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문제 정의
- 이에 저자는 仙方活命飲 추출액을 처리하여 NF-활성억제를 통한 항염증작용, Th-2 세포분화억제 효과를 조사하여 항산화작용, 항알러지작용및 항염증작용에 대한 유의성 있는 실험적 연구결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 7 세포를 이용하여 NF.&B 활성과 염증세포 생산에관여하는 유전자의 발현 변화를 조사하였다. Th 2 세포분화 조절에 미치는 영향을 EL4 세포를 이용해 실험 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- RT-PCR kit (Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한후, IL-4 primei를 PCR machine으로 온도 조건에 따라 반응시켰다 (Table 2). PCR 산물은 1-2% agarose gel 상에서 전기 영동 하여 relative intensity로 측정하였다. 한편 RT-PCR의 정확성을평가하기 위하여 internal standard인 beta-actin의증폭을 동시에 실시하였다.
- 실시하였다. RAW 264.7 세포 - 5X10, cells/well을 6 well에 plating 하고 12시간 후에 lipopolysaccharide (lag /ml, Sigma)를 2시간 처리하여 NFmB 활성을유도한 후 SHE 추출물 0.5, 1.0, 1.5 그리고 2.0mg/ml을 농도별로 첨가하여 24시간동안 배양하였다. 이후 위에서 기술한 동일한 방법으로 iNOS와 COX-2 primer! 이용하여 mRNA 발현 양상을조사하였다.
- 배양한 EL4 세포의 RNA를 trizol reagent (Sigma)를 사용하여 주출한 다음 fluorometer (introgen, USA)로 RNA를 정량하였다. RT-PCR kit (Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한후, IL-4 primei를 PCR machine으로 온도 조건에 따라 반응시켰다 (Table 2). PCR 산물은 1-2% agarose gel 상에서 전기 영동 하여 relative intensity로 측정하였다.
- 실시하였다. The Phorbol-12-Myristate-13-Acetate (PMA)를 이용한 EL4 세포의 Th 2 skewed condition을 유발시켰다. EL4 세포 -5 x 105 cells/well을 6 well에 plating 하고 12시간후에 phorbol-12-myristate-13-acetate (Ing/ml, Sigma)를 1시간 처리하여 Th 2 skewed condition을 유발시켜 IL-4 mRNA 발현 증가를유도한 다음 SHE 추출물 0.
- SHE 2첩을 증류수 500 찌에 넣고 3시간동안 전탕한 후 여과하였다. 그 여액을 rotary evaporator를 이용하여 50ml으로감압노축한 후 동결 건조하여 사용하였으며, MTT assay 결과 SHE 추출물 10mg/ml까지는 세포 생존률의 변화가 일어나지 않아 0.5, 1.0, 1.5 그리고 2.0mg/ml를 첨가량으로 결정하였다.
- 염증유발유전자들을 조절하는 전사인 자 nuclear factor (NF)-cB와 염증 효소인 iNOS와 COX.2의조직내 분포를 조사하기 위해 항 nuclear factor (NF)- ic B p65 (l:500, Santa Cruz Biotec) 항체, 항 mouse anti-mouse iNOS (l:200, Santa Cruz Biotec) 항체 그리고 항 rabbit anti-mouse COX-2 (1*50, Santa Cruz Biotec) 항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
- 유전자 발현의 relative intensity 수치화를 위해 Optimas 5.2 (Optima Co., USA>를 이용한 영상분석 (image analysis)을 실시하였다.
- 이에 저자는 仙方活命飮의 항산화효과를 알아보기 위해 in vitro 실험으로 RAW264.7 cell을 이용하여 SHE추출물 농도에 따른 SOD활성변화를측정하였고, 항염증효과와 알레르기 반응인자를 알아보기 위해 NF-κB 활성에 관여하는 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현 변화를 조사하였다.
- 0mg/ml을 농도별로 첨가하여 24시간동안 배양하였다. 이후 위에서 기술한 동일한 방법으로 iNOS와 COX-2 primer! 이용하여 mRNA 발현 양상을조사하였다.
- PCR 산물은 1-2% agarose gel 상에서 전기 영동 하여 relative intensity로 측정하였다. 한편 RT-PCR의 정확성을평가하기 위하여 internal standard인 beta-actin의증폭을 동시에 실시하였다.
- 항산화능력을 측정하기위해 Riboflavin을 이용한활성산소 소거실험을 실시하였다. 우선 photocell 에 40mM buffer 2.
대상 데이터
- 구입하였다. 세포는 37t, 5% CO2 incubator에서 10% Fetal Bovine Serum (FBS; Sigma, USA) 이 함유된 Dulbeccds modified Eagle's medium (DMEM, USA)을 사용하여 배양하였다. 세포는 플라스크의 80% 정도 자랐을 때 hosphatebuffer saline (PBS) 로 씻어주고, Trypsin-EDTA (Gibco/BRL)를 처리하여 계대 배양하였다.
- 실험에 사용된 선방활명음(Sunbanghwalmyung-eum, 이하 SHE)은 동국대학교부속 한방병원에서 제조된것을 사용하였다 (Table 1). SHE 2첩을 증류수 500 찌에 넣고 3시간동안 전탕한 후 여과하였다.
