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문제 정의
- 이 에 저자는 體減蒼苴仁湯 추출물의 항비 만 효과 기전을 조사하기 위하여 혈청의 중성지방, 콜레스테롤 함량을 조사하였다. 고지방 식이를 투여한 군에서 중성지방, 총콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 함량이 정상 식이를 한 군에 비하여 유의하게 증가하였으며, HDL-콜레스테롤 함량은 유의하게 감소하였다.
- 이에 본 연구는 體減蒼苴仁湯의 항비만 효과와 그 기전을조사하였다.
- 그러나 體 減蕙苴仁湯에 대한 기존의 연구가 체중과 체지방의 감량 효과에만 집중된 임상연구12,13,15)이거나 혹은 병태모델에서 체중 증가에대한 억제 효과가 보고되었으나14,16) 항비만 효과 기전에 대한 연구는 접하지 못하였다. 이에 저자는 원광대학교 익산한방병원에서 비만환자에게 사용하는 주요처방인 體減蒼苴仁湯의 항비만효과를 조사하기 위하여 고지방 식이로 유도된 비만 mice에 體 減蒼苴仁湯 추출물을 구강 투여한 후 항비만 효과를 관찰하였으며, 그 기전을 조사하기 위하여 지방합성, 지방분해와 관련된 유전자의 양을 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 52일간의 실험이 끝난 mice의 epididymal fat을 분리한 후무게를 측정하였다. 그 결과 體減蒼苴仁湯 추출물을 투여한 군은 28일째부터 통계적으로 유의한 감소를 보였으며 또한 5.
- 52일간의 실험이 끝난 mice의 혈액을 채취한 후 혈중에 존재하는 중성지방, 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤의 함량을 측정하였다. 고지방 식이를 투여한 군의 중성지방은 206.
- 있다27,29). Fig. 4A와 4B에서 나타났듯이 지방조직에서 지방합성 단계의 율속 제한 효소(rate-limiting enzyme) 인 fatty acid synthase (FAS) mRNA 발현을 real-time PCR 분석을 통하여 조사하였다. FAS는 지방조직에서 신생지방합성 (de novo lipogenesis) 과정에서 malonyl-CoA를 palmitate로 전환 시켜주는 율속 제한 효소30,31)로 알려져 있다.
- ND: normal diet group, n=10; HD: high fat diet group, n=10; HD+CETE: high fat diet mice treated by oral injection, 500 ㎎/㎏ body weight. mRNA levels of FAS (A), SREBP1 (B), HSL (C) and LPL (D) were measured by real time PCR in adipose tissue as described in 'Materials and Methods';. Values are mean±SD.
- 體減意茸仁湯 추출물의 체중 및 epididymal fat 무게의 감소효과에 대한 기전을 조사하기 위하여 지방조직에서 지방합성과 변, 해 관련된 유전자의 발현을 real-time PCR을 이용하여 조사하였다.
- 體減蒼及仁湯의 고지방 식이로 인한 체중증가에 대한 효과를 조사하기 위하여 500 ㎎/㎏의 體減蒼及仁湯 추출물을 52일동안 구강투여한 후 체중을 조사하였다. 고지방 식이를 투여한 군은 정상식이를 투여한 군에 비하여 28일부터 통계적으로 유의하게 체중이 증가하기 시작하였다.
- (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 그리고 1주일 동안 표준실험사료 (중앙실험동물(주)' Seoul, Korea)를 공급하여 실험실환경에 적응시켰다. Mice는 controlled condition (온도 20℃, 습도 50%, light cycle from 06:00 to 18:00 and dark cycle from 18:00 to 06:00)에서 사육되었으며, 실험과정 동안 자유롭게 물을먹을 수 있도록 하였다.
- 발현된 mRNA양은 LightCycler System software (Roche Ltd., Burgess Hill, UK)를 이용하여 p-actin에 대한 상대적인 양으로서 계산하였다. 실험에 사용된 FAS, SREBP1, HSL, LPL and β-actiri의 primer 염기 서열은 Table 3에 표기하였다.
