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문제 정의
- 의 機能이 있는지를 確認하기 위해 제 !!형 콜라젠으로 DBA/1J 마우스에게 關節炎을 誘發한 후 關節炎 指數와 脾臟무게 및 콜라겐에 대한 antibody의 量을 觀察하고 桂枝의 消炎作用 을 in vitro 방법으로 Raw264.7 macrophage cell line을 이용하여 炎症性 사이토카인의 發顯을 實驗的으로 檢討한 바 有意한 結果 를 얻었기에 이에 報告하는 바이다.
제안 방법
- A)와 混合하여 농도가 1 mg/ml이 되도록 만들었다. 100 ㎕ 씩 마우스의 꼬리기시부에 皮內注射하였고 2차 接種은 3주후 같은 부위에 同量으로 皮內注射하였다.
- 2차로 type II collagen을 접종한 지 일주일부터 DBA/1J 마우스의 각 4개의 발(paw)에서 關節炎 徵候를 0=normal, l=swelling of one finger, 2=swelling of 2 or more finger, 3=swelling of heel, 4=joint deformity with ankylosis 으로 구분한 후 1주일 간격으로 기록하였다.
- Raw 264.7 macrophage세포에 LPS와 桂枝를 濃度別로 넣고 培養한 후 上層液의 TNF-a 양을 ELISA 방법으로 測定한 結果 15 ug/ml와 20 ug/ml에서 有意性 있게 減少하였다.
- 實驗動物은 5마리씩 각각 正常群(Normal group, Normal), 對照群 (Control group, Conh'ol) 및 實驗群 (Cinnamomum loureirii NEES group, CR)으로 분류하였다.
- 實驗에서는 桂枝알콜 抽出物을 이용하여 콜라젠으로 關 節炎을 誘發한 DBA/1J 마우스의 關節炎 緩和 效果를 알아보고 LPS를 처리한 Raw264.7 細胞에서의 抗炎效果를 알아보았다.
- 桂枝의 消炎效果를 확인하기 위해 macrophage cell line인 Raw 264.7細胞의 生存率을 보고 아울러 LPS를 처리했을 때의 TNF-a 양에 미치는 影響을 觀察하였다. Raw 264.
- 檢液은 免疫 誘發 1주전부터 실험종료까지 0.5 g/kg의 용량으로 7주간 일주일에 세 번씩 經口投與를 하였다. 正常群과 對照 群에게는 同量의 生理食鹽水를 投與하였다.
- 5 g/kg의 용량으로 7주간 일주일에 세 번씩 經口投與를 하였다. 正常群과 對照 群에게는 同量의 生理食鹽水를 投與하였다.
- )에 배 양하였다. 細胞 毒性 測定을 위해서 Raw 264.7 세포를 96-well에 각각 2×104 cells/well0] 되도록 seeding하고 24시간 동안 37'C, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 세포가 90%의 밀도가 되도록 성장한후 培養液을 교체한 후 桂枝 抽出物을 농도별로 각각의 well에 투여하였다.
- 關節炎을 일으킨 DBA/1J 마우스를 실험 종료가 되는 7주째에 마취시킨 후 心臟 採血을 하였고 곧바로 脾臟을 摘出하여 무게를 측정하였다. 응고된 血液은 遠心分離하여 血淸을 분리 한 후실험에 사용될 때까지 -20℃에 보관하였다.
- 7 세포를 96-well에 각각 2×104 cells/well0] 되도록 seeding하고 24시간 동안 37'C, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 세포가 90%의 밀도가 되도록 성장한후 培養液을 교체한 후 桂枝 抽出物을 농도별로 각각의 well에 투여하였다.
- 실험동물은 12시간 낮 12시간 밤의 생활리듬을 주었으며 恒溫 恒濕 상태에서 일주일간의 적응기간을 거친 후 실험에사용하였다. 사료는 방사선 滅菌처리한 실험동물용 사료를 정도산업(주)에서 구입하여 공급하였으며, 飮用水는 滅菌處理한 蒸溜 水를 사용하였다.
- 軟骨關節의 主要 構成成分인 제 !! 형 collagen 으로 關節炎이 誘發된 마우스에 桂枝를 投與하여 脾臟의 무게를 測定하고 血液 을 採取하여 anti-collagen type II antibody를 조사한 것과 Raw246.7 macrophage에 桂枝 알콜 抽出物을 投與하여 細胞毒性 과 TNF-a 量을 測定한 結果 다음과 같은 結論을 얻었다.
- 本 實驗 結果 桂枝 抽出物은 제 !! 형 콜라젠으로 誘導한 關節 炎에 대해 證狀緩和 效果를 나타내었고 LPS로 처리한 Raw264.7 세포에서 TNFct의 合成을 沮害하였다. 이상의 結果는 桂枝抽出物 이 류마토이드 關節炎 疾患의 治療에 有意性 있는 消炎效果가 있음을 證明하는 것이며 이러한 桂枝의 消炎效果는 臨床的으로 應 用할 수 있는 科學的 土臺를 마련한 것으로 思料된다.