- 실험에 사용한 생쥐 대식세포 (macrophage)인 RAW 264, 7 세포와 Th 2 세포 분화 실험에 사용한 생쥐 EL4 세포는 한국세포주은행 (KCLB; Kotea)에서 구입하였다. 세포는 37t, 5% CO2 incubator에서 10% Fetal Bovine Serum (FBS; Sigma, USA) 이 함유된 Dulbeccds modified Eagle's medium (DMEM, USA)을 사용하여 배양하였다.
데이터처리
- Abs 560nm에서 auiozero를 잡고 light box에서 1분 동안 조사한 후 흡광도를 측정하였다. 이 작업을 7번 반복하여 평균값을 계산하였다.
이론/모형
- Th 2 세포 분화의 주도적 역할을 하는 interleukin (IL)-4 mRNA 발현 양상에 미치는 영향을 조사하기 위해 역전사중합효소 연쇄반응법 (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 실시하였다. The Phorbol-12-Myristate-13-Acetate (PMA)를 이용한 EL4 세포의 Th 2 skewed condition을 유발시켰다.
- 염증효소인 induce Nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase (COX)-2의 mRNA 발현양상을 조사하기 위해 RT-PCR법을 실시하였다. RAW 264.
성능/효과
- 1. 仙方活命飮 추출물의 항산화 효율은 농도 의존적으로 증가하였다.
- 2. LPS로 NF-wB 활성이 유도된 RAW264.7 세포의 仙方活命飮 추출물 처리는 iNOS 그리고 COX-2 mRNA 발현을 억제하였다.
- 3. PMA로 유도된 EL4 세포에서 IL-4 mRNA 발현을 억제하였다.
- 7 세포에서 LPS 자극에 의한 COX-2 mRNA 발현도 증가하였는데, SHE 추출물처리 후 농도-의존적으로 발현이 감소되었다. SHE 추출물 처리 후 LPS 자극시 발현되는 C0X-2 mRNA 발현량에 비해 0.5mg/ml에서 6.1%, 1mg/ml 에서 22.7%, 1.5mg/ml에서 23.3%, 2mg/ml에서 44.7%가 감소하였다 (Fig. 3).
- 발현이 감소되었다. SHE 추출물 처리후 PMA 자극시 발현되는 IL-4 mRNA 발현량에비해 0.5mg/ml에서 2.3%, 1mg/ml에서 25.5%, 1.5 mg/ml에서 40.1%, 2mg/ml에서 52.5%가 감소하였다
- 자유라디칼에 대한지질과산화 반응은 SOD, catalase, GPx, GSH reductase 등의 반응에 의해 H2O2로 전환되고 이 H2O2는 catalase나 GPx에 의해서 무독한 HQ로전환된다고 알려져 있다. SHE 추출물에 의해 전환의 첫 번째 효소인 SOD활성 변화가 수반되는지 파악하기 위하여 세포독성의 유무에 따른 조건을 설정하여 SOD활성을 각각 측정 비교한 결과 SHE 추출물은 농도-의존적으로 항산화효능 증가를보였다.
- 본 실험결과 아1E추출물은 RT-PCR을 이용하여 EL4세포의 증가된 IL-4 mRNA 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다. 이는 알러지 반응상태를 나타내는 IL4를 SHE추출물이 억제하여 유의한 효과가 있다는 것을 보여준다.
- 본 실험에서는 RAW264.7 세포주에서 LPS자극에 의해 iNOS, COX-2 mRNA 발현을 증가시킨후 SHE 추출물을 투여했을 때 농도 의존적으로발현이 감소하였다.
- 7 세포에서 LPS 자극에 의한 iNOS mRNA 발현은 증가하였는데, SHE 추출물 처리후 농도-의존적으로 발현이 감소되었다. 아1E 추출물 처리후 LPS 자극시 발현되는 iNOS mRNA 발현량에 비해 0.5mg/ml에서 38.8%, 1mg/ml에서 56.4%, 1.5mg/ml에서 58.9%, 2mg/ml에서 77.3%가감소하였다 (Fig. 3).
- 2의 생성이 저해된다는 것을 본 실험에서 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 仙方活命飮은 NF-κB 활성 억제라는 항염증작용이 있으며, Th2세포 억제를 통한 알러지 반응에도 효과가기대된다고 할 수 있다. 그러므로 각종 알러지 및염증성 질환에 대하여 항균 및 항염증 작용의 강화를 목적으로 仙方活命飮을 응용할 수 있을 것으로 생각된다.
- 항산화능이 있는 仙方活命飮은 NF-kB 활성억제를 통해 RAW 264.7 세포에서 염증효소 iNOS와 COX-2 mRNA 발현을 억제하며, 조직내 iNOS와 COX.2의 생성이 저해된다는 것을 본 실험에서 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 仙方活命飮은 NF-κB 활성 억제라는 항염증작용이 있으며, Th2세포 억제를 통한 알러지 반응에도 효과가기대된다고 할 수 있다.
후속연구
- 이상의 결과로 仙方活命飮은 NF-κB 활성 억제라는 항염증작용이 있으며, Th2세포 억제를 통한 알러지 반응에도 효과가기대된다고 할 수 있다. 그러므로 각종 알러지 및염증성 질환에 대하여 항균 및 항염증 작용의 강화를 목적으로 仙方活命飮을 응용할 수 있을 것으로 생각된다.
- 이상의 결과로 仙方活命飮은 NF-kB의 활성억제를 통한 항염증작용을 하며 아울러 Th2 세포분화 조절에도 관여함으로 항알러지 효과도 기대되므로 추후 이에 따른 활용과 연구가 필요할 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.