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문제 정의
- 2000). 본 연구에서는 Bacillus thuringiensis cryIAc 유전자를 도입하여 나비목 해충인 담배거세미 나방 (tobacco cutworm; Spodoptera litura)에 저항성을 나타내는 국화를 육성하기 위하여 실시하였다.
제안 방법
- cryIAc 유전자는 pCAMBIA2301 를 포힘하는 Agrobacterium C58C1 을 통하여 국화 'Linneker salmon' 에 도입하였다. Agrobacterium C58C1 을 접종한 후 엽절편을 10 mg/L kanamycin이 함유된 재분화 배지 (MS + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IAA)에서 1차 선발을 하였고, 재분화 배지에 20 mg/L kanamycin이 첨가된 배지에서 2차 선발을 하였으며, 20 mg/L kanamycin이 첨가된 MS 배지에서 3차 발근선발을 하였다. 3차 발근선발까지 69개의 신초 (1.
- Transgene의 도입여부를 확인하기 위하여 cryIAc transgene primer는 forward primer (5' TGG GCA AAG ATG GGG GAT TC 3')와 reverse primer (5' CAC GGC AGG GAT TTG AGT GTA 3')를 사용하였다. PCR 분석에 의하여 nptⅡ 유전자와 transgene이 삽입되었다고 확인된 putative 형질전환체에 대하여 Southern 분석을 실시하였다. Southern 분석을 위하여 genomic DNA 의 추출은 앞에서 언급한대로 추출하였으며, 20 ㎍의 genomic DNA를 제한효소 Hindlll(80 unit)을 사용하여 절단한 후 0.
- nptⅡ를 증폭하기 위한 primer는 forward primer (5' GAG GCT ATT CGG CTA TGA CTG 3')와 reverse primer (5' ATC GGG AGC GGC GAT ACC GTA 3')를 사용하였다. PCR 혼용액은 template DNA 100 ng, dNTP 200 μM, primer 10 pmoles, Taq DNA polymerase 2U 등의 조성으로 총 반응액을 50 μL로 하였으며, predenaturation 단계는 95℃에서 5분간, denaturation단계는 95℃ 에서 1분간, annealing 단계는 55℃ 에서 1분간, polymerization 단계는 72℃ 에서 1분간 (30 cycles), 그리고 extention 단계는 72℃ 에서 7분간으로 Icycler System (Bio-RAD)을 이용하여 수행하였다. Transgene의 도입여부를 확인하기 위하여 cryIAc transgene primer는 forward primer (5' TGG GCA AAG ATG GGG GAT TC 3')와 reverse primer (5' CAC GGC AGG GAT TTG AGT GTA 3')를 사용하였다.
- Strand cDNA는 RT buffer system 의 억제효과를 줄이기 위하여 1/10으로 희석하였다. Realtime PCRe MJ MINI OPTICON (BioRad, USA)를 사용하여 수행하였다. 증폭반응은 총량 20 ul에 10 ul의 2x DyNamo SYBR Green PCR Master Mix (FINNZYMES, Finland), 2 ul의 primer (최종 500 nM), 2ul의 cDNA를 혼합하여 최초 95 ℃에서 10분간 반응시키고, 95℃에서 30초와 57℃에서 30초, 72℃ 에서 30초간의 cycle을 40회하여 최종 72℃ 에서 10분간 증폭시켜 각 sample 당 2회 반복으로 실시했다.
- PCR 분석에 의하여 nptⅡ 유전자와 transgene이 삽입되었다고 확인된 putative 형질전환체에 대하여 Southern 분석을 실시하였다. Southern 분석을 위하여 genomic DNA 의 추출은 앞에서 언급한대로 추출하였으며, 20 ㎍의 genomic DNA를 제한효소 Hindlll(80 unit)을 사용하여 절단한 후 0.7% agarose gel에서 전기영동하였다, Gel을 0.2N HC1에 10분간처리 후 변성화 용액과 중성화 용액에 각 45분간 처리하여nylon membrane (Hybond™-N+, Amersham)에 upward capillary방식을 이용하여 DNA를 전이시켰다. 전이가 완료된 후, UV-cross linker를 이용하여 1200 mJ/cm2의 UV를 조사하여 DNA를 membrane에 고정시켰다.
