[논문]핵 염색을 이용한 세포사멸 유도물질 스크리닝의 조건 비교

이상한

doi:10.5352/jls.2008.18.9.1312

핵 염색을 이용한 세포사멸 유도물질 스크리닝의 조건 비교
Comparison of Conditions for Cell Death-Inducing Agents Using a High Throughput-Compatible Nuclear Staining Assay 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.18 no.9 = no.101, 2008년, pp.1312 - 1315

초록
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DAPI 염색을 이용하여 세포사멸 유도물질의 초고속스크리닝에 적합한 protocol을 제작하였다. Liquid handler에서 dispensing과 multilabel counter에서의 상대적인 fluorescent intensity를 측정하는 과정을 자동화한 protocol을 제작하였고, 이의 과정은 매우 효율적으로 가동되었음을 확인하였다. DAPI에 binding된 DNA의 intensity를 측정하는 조건검토에서 가장자리의 36개를 reading하지 않는 것이 edge effect를 줄일수 있는 것을 확인하였고, 0.1 sec reading으로 시간을 절약할 수 있었다. 이의 결과를 효과적으로 이용할 경우, 세포사멸 유도물질의 초고속스크리닝 또는 이에 적합한 스크리닝이 가능함을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

High throughput-drug screening plays a pivotal role for early stage of drug discovery process. In the course of assay development for screening of cell death-inducing agents, a protocol that is simple, time-saving, and high throughput-compatible was designed which was confirmed that the protocol can be worked by a HTS-compatible machine. In 96-well format, PC-3 cancer cells (1${\times}10^{4}$ cells/ml) were cultured for 24 hr. After 24 h-incubation with various medicinal plants extracts, the cells were then stained with DAPI for 30 min. The fluorescence intensity of the stained cells was measured semi-automatically with a multilabel counter. To test whether the present assay system effectively works, we screened about 850 medicinal plant extracts, and selected 1 positive crude extracts that contained cell death-inducing activity. These results suggest that the protocol is highly amenable to HTS implementation for a cell death-inducing agent(s).

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 핵염색에 사용되는 DAPI (4z, 6-diamino-2- phenylindole)를 이용하여, 초고속으로 적은 비용과 고효율로 세포사멸에 관계된 물질을 스크리닝 할 수 있는 변형된 방법을 고안하여 보다 단시간에, 적은 인력으로, 96 well plate에서 세포사멸을 초고속으로 검색 할 수 있는 기법을 고안하고자 하였다. 본 발명은 초고속 자동 검색을 DAPI염색으로 실시하였으며, 이를 고정하고 DNA와 binding된 DAPI는 양적 차이에 의하여 fluorescent intensity의 차이를 multilabel counter로 검출하였으며, 세포사멸에 관련된 물질의 초고속 스크리닝을 확인하였다.

가설 설정

(A) To examine whether reducing the edge effect, the plate was counted in 96 or 60 well plates. (B) Bottom reading is more sensitive to top reading in relative fluorescent intensity by DAPI staining. All plates were automatically measured by a multilabel counter in 0.

제안 방법

다음으로는 본 protocol로서 다량의 라이브러리로 스크리닝할 경우의 조건검토에 대하여 알아보았다, Multilabel counter를 사용한 실험의 조건검토에서는 Fig. 2에서 보듯이먼저 NCI-H₄₆0 세포를 seeding하여 24시간 배양한 뒤, DAPI 염색을 하여 intensity를 비교하였다. 96 well 전부를 counting 할 경우와 가장자리의 well (36개)을 제외한 60개의 well을 counting 할 경우를 비교한 결과, 60개의 well을 counting하였을 경우가 96 well 전부 counting하였을 경우보다 intensity에 있어서 standard deviation0] 훨씬 작은 값을 나타내었다(Fig.
하였다. 본 발명은 초고속 자동 검색을 DAPI염색으로 실시하였으며, 이를 고정하고 DNA와 binding된 DAPI는 양적 차이에 의하여 fluorescent intensity의 차이를 multilabel counter로 검출하였으며, 세포사멸에 관련된 물질의 초고속 스크리닝을 확인하였다.
, MO,USA)로 10분간 방치하면서 핵 염색을 하였다. 염색 후 OD460에 서 multilabel counter (Victor2z PerkinElmer, Turku, Finland)로 fluorescent intensity를 비교하였다.
이를 다시 24시간 배양한 후 4% formaldehyde로 각각의 cell을 고정하고 DAPI로 30분간 방치하면서 염색하였다. 염색 후 OD460에서 fluorescent in- tensity를 비교하는 protocol을 제작하였다. 이 protocol은 Fig.
Jena, Germany)로 시료를 각각 주입하였다. 이를 24 시 간 배 양한 후 4% formaldehyde로 각각의 cell을 고정 하고 DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole; Sigma Co., MO,USA)로 10분간 방치하면서 핵 염색을 하였다. 염색 후 OD460에 서 multilabel counter (Victor2z PerkinElmer, Turku, Finland)로 fluorescent intensity를 비교하였다.
감소하게 된다. 이를 이용하여 cytotoxicity를 측정할 수 있으므로, HTS 에 적합한 protocol을 작성하고자 liquid handler 에서 multilabel counter까지 일련의 과정 을 연속적으로 움직일 수 있는 protocol을 작성하였다. Fig.