- 반응이 끝난 후 13, 000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 침전물을 80% EtOH로 세척하였다. 세척된 RNA를 건조시킨후 DEPC가 처리된 20 ㎕로 녹이고 분광광도계에서 흡광도를측정하여 정량하였다.
- 3, 75 mM KC1, 3 mM MgCk)에 함유된 반응액으로 42℃에서 60분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 실시간 역전사 효소 중합 반응은 10배 희석한 cDNA에 역전사 효소가 포함된 2X SYBR-Green 완충용액 (Roche Diagnostics Ltd., Burgess Hill, UK) 를 반응시 켜 LightCycler rapid thermal cycler system (Roche Ltd., Burgess Hin, UK)을 이용하여 수행하였다.
- 역전사 반응은 total RNA (3-5, ㎕ oligo d(T)12-18 (1 ㎕), 2 ㎕ dNTP (10 mM), MMLV reverse transcriptase (200 U), DTT (10 mM), RNase inhibitor (1 ㎕;Promega Co., Madison, USA), 20 ㎕ 완충용액 (50 mM Tris-Cl pH 8.3, 75 mM KC1, 3 mM MgCk)에 함유된 반응액으로 42℃에서 60분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 실시간 역전사 효소 중합 반응은 10배 희석한 cDNA에 역전사 효소가 포함된 2X SYBR-Green 완충용액 (Roche Diagnostics Ltd.
- 공급하였다. 정상군(Normal)은 일반사료를 공급하면서 하루에 2번씩 saline을 투여하였으며/ high fat diet 투여군(대조군/ Control)은 일반사료 대신에 고지방 사료를 투여하였으며, 體減 意攻仁湯 추출물의 효과를 관찰하기 위한 군은 500 ㎎/㎏의 농도로 하루에 2번 09:00시와 21:00에 구강투여한 군으로 body weight 는 4일마다 측정하였으며, 52일 뒤에는 mice 를 decapitation하여 혈액샘플을 얻고/ epididymal fat을 분리하여무게를 측정하였다.
- 혈장 중 중성지방의 함량, 총콜레스테롤 함량, LDL-콜레스테롤 함량, HDL-콜레스테롤 함량은 각각 측정용 kit(Eiken Co., Tokyo, Japan)를 구입하여 spectrophotometer(Beckman Cotdter Inc., Philadelphia, USA)를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 3주령의 30마리 C57BL/6J male mice(20 ~25 g)를 중앙실험동물(주) (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 그리고 1주일 동안 표준실험사료 (중앙실험동물(주)' Seoul, Korea)를 공급하여 실험실환경에 적응시켰다.
- 고지방사료는 중앙실험동물(주) (Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였으며 그 조성은 다음과 같다(Table 2).
- Mice는 controlled condition (온도 20℃, 습도 50%, light cycle from 06:00 to 18:00 and dark cycle from 18:00 to 06:00)에서 사육되었으며, 실험과정 동안 자유롭게 물을먹을 수 있도록 하였다. 실험에 사용한 體減蒼攻仁湯은 원광대학교 익산 한방병원에서 처방을 받아후 한의과대학 본초학교실에서 검증을 받은 후 사용하였다. 실험에 사용한 體減蒼及仁湯의구성은 다음과 같다(Table 1).
데이터처리
- 실험 결과는 mean±SD로 표시하였으며 유의성의 검정은 one-way ANOVA test (Microcal Origin, version 6.0, Microsoft, USA)에 의하였으며 p< 0.05인 것만 유의한 것으로 하였고, Duncan 사후분석법을 통해 비교했다.
이론/모형
- Epididymal fat 으로부터 total RNA 의 분리는 Trizol reagent(Life Technologies Inc., Gaithersburg, USA)를 이용하여제조회사가 제공하는 방법에 따라 수행하였다. 각각의 조직 100 mg을 작은 조각으로 자른 후 500 ㎕ RNAzol B로 용해시킨후 50 ㎕ chloroform을 첨가하여 얼음속에서 5분 동안 반응시켰다.