- PCR 혼용액은 template DNA 100 ng, dNTP 200 μM, primer 10 pmoles, Taq DNA polymerase 2U 등의 조성으로 총 반응액을 50 μL로 하였으며, predenaturation 단계는 95℃에서 5분간, denaturation단계는 95℃ 에서 1분간, annealing 단계는 55℃ 에서 1분간, polymerization 단계는 72℃ 에서 1분간 (30 cycles), 그리고 extention 단계는 72℃ 에서 7분간으로 Icycler System (Bio-RAD)을 이용하여 수행하였다. Transgene의 도입여부를 확인하기 위하여 cryIAc transgene primer는 forward primer (5' TGG GCA AAG ATG GGG GAT TC 3')와 reverse primer (5' CAC GGC AGG GAT TTG AGT GTA 3')를 사용하였다. PCR 분석에 의하여 nptⅡ 유전자와 transgene이 삽입되었다고 확인된 putative 형질전환체에 대하여 Southern 분석을 실시하였다.
- 기내에서 계통별로 7개씩 순화하였다. cryIAc 유전자 가형 질전환된 식물체를 real-time PCR로 cryIAc 유전자의 단백질 발현량을 측정하였다. 형질전환된 식물체 대부분에서 cryIAc 유전자의 단백질 발현이 대조구보다 낮았으나, 형질전환체 B-3, B-21, B-53 식물체는 단백질 발현량이 대조구보다 월등히 높았다 (그림 4).
- 순화용토는 vermiculite 1 : perlite 1이 혼용된 인공용 토를 사용하였으며, 6주간 순화하여 배양토 (부식토 40% + 밭흙 60%)가 담긴 직경 30 cm 화분에 정식하여 온실에서 재배하였다. cryIAc 유전자가 형질전환된 식물체는 초장이 약 30 cm 정도 되었을 때, 담배거세미 나방 (tabacco cutworm; Spodoptera litura)의 유충 (2령~3령)을 개체별로 5마리씩 접종하여 2반복하였으며 접종 1 주일 후에 가해 정도를 조사하였다. 조사방법으로는 개체에 생존한 유충수와 유충이 가해한 국화의 패해정도를 조사하였다.
- 실시하였다. nptⅡ 및 transgene primer PCR과 Southern blot 분석을 위한 genomic DNA는 DNeasy plant mini kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 제조회사의 지침에 따라 기내에서 성장한 식물체 엽에서 추출하였다. nptⅡ를 증폭하기 위한 primer는 forward primer (5' GAG GCT ATT CGG CTA TGA CTG 3')와 reverse primer (5' ATC GGG AGC GGC GAT ACC GTA 3')를 사용하였다.
- 국화에 담배거세미 나방 (tobacco cutworm; Spodoptera litura)에 저항성을 나타내 국화를 육성하기 위하여 cryIAc 유전자를 형질전환하였다. cryIAc 유전자는 pCAMBIA2301 를 포힘하는 Agrobacterium C58C1 을 통하여 국화 'Linneker salmon' 에 도입하였다.
- 실험에 사용되었다. 균주접종 후 엽절편체를 10 mg/L kanamycin이 함유된 재분화 배지 (MS + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IAA)에서 1차 선발을 하였고, 재분화 배지에 20 mg/L kanamycin이 첨가된 배지에서 2차 선발을 하였으며, 20 mg/L kanamycin이 첨가된 MS 배지에서 발근시켜 3차 선발을 하였다, 3차 발근선발까지 vector control과 cryIAc 유전자가 삽입된 construction에서 69개의 신초가 생존하여 발근하였다. nptⅡ primer로 PCR을 한 결과 그 중 36개의 신초가 putative transformant로 확인되었고 (그림 2), Southern 분석을 한 결과, 35개체가 nptⅡ 유전자와 cryIAc 유전자를 가진 형질전환체로 확인되었다 (그림 3).
