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문제 정의
- 본 연구는 이미 방사선 방어효과가 우수한 면역증강 인삼 다당체를 대상으로 이의 생체내 효능을 대변할 수 있는 실험관내 시험 활성인자를 도출하고자 시도되었다. 기존의 효능과 최적 용량을 이미 연구자들이 확보하고 있었으므로 면역증강제의 활성을 대변하는 in vitro 3가지 검색법, 즉 임파구 증식능, 자연살해세포 활성능, 대식세포의 질소산화물 생성능과, 생체내 endogenous CFU-s assay를 사용하여 인삼 다당체 배치별 활성을 비교 검토하였다.
- 천연물을 대상으로 활성을 검색할 경우 재배, 채취, 건조 과정에서 다양한 요인들이 작용하여 성분과 함량에 영향을 미친다고 알려져 있으며 추출물에서 우수한 효과가 나타나 더라도 단일 물질로 분리하였을 때 활성이 소멸되는 경우가 흔히 보고되고 있다. 본 저자는 인삼으로부터 추출된 다당체가 다양한 면역증강효과를 나타낸다고 기 보고한 바 있으나[14,15] 그 활성의 정도가 항상 동일하게 재현되지는 않았으므로 이에 대한 원인을 규명하고자 우선 다당체의 성분분석을 시행하였다. 백삼 1 Kg씩을 무작위로 선정하여 상기 언급한 방법으로 인삼 다당체를 분리하였으며 이를 한 배치로 정하고 7번에 걸쳐 동일한 추출방법으로 시료를 제조하였다.
- 본 연구실에서도 인삼으로부터 면역증강활성이 우수한 다당체를 분리하여 임파구 증식 및 골수세포 증식작용, 다양한 싸이토카인 생성능, 대식세포 활성을 통한 항암작용, 방사선 방어효과 등을 보고한 바 있다[14,15]. 하지만 천연물 유래 활성물질은 천연물의 채취시기나 수확장소, 재배기간 등에 따라 활성이 많이 틀려지므로 본 연구에서는 방사선 보호효과 및 면역증강작용이 기 확보된 인삼 다당체를 추출 배치별로 실험관내 면역학적 활성 정도를 분석하는 한편, 생체내 방사선 보호효과를 측정하여 상관관계를 보이는 주요인자를도출함으로써 천연물 유래 물질의 방사선 방어효능을 예측할 수 있는 간단한 방법을 제시하고자 한다.
제안 방법
- Murine leukemia cell line인 YAC-1을 방사선 동위원소 Na2CrO4 200 μCi를 가하여 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 60분간 표지시킨 다음 5 x 104 cells/ml 로 농도를 고정하였다.
- 5M/L PMP-MeOH 용액 100 μl 를 가하여 70 ℃에서 30분간 반응시켰다. PMP(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone)를 CHCl3로 추출하여 제거하고 수용액층을 농축하여 HPLC(Agilent 1100 HPLC System, USA)로 분석하였다. 단당류 표준품으로는 D(+)-mannose (Man), L(+)-Rhamnose (Rha), D(+)-Glucose (Glu), D(+)-Galactose (Gal), L(+)-Arabinose (Ara), D(+)-xylose (Xyl), D-glucuronic acid (GluA), D(+)-Galacturonic acid (GalA), D(+)-Fucose (Fuc)를 사용하였으며 각각 100nM의 농도로 조제하여 상기와 같은 방법으로 PMP 유도체를 만들어 분석하였다.
- 본 연구는 이미 방사선 방어효과가 우수한 면역증강 인삼 다당체를 대상으로 이의 생체내 효능을 대변할 수 있는 실험관내 시험 활성인자를 도출하고자 시도되었다. 기존의 효능과 최적 용량을 이미 연구자들이 확보하고 있었으므로 면역증강제의 활성을 대변하는 in vitro 3가지 검색법, 즉 임파구 증식능, 자연살해세포 활성능, 대식세포의 질소산화물 생성능과, 생체내 endogenous CFU-s assay를 사용하여 인삼 다당체 배치별 활성을 비교 검토하였다. 구성당 분석을 통해 galactose 함량에 따라 시료를 선별하였으며 임파구 증식능을 측정한 결과 인삼 다당체 내 galactose 함량이 증가할수록 활성이 높게 나타났으며 (sam1>sam2>sam3) 시료간의 활성 차이도 통계학적 유의성이 나타났다.
- PMP(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone)를 CHCl3로 추출하여 제거하고 수용액층을 농축하여 HPLC(Agilent 1100 HPLC System, USA)로 분석하였다. 단당류 표준품으로는 D(+)-mannose (Man), L(+)-Rhamnose (Rha), D(+)-Glucose (Glu), D(+)-Galactose (Gal), L(+)-Arabinose (Ara), D(+)-xylose (Xyl), D-glucuronic acid (GluA), D(+)-Galacturonic acid (GalA), D(+)-Fucose (Fuc)를 사용하였으며 각각 100nM의 농도로 조제하여 상기와 같은 방법으로 PMP 유도체를 만들어 분석하였다.