대상 데이터

본 실험에 사용한 암세포는 prostate cancer cell line 인 PC-3 와 lung cancer cell line인 NCI-H₄₆0로 ATCC로부터 구입하였으며, 각 ampule로부터 활성화시켜 3・4회 계대배양하여 본 실험에 사용하였다. 세포배양에 사용된 배지는 RPMI-1640 (Cambrex, Walkersville, MD, USA)이 었고 모든 세포는 CO₂ incubator (Sanyo, Tokyo, Japan) 에서 배양하였다.

데이터처리

본 실험의 결과는 3회 이상 독립적으로 반복 실시하여 실험 결과를 평균±표준편차로 나타내었고, 실험군 간의 유의성을 검정 하기 위하여 SPSS 12.0 for windows program을 이용하였으며, 유의성이 있는 경우, ANOVA p<0.05수준에서 나타내었다.

성능/효과

2에서 보듯이먼저 NCI-H₄₆0 세포를 seeding하여 24시간 배양한 뒤, DAPI 염색을 하여 intensity를 비교하였다. 96 well 전부를 counting 할 경우와 가장자리의 well (36개)을 제외한 60개의 well을 counting 할 경우를 비교한 결과, 60개의 well을 counting하였을 경우가 96 well 전부 counting하였을 경우보다 intensity에 있어서 standard deviation0] 훨씬 작은 값을 나타내었다(Fig. 2A). Lundholt 등[14] 에 의하면 edge effect는 인류생물학이나 피부학 등에서 다양하게 나타나는 현상으로서 HTS의 assay에서도 온도구배, plate 상에 서 부분적 인흡수 특성에 의하여 생성되는 가시적인 저하현상이므로 seeding plate를 실온에서 1시 간 방치한 다음 CO₂ incubator 로 넣어서 배양시키는 방법이나, 가장자리의 36 well에 DW 나 buffer를 넣어서 실제로 실험에 사용하지 않는 방법이 실험결과의 신뢰도를 높일 수 있음을 검증하였다(결과미제출).
DAPI 염색을 이용하여 세포사멸 유도물질의 초고속 스크리닝에 적합한 protocol을 제작하였다, Liquid handler에서 dispensing과 multilabel counter에서의 상대적인 fluo rescent intensity® 측정 하는 과정 을 자동화한 protocol을 제작하였고, 이의 과정은 매우 효율적으로 가동되었음을 확인하였다. DAPI에 binding된 DNA의 intensity를 측정하는 조건검토에서 가장자리의 36개를 reading하지 않는 것이 edge effect를 줄일수 있는 것을 확인하였고, 0.
DAPI에 binding된 DNA의 intensity를 측정하는 조건검토에서 가장자리의 36개를 reading하지 않는 것이 edge effect를 줄일수 있는 것을 확인하였고, 0.1 sec reading으로 시간을 절약할 수 있었다. 이의 결과를 효과적으로 이용할 경우, 세포사멸 유도물질의 초고속스크리닝 또는 이에 적합한 스크리닝이 가능함을 확인하였다.
Cell-based assay의 경우는 bottom에 cell이 자라고 있기에 bottom reading0] 유리하고 enzyme-based assay의 경우는 top reading0] intensity 가 높을 것으로 추측된다. PC-3 세포를 이용한 DAPI assay 의 경우 reading time 에 따른 relative fluorescent intensity 비교에서는 0.1 sec reading과 1.0 sec reading의 fluorescent intensity에서 10배 정도의 차이를 보였는데 intensity에 큰 차이를 보이지 않으므로 0.1 sec reading으로 시간을 절약할 수 있음을 확인하였다(Fig. 2C). 따라서 이와 같은 조건을 이용하여 850여 개의 식물추출물을 사용하여 활성을 비교한 결과, 1개의 sample에서 활성이 95% 이상 저해하는 것을 발견할 수 있었으며 매우 선택적이며 간단하게 적은 비용으로 스크리닝할 수 있음을 확인하였다[12, 15].