- 형질전환된 식물체 대부분에서 cryIAc 유전자의 단백질 발현이 대조구보다 낮았으나, 형질전환체 B-3, B-21, B-53 식물체는 단백질 발현량이 대조구보다 월등히 높았다 (그림 4). 또한 cryIAc 유전자가 형질전환된 식물체는 초장이 약 30 cm 정도 되었을 때, 담배거세미나방의 유충 (2령~3령)을 개체별로 5마리씩 접종하였고 접종 1주 후에 가해 정도를 조사하였다. 형질전환 식물체 35개체 중 유충의 생존율, 피해엽율, 피해엽수가 적은 계통 3계통을 선발하였다 (표 2).
- Probe DNA는 RediprimeeU labeling system (Amershatn-pharmacia)을 이용하여 제조회사의 지침에 따라 [a-32P] dCTP로 표지하였다. 반응 후 membrane을 65℃ 에서 2x SSC, 0.1% SDS용액으로 10분 lx SSC, 0.1% SDS용액으로 15분 세척한 후, 상온에서 0.2x SSC, 0.1% SDS 용액으로 5분 0.2x SSC용액으로 1분간 세척한 후 -70℃ 에서 3~4일간 x-ray film에 노출시켜 확인하였다.
- 재분화 배지로 이식된 절편체는 25℃에서 3일간 암배양한 다음, 멸균수로 세척한 후 kanamycin 10 mg/L와 cefotaxime 400 mg/L 가 첨가된 재분화 배지로 이식하여 암배양 하였다. 배양 8주 후 재분화된 신초를 kanamycin 20 mg/L와 cefotaxime 400 mg/L가 첨가된 배지에 이식하여 2차 선발을 하였으며, 배양 4주 후 2차 선발배지에서 생존한 개체는 kanamycin 20 mg/L와 cefotaxime 400 mg/L가 첨가된 MS 배지에 이식하여 발근시켰다. 발근된 개체는 putative 형질전환체로 유전자 분석을 위하여 2 g/L의 활성탄이 첨가된 MS 배지에서 유지하였다.
- 0 가 되도록 동일조건에서 재배양하였다. 배양액을 6,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 버리고 acetosyringone(3',5'-dimethoxy4'- hydroxyacetophenone) 100 μM이 첨가된 MS 액체배지와 혼합하여 spectrophotometer를 이용하여 Agro-bacterium의 농도가 O.D660 0.8~ 1.0이 되도록 조절하였다. 엽절편체 (5 mm × 5 mm)를 MS배지에 있는 Agrobacterium 배양체와 10분간 접종한 다음, 멸균된 filter paper에서 여분의 Agrobacterium을 제거한 후 재분화 배지 (MA + 1.
- 접종 후 형질전환체 선발에서 1 차 선발은 재분화 배지에 10 mg/L kanamycin과 400 mg/L cefotaxime이 첨가된 배지에서, 2차 선발은 20 mg/L kanamycin 과 400 mg/L cefotaxime이 첨가된 배지에서 선발하였으며, 발근은 MS 기본배지에 20 mg/L kanamycin과 400 mg/L ceftrtaxime이 첨가된 배지에서 수행하였다. 배양은 1차 선발과정은 암상태에서, 2차선발 및 발근선발은 명상태에서 진행하였으며, 배양은 온도 25±2℃ 로 조절되는 배양실에서 40μmol·m-2·s-1로 조명하면서 배양하였다.