- 역전사 반응(reverse transcription reaction)은 3-5 p, g total RNA와 reverse transcriptase(MMLV; GIBCO BRL, Gaithersburg, USA)를 이용하여 제조회사에서 제공하는 방법에 따라 수행하였다. 역전사 반응은 total RNA (3-5, ㎕ oligo d(T)12-18 (1 ㎕), 2 ㎕ dNTP (10 mM), MMLV reverse transcriptase (200 U), DTT (10 mM), RNase inhibitor (1 ㎕;Promega Co.
성능/효과
- 고지방 식이를 투여한 군은 정상식이를 투여한 군에 비하여 28일부터 통계적으로 유의하게 체중이 증가하기 시작하였다. 52일 후에 체중을 조사한 결과고지방 식이를 투여한 군은 32.65±2.0 g으로 9.91 ±1.56 g의 체중증가가 나타나 대조군에 비하여 유의한 증가를 나타냈다. 體減蒼 政仁湯 추출물을 투여한 군의 체중은 고지방 식이를 투여한 군에비하여 28일째부터 통계적으로 유의한 감소가 나타났다(Fig.
- 56 g의 체중증가가 나타나 대조군에 비하여 유의한 증가를 나타냈다. 體減蒼 政仁湯 추출물을 투여한 군의 체중은 고지방 식이를 투여한 군에비하여 28일째부터 통계적으로 유의한 감소가 나타났다(Fig. 1).
- 조사하였다. 고지방 식이를 투여한 군에서 중성지방, 총콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 함량이 정상 식이를 한 군에 비하여 유의하게 증가하였으며, HDL-콜레스테롤 함량은 유의하게 감소하였다. 이러한현상은 비만 병태 모델 또는 비만 환자에게서 나타나는 일반적인 현상으로 알려져 있다.
- FAS에 의해서 증가한 palmitate는 글리 세롤을 구성하고 있는 1, 2, 3번 탄소에 부착되어 중성지방이 형성되어 지방조직에서는 축적되고 간조직에서는 very low density lipoprotein (VLDL)의 형태로 혈중내로 방출된다꽤. 고지방 식이에 의해 유도된 비만 mice의 간과 지방조직에서 FAS mRNA 발현양은 정상 식이를 투여한 mice에 비하여 유의한 증가가 나타났으나, 體減蒼苴仁湯 추출물을 투여한군에서는 고지방 식이를 투여한 군에 비하여 유의하게 감소하였다(Fig. 4A).
- 측정하였다. 그 결과 體減蒼苴仁湯 추출물을 투여한 군은 28일째부터 통계적으로 유의한 감소를 보였으며 또한 5.85+0.67 g의 체중 증가가 나타났다(Fig. 2A).
- 그러나 고지방 식이와 500 ㎎/㎏ 농도의 體減蒼苴仁湯 추출물을 같이 투여한 군의 체중은 고지방 식이를 투여한 군에 비하여 유의하게 감소하였다. 그러나 정상 식이, 고지방 식이, 고지방 식이와 體減蒼苴仁湯 추출물을 같이 투여한 군의 먹이 섭취량은 유의한 변화가 나타나지 않았다(Fig.
- 2B). 또한 體減蒼苴仁 湯 추출물은 고지방 식이에 의한 epididymal fat 무게의 증가를유의하게 억제하였으며 체중 대비 epididymal fat의 무게 비율또한 유의하게 억제하였다(Fig. 2C, D).
- 또한 지방분해와 관련된 유전자로 알려진 HSL와 LPL의 발현 정도를 조사한 결과 고지방 식이를 투여한 군은 대조군에 비하여 각각 0.22+0.06, 0.98±0.23배로 나타났으나 體減蒼苴仁湯 추출물을 투여 한 군은 각각 1.23±0.38, 1.82±0.32배 증가하여 고지방식이를 투여한 군에 비하여 유의한 증가를 나타냈다(Fig. 4C, D).