대상 데이터
- Raw 264.7 세포를 10% fetal bovine serum (FBS)(Sigma, U.S.A)가 함유된 DMEM (GibcoBRL, U.S.A.)에 배 양하였다. 細胞 毒性 測定을 위해서 Raw 264.
- Raw264.7 macrophage cell line을 한국 세포주은행 에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 實驗動物은 생후 6주된 DBA/1J 雄性 마우스이며 滅菌狀態로 관리되어 온 것을 중앙실험동물(주)에서 구입하였다. 실험동물은 12시간 낮 12시간 밤의 생활리듬을 주었으며 恒溫 恒濕 상태에서 일주일간의 적응기간을 거친 후 실험에사용하였다.
- 실험동물은 12시간 낮 12시간 밤의 생활리듬을 주었으며 恒溫 恒濕 상태에서 일주일간의 적응기간을 거친 후 실험에사용하였다. 사료는 방사선 滅菌처리한 실험동물용 사료를 정도산업(주)에서 구입하여 공급하였으며, 飮用水는 滅菌處理한 蒸溜 水를 사용하였다. 사료와 飮用水는 충분히 공급하여 자유롭게 섭취 시켰다.
- 실험에 사용된 桂枝는 경희대학교 한약학과에 의뢰하여 베트남산 Ciimamomum loureirii NEES의 어 린 가지를 경동시 장에서 구입하여 감정한 다음 정선하여 사용하였다.
이론/모형
- Raw 264.7 細胞를 LPSQipopolysaccharide)와 桂枝를 동시에넣고 培養한 후 上層液의 TNF-a 양을 ELISA 방법으로 測定하였다. 그 結果 약을 처리하지 않은 군보다 10 ug/ml에서 22%, 15 ug/ml에서 44%, 20 ug/ml에서 64% 감소하였다.
- collagen으로 免疫 誘發後 6주째에 마우스의 血淸을 採血하여 IL-6의 양을 ELISA 방법으로 測定하였다. 正常群은 檢出되지않았으며 對照群은 202.
- 血淸의 interleukine-6 (IL-6) 와 上層液의 tumor necrosis facter-a (TNF-a)는 ELISA 방법에 의해 농도를 측정하였다. 먼저 96-well plate 의 각 well 에 capture antibody 를 4 ℃ 에서 overnight으로 coating하였다.
- 마우스 大食細胞인 Raw246.7 macrophage에 桂枝 알콜 抽出 物을 농도별로 처리한 후 細胞毒性을 MTS 방법으로 측정하였다. 桂枝는 10 ug/ml 농도에서는 79% (PV0.
성능/효과
- Anti-collagenU antibody를 免疫 誘發 6주째 採血하여 ELISA 방법에 의해 O.D값으로 測定한 結果 對照群은 1.574 ± 0.186 이었으며 桂枝 投與群은 1.250 ± 0.629 이었으며 統計的으로 有意性있게 減少하였다.
- Collagen 免疫誘發 後 6주째에 마우스의 脾臟 무게를 測定 한 結果 對照群은 324.0 ± 107.1 mg이었으나 桂枝 投與群은 172.0 ± 13.9 mg이었으며 統計的으로 有意性 있게 減少하였다.
- DBA/1J 마우스를 이용한 CIA 모델에서 免疫 誘發후 6주째마우스의 脾臟 무게를 測定한 結果 對照群예 비해 桂枝 投與群 의 脾臟무게가 有意하게 減少 하였다.
- DBA/1J 마우스를 이용한 CIA(collagen induced arthritis)방법을 이용하여 桂枝를 經口投與한 결과 關節炎 臨床 指數가 對 照群에 비해 顯著히 減少하였으나 統計的 有意性은 없었다.
- 7 細胞를 LPSQipopolysaccharide)와 桂枝를 동시에넣고 培養한 후 上層液의 TNF-a 양을 ELISA 방법으로 測定하였다. 그 結果 약을 처리하지 않은 군보다 10 ug/ml에서 22%, 15 ug/ml에서 44%, 20 ug/ml에서 64% 감소하였다.
- 또한 제 Ⅱ 형 콜라젠 에 대한 IgG anti-collagen antibody의 양을 비교해 본 結果 對照群의 경우 1.574 ±0.186 이었으나 桂枝 投與群은 1.25 ±0.629 이었으며 統計的으로 有意性있게 減少하였다. 이를 통해 桂枝는 콜라젠에 대한 B 세포의 抗體形成 反應 을 抑制하는 效能이 있음을 確認할 수 있었다.
- 629 이었으며 統計的으로 有意性있게 減少하였다. 이를 통해 桂枝는 콜라젠에 대한 B 세포의 抗體形成 反應 을 抑制하는 效能이 있음을 確認할 수 있었다. 대표적인 炎症性 cytokine의 하나인 IL-6 양을 血淸에서 確認한 結果 正常群은 檢 出되지 않았으며 對照群은 202.
- 7 세포에서 TNFct의 合成을 沮害하였다. 이상의 結果는 桂枝抽出物 이 류마토이드 關節炎 疾患의 治療에 有意性 있는 消炎效果가 있음을 證明하는 것이며 이러한 桂枝의 消炎效果는 臨床的으로 應 用할 수 있는 科學的 土臺를 마련한 것으로 思料된다.
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