- 국화actin에 대한primer sequence는 forward, 5-ACATGCTAT CTTGCGTTTGG-3'와 reverse, 5'-CTCTCACAATTTCCCGnCA-3'로 합성하였다. 비형질전환체 식물체를 선택하여 도입 유전자의 lx 발현을 나타내도록 표시하였다. 두 단계로 PCR이 수행되었다.
- 절편체는 8주간 생육한 모식물체 신초의 제 2~3엽을 채취하였으며, 잎을 엽맥을 중심으로 5 mm 정도의 사각으로 잘라 Agro- bacterium에 접종하였다. 엽절편에서 신초의 재분화는 MS 기본배지에 sucrose 30 g/L, BA 1.0 mg/L 및 IAA 0.5 mg/L가 첨가된 배지를 사용하였다. 접종 후 형질전환체 선발에서 1 차 선발은 재분화 배지에 10 mg/L kanamycin과 400 mg/L cefotaxime이 첨가된 배지에서, 2차 선발은 20 mg/L kanamycin 과 400 mg/L cefotaxime이 첨가된 배지에서 선발하였으며, 발근은 MS 기본배지에 20 mg/L kanamycin과 400 mg/L ceftrtaxime이 첨가된 배지에서 수행하였다.
- 0이 되도록 조절하였다. 엽절편체 (5 mm × 5 mm)를 MS배지에 있는 Agrobacterium 배양체와 10분간 접종한 다음, 멸균된 filter paper에서 여분의 Agrobacterium을 제거한 후 재분화 배지 (MA + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IAA)로 이식하였다. 재분화 배지로 이식된 절편체는 25℃에서 3일간 암배양한 다음, 멸균수로 세척한 후 kanamycin 10 mg/L와 cefotaxime 400 mg/L 가 첨가된 재분화 배지로 이식하여 암배양 하였다.
- 유전자 삽입여부를 확인하기 위하여 선발된 식물체와 대조구 식물체 (비형질전환체)에서 nptⅡ 유전자에 대한 PCR 분석을 실시하였다. nptⅡ 및 transgene primer PCR과 Southern blot 분석을 위한 genomic DNA는 DNeasy plant mini kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 제조회사의 지침에 따라 기내에서 성장한 식물체 엽에서 추출하였다.
- 5 mg/L IAA)로 이식하였다. 재분화 배지로 이식된 절편체는 25℃에서 3일간 암배양한 다음, 멸균수로 세척한 후 kanamycin 10 mg/L와 cefotaxime 400 mg/L 가 첨가된 재분화 배지로 이식하여 암배양 하였다. 배양 8주 후 재분화된 신초를 kanamycin 20 mg/L와 cefotaxime 400 mg/L가 첨가된 배지에 이식하여 2차 선발을 하였으며, 배양 4주 후 2차 선발배지에서 생존한 개체는 kanamycin 20 mg/L와 cefotaxime 400 mg/L가 첨가된 MS 배지에 이식하여 발근시켰다.
- 신초는 2%의 활성탄이 첨가된 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)에서 배양하였으며 8주 간격으로 계대배양하면서 재료를 채취하였다. 절편체는 8주간 생육한 모식물체 신초의 제 2~3엽을 채취하였으며, 잎을 엽맥을 중심으로 5 mm 정도의 사각으로 잘라 Agro- bacterium에 접종하였다. 엽절편에서 신초의 재분화는 MS 기본배지에 sucrose 30 g/L, BA 1.
- 5 mg/L가 첨가된 배지를 사용하였다. 접종 후 형질전환체 선발에서 1 차 선발은 재분화 배지에 10 mg/L kanamycin과 400 mg/L cefotaxime이 첨가된 배지에서, 2차 선발은 20 mg/L kanamycin 과 400 mg/L cefotaxime이 첨가된 배지에서 선발하였으며, 발근은 MS 기본배지에 20 mg/L kanamycin과 400 mg/L ceftrtaxime이 첨가된 배지에서 수행하였다. 배양은 1차 선발과정은 암상태에서, 2차선발 및 발근선발은 명상태에서 진행하였으며, 배양은 온도 25±2℃ 로 조절되는 배양실에서 40μmol·m-2·s-1로 조명하면서 배양하였다.