- 3A). 또한고지방 식이를 투여한 군의 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 함량은 각각 186.3±20.3, 36.2+6.3, 69.3+8.3 mg/dL로 정상 식이를 투여한 군에 비하여 통계적으로 유의한변화를 나타냈으나 고지방 식이와 體減蒼苴仁湯 추출물을 같이투여한 군은 고지방 식이로 인한 콜레스테롤 함량을 통계적으로유의하게 개선시켰다(Fig. 3B, C, D).
- 먼저 지방합성과 관련된 유전자인 FAS와 SREBP1의 발현 정도를 조사한 결과 고지방 식이를 투여한 군은 대조군에 비하여 각각 3.48+0.87, 3.12±0.63배의 증가를 나타냈으나 體減蒼苴仁湯 추출물을 투여 한 군은 각각 0.97+0.28, 1.76±0.32배 증가하여 고지방식이를 투여한 군에 비하여 유의한 감소를 나타냈다(Fig. 4A, B).
- 최근 비만에 대한 연구가 많이 진행되고 있는데 특히 한약재 또는다른 물질의 항비만 효과 탐색을 위하여 고지방 식이를 이용한비만 모델이 많이 이용되고 있다%찌. 본 논문에서 고지방 식이를투여한 군의 체중은 정상 식이를 투여한 군에 비하여 유의한 증가를 나타냈으며(Fig. 1), 실험을 시작한 초기 대비 52일 후의 체중 증가 정도 역시 유의한 증가를 나타냈다(Fig. 2A). 이러한 결과는 다른 연구자들이 실험한 결과27-29)와 일치하였다.
- 본 연구에서 體減蒼苴仁湯 추출물은 60% 지방이 함유된 고지방 식이에 의한 mice의 체중 증가를 유의하게 감소시켰다. 최근 비만에 대한 연구가 많이 진행되고 있는데 특히 한약재 또는다른 물질의 항비만 효과 탐색을 위하여 고지방 식이를 이용한비만 모델이 많이 이용되고 있다%찌.
- SREBP1은 중성지방의 합성과 관련된 효소들 즉 acetyl-CoA carboxylase, FAS, microsomal triglyceride transfer protein의 발현을 조절하며36),SREBP2는 주로 세포내로 콜레스테롤의 흡수와 관련된 단백질/ 또는 콜레스테롤의 합성과 관련된 hycroxymethyl glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase) 와 LDL receptor 의 발현을 조절한다%). 본 연구에서 고지방 식이를 투여한 군의지방조직에서 SREBP1 mRNA 발현 정도는 대조군에 비하여 유의한 증가를 나타냈다(Fig. 4B). 그러나 고지방 식이와 體減蒼苴 仁湯 추출물을 같이 투여한 군에서는 고지방 식이에 의한 SREBP1 mRNA 발현이 유의하게 억제되었다.
- 이러한 결과는 體減蒼苴仁湯 추출물의 고지방 식이에 의한체중 증가에 대한 억 제 효과는 주로 epididymal fat의 지방 분해와 지방 합성의 불균형을 해소하여 이뤄짐을 유추할 수 있었다.
- 종합하면 體減蒼苴仁湯 추출물은 고지방 식이로 유도되는비만을 억제하였으며 그 기전에 지방합성과 관련된 유전자인 SREBP1 과 FAS의 발현 억 제, 지방분해와 관련된 HSL과 LPL의발현 증가가 관여하는 것으로 사료된다.
후속연구
- 촉진이 관여함을 시사한다. 앞으로 體減蒼苴仁湯 추출물의 TNF-ct의 분비 및 발현, perlipin의 발현 등에 대한 연규가 필요하리라 생각된다.
- 앞으로 본 논문을 기반으로 임상에서 비만 환자를 대상으로 體減蒼攻仁湯의 효과를 입증한다면 體減蒼攻仁湯 추출물이 항비만 제제 개발의 후보 물질이 될 수 있을 것이다.
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