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문제 정의
- 따라서 짧은 시간에 정량적인 분석이 가능한 방법이다. 게다가〔H-NW 정량법 (qNW)은 시료의 전처리가 간단하고, 표준물질의 표준검량곡선 등이 필요 없으며 혼합물 상태에서도 분석이 가능하다는 장점을 지니고 있다® 이전의 연구결과에서 사과주스 중에 들어있는 chlorogenic acid나'", 비타민 제제에 들어있는 은행잎의 ginkgolic2® 및 작약의 paeonifloiin을 NMR 측정용매 D2O에 바로 추출하여 1或NMR과 HPLC 정량분석의 비교 등의 연구가 발표되기는 하였으나2D, 아직 그 수는 적다 따라서 저자 등은 짧은 시간에 정량적인 분석이 가능한 방법인 ifl-NW과 기존의 H宜를 이용하여22劉 진피의 지표성분인 hesperidin의 좀 더 효율적인 분석방법을 제시하고자 본 硏究를 수행하였다
제안 방법
- ‘H-NMR (400 MHz) 은 Varian Unity Inova 400FT NMR spectrometer (California, USA)를 사용하여 즉정하였고, HPLC system waters 515 pump, UV/VIS detector, 717 auto sampler로 구성되어 있는 Waters HPLC system (USA)을 사용하였다.
- 1H-NMR 측정용 試料 조제는 분쇄된 試料 100 mg을 NMR 측정용 DMSOP 1ml로 실온에서 30분간 sonication하여 주줄한 뒤 주줄물을 0.45 Um PVDF filter로 여과하고 여과액 0.5 ml를 취한 뒤, 내부표준물질 dimethyl terephthalate를 1 mg 첨가하여 1H-NMR을 측정하였다.
- 측정하였다的. 1H-NMR을 이용한 정량분석에서는 peak의 integration 의 값이 항상 모든 화합물의 몰랄 농도에 비례하여 나타나기 때문에 화합물의 정량을 위한 검량선을 따로 작성할 필요가 없으나, 본 실험에서는 ifl-NMR을 이용한 정량법의 정확성을 확인하기 위하여 검량선을 hesperidin과 내부표준물질의 peak 면적의 비로 0.3125- 5.0000mg/ml의 범위에서 작성하여 Fig. 3에 나타내었다. Hesperidin의 함량은 다음의 식에 의해 구하였다却
- 2. 1H-NMR을 이용한 빠르고 간단한 定量 分析 方法 확립을 위해 진피의 hesperidin을 잘 용해시키는 용매인 DMSO-晶를 사용하여 抽出하여 시료 처리 시간을 단축하였다.
- Mean±standard deviation. All experiments were based on triplicate measurements.
- HPLC의 분석 조건은 UVMS Detector를 사용하여 280 nm에서 hesperidin peak을 검줄 하였으며, 이동상은 40% MeOH을 사용하였다. 분석용 컬럼은 YMC-Pack-ODS-AM (150x4.
- ifl-NW에서 확인된 결과를 확인하기 위해 기존의 hesperidin 정량방법으로 사용하는 HPLC 방법콰 비교하였다. 그 결과 1H-NMR spectra의 peak 면적 .
- 95 ppm 사이에서 관측되어 signal들이 잘 확인되었으나, 추출물의 XH-NMR spectrum 상에서는 다른 성분들의 signal과 분별이 어렵다. 그러나 rhamnose의 methyl기는 1.06 ppm에서 다른 signal과 분리되어 관측되므로 본 실험을 위해 가장 적당한 것으로 판단되어 이 signal을 이용하여 .정량분석하였다.
- 2는 hesperidin과 진피 추줄물의 NMR spectra data로 rhamnose의 methyl 기가 다른 signal들과 겹치지 않고 잘 분리되는 것을 확인할 수 있다. 그리고 내부표준물질로 사용한 dimethyl terephthalate는 5 3.88 (6H, s)과 5 8.08 (4H, s)에서 각각 관측되었고, 본 실험에서는 다른 signal들과 겹치지 않으면서 저자장에 나타난 methine signal을 선택하였다
- 이전의 연구 결과에서 1H-NMR 측정시 온도에 따른 0NMR spectra의 chemical shift와 integration 의 값에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였기에 본 실험에서는 25℃에서〔H-NW을 측정하였다的. 1H-NMR을 이용한 정량분석에서는 peak의 integration 의 값이 항상 모든 화합물의 몰랄 농도에 비례하여 나타나기 때문에 화합물의 정량을 위한 검량선을 따로 작성할 필요가 없으나, 본 실험에서는 ifl-NMR을 이용한 정량법의 정확성을 확인하기 위하여 검량선을 hesperidin과 내부표준물질의 peak 면적의 비로 0.
- 조제한 hesperidin 표준품의 용액을 각각의 농도별 (0.2, 0.1, 0.04, 0.02 mg/ml)로 표준액을 만들어 액체크로마토그래피법에 따라 분석하여 얻은 각 peak의 면적을 이용하여 검량선을 작성하였다.
- 진피의 주요 성분인 hesperidine DMSO에 잘 용해되므로 추출시간 단축을 위해 진피 건조분말을 NMR 측정용 DMSO-晶로 추출하였다. 이 추출물을 Ki-NMR을 즉정하여 Fig.
- 진피의 주요성분인 hesperidin의 정량분석을 위해 ^-NMR 및 기존의 H宜를 이용한 정량 분석에 관한 연구를 수행하였으며 그 결과는 다음과 같다.
대상 데이터
- 구입하였으며 . 대구한의대학교 본초학 실험실에서 동정한 후 사용하였고, 표품은 대구한의대학교한방식품약리학과 실험실(HFSL-0801)에 보관하였다.