- cryIAc 유전자가 형질전환된 식물체는 초장이 약 30 cm 정도 되었을 때, 담배거세미 나방 (tabacco cutworm; Spodoptera litura)의 유충 (2령~3령)을 개체별로 5마리씩 접종하여 2반복하였으며 접종 1 주일 후에 가해 정도를 조사하였다. 조사방법으로는 개체에 생존한 유충수와 유충이 가해한 국화의 패해정도를 조사하였다. 패해정도에 따라 정도가 심한 것은 50% 가해, 중간 것은 30% 가해, 경미한 것은 10%가해한 것으로 계산하였다.
- Realtime PCRe MJ MINI OPTICON (BioRad, USA)를 사용하여 수행하였다. 증폭반응은 총량 20 ul에 10 ul의 2x DyNamo SYBR Green PCR Master Mix (FINNZYMES, Finland), 2 ul의 primer (최종 500 nM), 2ul의 cDNA를 혼합하여 최초 95 ℃에서 10분간 반응시키고, 95℃에서 30초와 57℃에서 30초, 72℃ 에서 30초간의 cycle을 40회하여 최종 72℃ 에서 10분간 증폭시켜 각 sample 당 2회 반복으로 실시했다. 각 유전자의 상대적 발현량 분석을 위하여 2(T) (-Delta Delta C)방법 (Livak and Schmittgen 2001)를 사용하였다.
- 추출하였다. 첫 번째 strand cDNA는 PrimeScript™ 1st strand cDNA synthesis kit (TAKARA, Japan)로 제조회사의 지침에 따라 DNase I (Promega, USA)를 처리한 1 ㎍의 총 RNA에서 합성하였다. Primer들은 program primer3 (Rozen and Skaletsky 2000)를 사용하여 제작하였다.
- 총 RNA는 RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Germany)로 제조회사의 지침에 따라 기내에서 생육중인 100 mg의 국화 잎으로부터 추출하였다. 첫 번째 strand cDNA는 PrimeScript™ 1st strand cDNA synthesis kit (TAKARA, Japan)로 제조회사의 지침에 따라 DNase I (Promega, USA)를 처리한 1 ㎍의 총 RNA에서 합성하였다.
대상 데이터
- 5 mg/L IAA)에서 1차 선발을 하였고, 재분화 배지에 20 mg/L kanamycin이 첨가된 배지에서 2차 선발을 하였으며, 20 mg/L kanamycin이 첨가된 MS 배지에서 3차 발근선발을 하였다. 3차 발근선발까지 69개의 신초 (1.6%)가 생존하여 발근하였다. nptⅡ primer로 PCR을 한 결과 그 중 36개의 신초 (0.
- 3차 선발배지에서 선발된 62개체로부터 DNA를 추출하여 nptⅡ primer로 PCR을 이용하여 kamanycin 저항성 유전자인 nptⅡ 유전자가 확인된 개체 36개체를 선발하였다. 선발된 36 개체는 다시 transgene을 증폭하도록 제작된 primer를 이용하여 PCR한 결과 35개의 개체에서 purified pCAMBIA2301 (positive control)과 같은 크기의 900 bp에서 밴드가 형성되었다 (그림 2).
- 형질전환하였다. cryIAc 유전자는 pCAMBIA2301 를 포힘하는 Agrobacterium C58C1 을 통하여 국화 'Linneker salmon' 에 도입하였다. Agrobacterium C58C1 을 접종한 후 엽절편을 10 mg/L kanamycin이 함유된 재분화 배지 (MS + 1.