- , Canada). 방사선 조사 후 9일째 경추 탈골로 마우스를 치사시킨 후 비장을 떼어내어 Bouin 용액으로 고정하고 육안으로 생성된 콜로니 수를 세었다.
- 배양한 상층액 50 μl 와 대조군으로 PBS 50 μl 을 각각 취하여 96 well-flat bottomed plate에 넣고 Griess reagent (1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethylenediamine dihydrochloride,2.5% phosphoric acid) 50 μl 을 가하여 5분간 실온에서 반응시킨 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하였다 (multiskan EX, Thermo Labsystems).
- 본 저자는 인삼으로부터 추출된 다당체가 다양한 면역증강효과를 나타낸다고 기 보고한 바 있으나[14,15] 그 활성의 정도가 항상 동일하게 재현되지는 않았으므로 이에 대한 원인을 규명하고자 우선 다당체의 성분분석을 시행하였다. 백삼 1 Kg씩을 무작위로 선정하여 상기 언급한 방법으로 인삼 다당체를 분리하였으며 이를 한 배치로 정하고 7번에 걸쳐 동일한 추출방법으로 시료를 제조하였다. 다당체를 구성하는 당 성분은 mannose, glucose, galactose, arabinose로 90% 이상이 glucose와 galactose로 구성되어 있었다 (표1).
- 인삼 다당체 시료를 100 mg/kg의 용량으로 마우스(5마리/그룹)에 복강 주사한 다음, 24시간 후 98 cGy/min의 조사율로 9 Gy용량의 60Co 감마선을 조사하였다 (60Co theraton-780, Atomic Energy of Canada, Ltd., Canada). 방사선 조사 후 9일째 경추 탈골로 마우스를 치사시킨 후 비장을 떼어내어 Bouin 용액으로 고정하고 육안으로 생성된 콜로니 수를 세었다.
- 임파구 증식능 실험에서는 T cell mitogen인 concanavalin A(Con A, 5μg/ml)와 B cell mitogen인 lipopolysaccharide(LPS, 10μg/ml)를 양성 대조군으로 사용하였으며 시료에 의한 임파구 증식능을 시료를 처리하지 않은 대조군으로 나눈 값(stimulation index, SI)으로 결과를 분석하였다.
- 5% phosphoric acid) 50 μl 을 가하여 5분간 실온에서 반응시킨 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하였다 (multiskan EX, Thermo Labsystems). 표준품으로는 아질산나트륨(NaNO2)을 사용하여 표준 용량 곡선을 작성하고 대상시료 처리에 의한 대식세포의 질소 산화물(Nitric oxide, NO2-) 생성량을 산출하였다.
- 이미 glucose로 이뤄진 β-glucan이 미생물과 yeast, 버섯 등으로부터 분리된 다당체로서 독성이 적으면서 항암, 면역증강, 항균 등의 광범위한 치료효과를 나타내는 것으로 많은 보고가 되어 있으므로[17], 본 실험에서 추출된 인삼 다당체 역시 glucose가 활성의 주요 성분인 것으로 생각되었다. 하지만, 표 1에서 보여지듯이 mannose나 arabinose에 비해 galactose의 함량이 상대적으로 높았으며 glucose와 galactose의 함량비가 배치별로 차이를 나타내므로, 인삼 다당체의 면역활성이 이와 연관성이 있을 것으로 생각되어 galactose 함량이 가장 높거나(sam1) 평균값 정도의 시료(sam2), 가장 낮은 시료(sam3)를 선정하여 활성비교 시험을 수행하였다.
- 활성화된 비장세포와 암세포의 비율을 100:1, 30:1 또는 10:1이 되도록 조정하여 96 well roundbottomed microplate (Corning, New York, USA)에 넣고 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 배양한 후 2,200 rpm에서 5분간 원심 분리하고 상층액 0.1 ml씩 취해 γ- counter로 측정하여 다음과 같은 식에 의해 % 세포 독성 (cytotoxicity)을 산출하였다.
대상 데이터
- 6-8주령의 암컷 Balb/c 마우스(20 ± 2g) 와 C3H/HeN 마우스(20 ± 2g)를 각각 대한 바이오링크 (대전)와 Charles River Breeding Laboratory (Charles River Japan, Inc., Atsugi Breeding Center, Yokohama, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
- 6년근 백삼(300 g/pack, 강원인삼농협)을 경동시장에서 구매한 다음 3배 량의 물로 4 ℃에서 추출하여 농축하였으며, 이 분획에 80% 에탄올을 가하여 다당체 침전물을 만들고 투석(막 크기 12,000)을 통해 내부분획을 획득, 정제하였으며 동결 건조하였다.
