과가 미약한 것은 LuxA/LuxB 생물발광시스템이 유전자 발현에 의해서 보다는 세포 내 ATP 함량에 더욱 민감하게 반응함을 의미한다.
본 연구에서 개발된 남세균 바이오센서는 Shao 등 (2002) 에서 개발된 남세균에 비해서 포도당을 감지하는 기능을 가지며, 특히 매우 활동적인 물질대사 상태를 유지하므로 현저히 증가된 감도를 갖는다. 또한, 바이오센서 작동에 필요한 에너지인 ATP 생산을 교란하는 환경독성물질, 예를 들어 중금속, 시안, 제초제, 탄소원의 양적 변화에 민감하게 반응할 뿐 아니라, 포도당 유도성 유전자의 전사와 번역 억제제에도 민감하게 반응한다.
2에 나타낸 바와 같이, ILA 균주에 비교하여, p* 균주의 경우, 포도당에 의해 생물발광량이 7배 이상 높았다(대조구, Co). 한편, 전자 전달억제제의 처리에 의해 생물발광량이 감소하였는데 , 특히 DCMU와 Hg2+가 동시에 처리된 경우(DH) 현저하게 억제되었다. 또한, mRNA 합성과 단백질 생합성 억제제인 리팜피신 (Rf)과 클로람페니콜(CR)이 처리되었을 경우에도 각각 20%와 50%의 저해 효과를 보여주었다.
후속연구
또한, 바이오센서 작동에 필요한 에너지인 ATP 생산을 교란하는 환경독성물질, 예를 들어 중금속, 시안, 제초제, 탄소원의 양적 변화에 민감하게 반응할 뿐 아니라, 포도당 유도성 유전자의 전사와 번역 억제제에도 민감하게 반응한다. 따라서 개발된 남세균 센서는 포도당과 같은 영양물질이나 중금속, 시안을 검출하거나 제초제나 항생제의 생체검정에 사용될 바이오센서를 제공함으로써, 제약산업, 항생제나 제초제와 같은 신약 개발이나 수생태계 환경독성물질 검출 및 잔류농약이나 중금속의 실시간. 비파괴적 검출에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
3), 유해물질이 처리되지 않은 대조구(Co)에 비해서 pdh 유전자의 프로모터를 포함하는 바이오센서 모두에서 수은 (Hg2+), 시안 (CN) 및 아연Zn2+)에 대해 약 50-70%의 억제를 보였다. 따라서 포도당 유도성 프로모터를 갖는 Synechocystis 바이오센서는 우리나라 수환경의 유해물질을 검출하는 데 적용될 수 있을 것으로 판단된다.
따라서 개발된 남세균 센서는 포도당과 같은 영양물질이나 중금속, 시안을 검출하거나 제초제나 항생제의 생체검정에 사용될 바이오센서를 제공함으로써, 제약산업, 항생제나 제초제와 같은 신약 개발이나 수생태계 환경독성물질 검출 및 잔류농약이나 중금속의 실시간. 비파괴적 검출에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
참고문헌 (10)
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Lee JM, Ryu JY, Kim HH, Choi SB, Tandeau de Marsac N, Park Y-I (2005) Identification of a glucokinase that generates a major glucose phosphorylation activity in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Mol Cells 19: 256-261
Lee SH, Ryu JY, Kim SY, Jeon JH, Song JY, Cho HT, Choi SB, Choi D, N Tandeau de Marsac, and Park Y-I (2007) Transcriptional regulation of the respiratory genes in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 during the early response to glucose feeding. Plant Physiol 145 (3): 1018-1030
Moore B, Zhou L, Rolland F, Hall Q, Cheng WH, Liu YX, Jones TL, Sheen J (2003) Role of the Arabidopsis glucose sensor HXK1 in nutrient, light and hormonal signaling. Science, 300: 332-336
Ryu JY, Song JY, Lee JM, Jeong SW, Chow WS, Choi SB, Pogson BJ, Park Y-I (2004) Glucose-induced expression of carotenoid biosynthesis genes in the dark is mediated by cytosolic pH in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. J Biol Chem 279: 25320-25325
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