- 형질전환에 이용하였다. cryIAc 유전자를 형질전환을 하기 위하여 binary vector pCAMBIA 2301 (CAMBIA, Australia, http://www.cambia.org)를 가지고 있는 disarmed Agro-bacterium tumefaciens strain C58C1 을 사용하였다. pCAMBIA 2301 plasmid는 선발 marker로서 neomycin phosphotransferase nptⅡ)유전자를 형질전환 유전자로는 cryIAc 유전자를, reporter geen으로서는 GUS 유전자를 포함하고 있었다.
- cryIAc 유전자를 형질전환하기 위하여 총 5,091 엽절편체가 실험에 사용되었다. 균주접종 후 엽절편체를 10 mg/L kanamycin이 함유된 재분화 배지 (MS + 1.
- cryIAc 유전자의 primer sequence는 forward, 5'-AAGAGTTCGCCAGGAACCAG- 3'와 reverse, 5'-TGCGAACAATGGGATAGCTG-3'로 합성하였다. 국화 actjn cDNA (GenBank accession no. AB205087)는 RT-PCR에 의하여 확인하였으며, 계속 대조구로 사용하였다. 국화actin에 대한primer sequence는 forward, 5-ACATGCTAT CTTGCGTTTGG-3'와 reverse, 5'-CTCTCACAATTTCCCGnCA-3'로 합성하였다.
- 재료로 사용하였다. 국화 모본에서 생육이 왕성한 신초를 채취하여 70% ethyl alcohol에 10초, 1.0% sodium hypo-chlorite (NaOCl) 용액에서 15분 동안 표면살균한 다음, 멸균수로 3회 세척하여 배양하였다. 신초는 2%의 활성탄이 첨가된 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)에서 배양하였으며 8주 간격으로 계대배양하면서 재료를 채취하였다.
- 순화용토는 vermiculite 1 : perlite 1이 혼용된 인공용 토를 사용하였으며, 6주간 순화하여 배양토 (부식토 40% + 밭흙 60%)가 담긴 직경 30 cm 화분에 정식하여 온실에서 재배하였다. cryIAc 유전자가 형질전환된 식물체는 초장이 약 30 cm 정도 되었을 때, 담배거세미 나방 (tabacco cutworm; Spodoptera litura)의 유충 (2령~3령)을 개체별로 5마리씩 접종하여 2반복하였으며 접종 1 주일 후에 가해 정도를 조사하였다.
- 식물체 재료는 재분화율이 높은 스프레이 국화 (Dendranthema grandiflorum Kitamura) 'Lineker Salmon'의 엽절편을 형질전환 재료로 사용하였다. 국화 모본에서 생육이 왕성한 신초를 채취하여 70% ethyl alcohol에 10초, 1.
- 0% sodium hypo-chlorite (NaOCl) 용액에서 15분 동안 표면살균한 다음, 멸균수로 3회 세척하여 배양하였다. 신초는 2%의 활성탄이 첨가된 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)에서 배양하였으며 8주 간격으로 계대배양하면서 재료를 채취하였다. 절편체는 8주간 생육한 모식물체 신초의 제 2~3엽을 채취하였으며, 잎을 엽맥을 중심으로 5 mm 정도의 사각으로 잘라 Agro- bacterium에 접종하였다.
- 유전자는 농업생명공학연구소에서 배추에서 추출한 cryIAc 유전자를 형질전환에 이용하였다. cryIAc 유전자를 형질전환을 하기 위하여 binary vector pCAMBIA 2301 (CAMBIA, Australia, http://www.
- 또한 cryIAc 유전자가 형질전환된 식물체는 초장이 약 30 cm 정도 되었을 때, 담배거세미나방의 유충 (2령~3령)을 개체별로 5마리씩 접종하였고 접종 1주 후에 가해 정도를 조사하였다. 형질전환 식물체 35개체 중 유충의 생존율, 피해엽율, 피해엽수가 적은 계통 3계통을 선발하였다 (표 2). cryIAc 형질전환체 대부분에서 도입형질이 발현되지 않았으며, 3계통에서만 도입유전자의 형질이 발현하였다.