2C). 따라서 이와 같은 조건을 이용하여 850여 개의 식물추출물을 사용하여 활성을 비교한 결과, 1개의 sample에서 활성이 95% 이상 저해하는 것을 발견할 수 있었으며 매우 선택적이며 간단하게 적은 비용으로 스크리닝할 수 있음을 확인하였다[12, 15]. 따라서 이 결과를 종합해 보면 본 liquid handler와 multilabel counter® 사용한 방법을 이용하여 향후 sample의 수를 늘리고 다른 cell line 을 사용하여 비교하는 실험을 병 행하는 1차 스크리 닝을 실시하고, 여기에서 선별된 샘플에 대하여 2차 스크리닝으로 Asp-Ghi・Val-Asp-AMC의 절단을 저해하는 assay와 cas- pase-3에 대한 기질의 분해정도를 western blot로 확인이 가능하리라 판단된다[1 이.
1)에 의 하여 자동으로 배 양한 lung cell을 4% form- aldehyde로 고정 하고 DAPI로 염색하였으며, 이 plate를 mul tilabel counter에서 상대적 인 fluorescence intensity를 측정할 수 있었다. 이 liquid handler를 사용할 경우 연속적으로 assay 가 가능하며, robotic arm에 의하여 조절되는 일련의 liquid handler와 multilabel counter까지의 처 리 속도가 빠르므로 시간 당 처리 속도는 2, 000 well 정도이며 하루 약 20, 000-40, 000 개 정도의 시료처리가 가능함을 확인하였다.
1과 같이 liquid han- dler의 program을 이용하여 protocol을 작성하였다. 이 pro- gram에 의해서 96 well에 서 고속액 체주입 기로 개 발된 proto col (Fig. 1)에 의 하여 자동으로 배 양한 lung cell을 4% form- aldehyde로 고정 하고 DAPI로 염색하였으며, 이 plate를 mul tilabel counter에서 상대적 인 fluorescence intensity를 측정할 수 있었다. 이 liquid handler를 사용할 경우 연속적으로 assay 가 가능하며, robotic arm에 의하여 조절되는 일련의 liquid handler와 multilabel counter까지의 처 리 속도가 빠르므로 시간 당 처리 속도는 2, 000 well 정도이며 하루 약 20, 000-40, 000 개 정도의 시료처리가 가능함을 확인하였다.
1 sec reading으로 시간을 절약할 수 있었다. 이의 결과를 효과적으로 이용할 경우, 세포사멸 유도물질의 초고속스크리닝 또는 이에 적합한 스크리닝이 가능함을 확인하였다.

후속연구

최근에 잘못 조절된 세포사멸이 cerebral ischemia, Huntington s disease, Alzheimer, s disease, amyotrophic lateral sclerosis(ALS) 및 Parkinson s disease와 같은 신경학적인 비정상 상태와 관련이 있는 것으로 알려져 있다[7]. 따라서 세포사멸에 관련된 단백질 분해효소의 활성을 조절할 수 있는 물질의 탐색은 상기의 질병을 치료할 수 있는 치료제의 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
따라서 이와 같은 조건을 이용하여 850여 개의 식물추출물을 사용하여 활성을 비교한 결과, 1개의 sample에서 활성이 95% 이상 저해하는 것을 발견할 수 있었으며 매우 선택적이며 간단하게 적은 비용으로 스크리닝할 수 있음을 확인하였다[12, 15]. 따라서 이 결과를 종합해 보면 본 liquid handler와 multilabel counter® 사용한 방법을 이용하여 향후 sample의 수를 늘리고 다른 cell line 을 사용하여 비교하는 실험을 병 행하는 1차 스크리 닝을 실시하고, 여기에서 선별된 샘플에 대하여 2차 스크리닝으로 Asp-Ghi・Val-Asp-AMC의 절단을 저해하는 assay와 cas- pase-3에 대한 기질의 분해정도를 western blot로 확인이 가능하리라 판단된다[1 이.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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