- 실험에 사용한 진피는 대구 소재 한약재상에서 제주산을 구입하였으며 . 대구한의대학교 본초학 실험실에서 동정한 후 사용하였고, 표품은 대구한의대학교한방식품약리학과 실험실(HFSL-0801)에 보관하였다.
- 준비된 試料는 resolution 0.45 Hz, spectral width 4600.0 Hz (center of spectral width 5.02 ppm), acquiring time 2.5조, pulse width, 4.0 us, relaxation delay 1 초, temperature 25C, flip angle 90°로 64K data point의 signal을 128 scan하여 data를 얻었다. 내부표준물질 dimethyl terephthalate 의 phen이환에 치환되어 있는 4개의 methine기의 signale 8.
- 추출에 사용한 유기 용매는 HPLC«-(Merck Co, Darmstadt, Germany)을 사용하였으며, NMR 즉정에 사용한 DMSO-(4(99.9%)는 Merck의 제善을(Darmstadt, Germany), 標準品으로 사용한 hespeiidine Wako (Japan)로부터, 내부 표준물질 dimethyl terephthalate 는 Aldrich (St Louis, USA)에서 구매하여 사용하였다 (Fig. 1).
성능/효과
- 1. HPLC를 이용한 定量分析에서 진피의 hesperidin 의 함량은 5.15±0.12%로 나타났다.
- 3. 悟-NMR을 이용한 定量 分析 결과 진피의 hesperidin 함량은 5.33±0.06%로 나타났다.
- HELC 분석을 수행한 결과 진피의 주^분인 hesperidin 은 15.4 min에서 검출되었고, 추출물의 크로마토그램상에서 다른 peak와 확연히 분리됨이 보였다. 크로마토그램 상에서 hesperidin의 농도별 면적 평균값을 이용해 검량선에서 구하였고, 회귀직선 방정식에서 R2=0.
- 또한 ifl-NW 정량법에 의한 분석은 기존의 LC 분석을 위해 준비하는 시료 전처리 시간뿐 아니라, 실질적인 분석 시간도 현저하게 줄었으며, 반복 측정시 재현성, 간편성이 큰 것으로 나타났다. 또한 NMR 측정에서 이용 가능한 원소 중에서 질량수 1의 동위원소인 protone 천연존재 비가 99.98%로 질량수 13의 carbonT3이 1.108% 인데 비하여 매우 높으며, 자기화전비도 267.53으로 carbonT3에 비하여 4배 정도 높다. 따라서 분석시 1H-NWe carbon-13 등 주요 다른 원소에 비하여 감도가 매우 높고, 짧은 시간에 정량적인 분석이 가능하며 제품 중에 소량으로 함유되어 있는 활성 성분의 분석이 가능한 방법이다.
- 수 있을 것으로 판단된다. 또한 ifl-NW 정량법에 의한 분석은 기존의 LC 분석을 위해 준비하는 시료 전처리 시간뿐 아니라, 실질적인 분석 시간도 현저하게 줄었으며, 반복 측정시 재현성, 간편성이 큰 것으로 나타났다. 또한 NMR 측정에서 이용 가능한 원소 중에서 질량수 1의 동위원소인 protone 천연존재 비가 99.
- 본 실험 결과 岳-NW을 이용한 진피내의 hesperidin 정량실험은 1妃와 비교하여서도 정량 결과에 오차가 적었으며, 시료 전처리, 재현성, 간편성, 측정 시간 등여러 면에서 월등히 간편하고, 정확도와 감도가 매우 높은 것으로 나타났다. 앞으로 다양한 한약재의 유효성분 정량 및 분석에 NMR 정량법이 사용될 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로부터 〔H-NW을 이용한 진피의 hesperidin 의 정량 분석시 rhamnose 의 methyl 기 proton signal을 이용하는 것이 정확도가 높은 값을 얻을 수 있을 것으로 판단된다. 또한 ifl-NW 정량법에 의한 분석은 기존의 LC 분석을 위해 준비하는 시료 전처리 시간뿐 아니라, 실질적인 분석 시간도 현저하게 줄었으며, 반복 측정시 재현성, 간편성이 큰 것으로 나타났다.
- 이상의 결과로부터〔II-NW을 이용한 정량실험은 mlC와 비교하여서도 정량 결과에 오차가 적었으며, 시료 전처리, 재현성, 간편성, 측정 시간 등 여러 면에서 월등히 간편한 것으로 나타났다. 앞으로 정량분석뿐만 아니라, 수입 한약재와 국내산과의 비교, 지역 간의 유효성분의 함량 차이 비교 그리고 대사산물의 분석 등 다양한 분야에 1H-NW 정량법이 사용될 수 있을 것으로 사료된다
- 4 min에서 검출되었고, 추출물의 크로마토그램상에서 다른 peak와 확연히 분리됨이 보였다. 크로마토그램 상에서 hesperidin의 농도별 면적 평균값을 이용해 검량선에서 구하였고, 회귀직선 방정식에서 R2=0.99901 로 우수한 직선성을 나타내었다. 이 검량선을 이용하여 진피의 hesperidin 함량을 구하였고, 그 결과는 Table 1에 나타내었다
후속연구
- 것으로 나타났다. 앞으로 다양한 한약재의 유효성분 정량 및 분석에 NMR 정량법이 사용될 것으로 사료된다.
- 월등히 간편한 것으로 나타났다. 앞으로 정량분석뿐만 아니라, 수입 한약재와 국내산과의 비교, 지역 간의 유효성분의 함량 차이 비교 그리고 대사산물의 분석 등 다양한 분야에 1H-NW 정량법이 사용될 수 있을 것으로 사료된다
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