이론/모형
- Membrane을 3시간 이상 pre-hybridization 시킨 후 표지된 probe DNA와 18-20시간 동안 65℃ 에서 혼성확 반응을 수행하였다. Probe DNA는 RediprimeeU labeling system (Amershatn-pharmacia)을 이용하여 제조회사의 지침에 따라 [a-32P] dCTP로 표지하였다. 반응 후 membrane을 65℃ 에서 2x SSC, 0.
- 증폭반응은 총량 20 ul에 10 ul의 2x DyNamo SYBR Green PCR Master Mix (FINNZYMES, Finland), 2 ul의 primer (최종 500 nM), 2ul의 cDNA를 혼합하여 최초 95 ℃에서 10분간 반응시키고, 95℃에서 30초와 57℃에서 30초, 72℃ 에서 30초간의 cycle을 40회하여 최종 72℃ 에서 10분간 증폭시켜 각 sample 당 2회 반복으로 실시했다. 각 유전자의 상대적 발현량 분석을 위하여 2(T) (-Delta Delta C)방법 (Livak and Schmittgen 2001)를 사용하였다.
성능/효과
- 6%)가 생존하여 발근하였다. nptⅡ primer로 PCR을 한 결과 그 중 36개의 신초 (0.8%)가 putative transformant로 확인되었고, Southern 분석을 한 결과, 35개체 (0.8%)가 nptⅡ 유전자와 cryIAc 유전자를 가진 형질전환체로 확인되었다. cryIAc 유전자의 형질 전환율은 0.
- 5 mg/L IAA)에서 1차 선발을 하였고, 재분화 배지에 20 mg/L kanamycin이 첨가된 배지에서 2차 선발을 하였으며, 20 mg/L kanamycin이 첨가된 MS 배지에서 발근시켜 3차 선발을 하였다, 3차 발근선발까지 vector control과 cryIAc 유전자가 삽입된 construction에서 69개의 신초가 생존하여 발근하였다. nptⅡ primer로 PCR을 한 결과 그 중 36개의 신초가 putative transformant로 확인되었고 (그림 2), Southern 분석을 한 결과, 35개체가 nptⅡ 유전자와 cryIAc 유전자를 가진 형질전환체로 확인되었다 (그림 3). cryIAc 유전자의 형질전환율은 0.
- 8%의 escape가 발생하였다고 하였다. 본 실험 에서도 1차 선발된 신초가 2차 선발에서는 많이 고사하는 경향을 보였고, nptⅡ에 대한 PCR 과정에서 escape가 많이 발생하였다 (표 1).
- 1991). 본 실험에서도 1차, 2차 산발을 한 후발근선발 과정을 거침으로써 escape를 많이 줄일 수 있었다. 국화는 kanamycin에 매우 민감하여 품종에 따라 다르지만 보통 10-50 mg/L를 선발배지에 첨가한다.
- 8%로 양호하였다. 온실에서 담배거세미 나방에 대한 저항성을 검정한 결과, 3개체의 형질전환체가 저항성을 나타내는 것으로 확인되었다.
- cryIAc 유전자 가형 질전환된 식물체를 real-time PCR로 cryIAc 유전자의 단백질 발현량을 측정하였다. 형질전환된 식물체 대부분에서 cryIAc 유전자의 단백질 발현이 대조구보다 낮았으나, 형질전환체 B-3, B-21, B-53 식물체는 단백질 발현량이 대조구보다 월등히 높았다 (그림 4). 또한 cryIAc 유전자가 형질전환된 식물체는 초장이 약 30 cm 정도 되었을 때, 담배거세미나방의 유충 (2령~3령)을 개체별로 5마리씩 접종하였고 접종 1주 후에 가해 정도를 조사하였다.
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