- RPMI1640에 5% Fetal Bovine Serum, 2x10-2M의 HEPES buffer, 2x10-3M glutamine, 1x10-3M pyruvate, 100U/ml penicillin과 50μg/ml streptomycin, 5x10-5M의 2-mercaptoethanol, 1% non-essential amino acid를 첨가하여 사용하였으며 모두 GIBCO BRL (Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다.
- 마우스 대식세포주인 Raw 264.7세포를 96 well-round bottomed plate에 2x105cells/well로 부착시킨 후 대상 시료를 처리하고 48시간 동안 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 배양한 상층액 50 μl 와 대조군으로 PBS 50 μl 을 각각 취하여 96 well-flat bottomed plate에 넣고 Griess reagent (1% sulfanilamide, 0.
데이터처리
- 실험결과는 mean ± SEM으로 나타내었고 one-way ANOVA를 이용하여 통계 처리한 후 신뢰구간(p value)이 0.01 및 0.05보다 작은 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- [16] 의 방법에 준하여 시료 (20mg)를 2MHCl로 산 가수분해한 다음 2M-NaOH로 중화하고 0.5M/L PMP-MeOH 용액 100 μl 를 가하여 70 ℃에서 30분간 반응시켰다.
- 임파구 살해 활성 실험은 4시간 51Cr 유리법을 이용하였다. 비장 세포를 24 well plate (Corning, New York, USA)에 1.
성능/효과
- 구성당 분석을 통해 galactose 함량에 따라 시료를 선별하였으며 임파구 증식능을 측정한 결과 인삼 다당체 내 galactose 함량이 증가할수록 활성이 높게 나타났으며 (sam1>sam2>sam3) 시료간의 활성 차이도 통계학적 유의성이 나타났다. AK세포 활성능 실험에서는 각 시료별 큰 차이가 나타나지 않았으며 대식세포 활성능 실험에서는 sam1, 2활성은 유사한 반면 sam3의 효능은 현저히 떨어지는 것을 확인하였다. 또한 생체내 방사선 방어효능 지표인 endogenous CFU-s의 결과를 보면 galactose 함량이 높을수록 효능이 우수한 것을 알 수 있으며 sam3은 효과가 없는 것으로 나타났다.
- Sam1의 SI 수치는 119.7로 con A의 101.5나 LPS 59.88보다 높게 나타났으며(p<0.001) sam2는 71.69를 보인 반면 sam3은 SI 19.61로 대조군과 유의적인 차이를 보이지 않아 임파구 증식능이 거의 없는 것으로 나타났다 (그림 1).
- 구성당 분석을 통해 galactose 함량에 따라 시료를 선별하였으며 임파구 증식능을 측정한 결과 인삼 다당체 내 galactose 함량이 증가할수록 활성이 높게 나타났으며 (sam1>sam2>sam3) 시료간의 활성 차이도 통계학적 유의성이 나타났다.
- 따라서 대식세포의 활성지표로 질소산화물 생성을 측정하였으며, 그림 3과 같이 sam1과 sam2는 양성대조군인 LPS(10μg/ml)보다는 활성이 떨어지나 IFN-γ(50U/ml)와 거의 비슷한 수준으로, 전농도구간에서 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 p<0.001의 유의성을 나타내었다.
- AK세포 활성능 실험에서는 각 시료별 큰 차이가 나타나지 않았으며 대식세포 활성능 실험에서는 sam1, 2활성은 유사한 반면 sam3의 효능은 현저히 떨어지는 것을 확인하였다. 또한 생체내 방사선 방어효능 지표인 endogenous CFU-s의 결과를 보면 galactose 함량이 높을수록 효능이 우수한 것을 알 수 있으며 sam3은 효과가 없는 것으로 나타났다. In vitro 실험법에서 시료간의 정확한 우열 비교가 되어야 in vivo실험에서도 어느 정도 효과가 나타나리라 예측되므로 sam1과 sam2의 활성이 유사하게 나타난 AK세포나 대식세포 활성능 실험보다는 임파구 증식능 시험이 생체내 방사선 방어효능을 가장 잘 예측할 수 있는 면역학적 활성지표가 될 수 있을 것으로 사료된다.
- 면역세포의 수적인 증가 외에도 기능적인 면에서 암세포에 대한 세포살상효과가 증대되는 지를 확인하기 위하여 51Cr-released cytotoxic assay를 수행하였으며 sam1과 sam2는 거의 비슷한 수준의 종양세포 살상효과를 나타낸 반면 sam3은 상기 시료 대비 35%가량 활성이 감소되는 것을 확인하였다. Sam1은 비장세포: 표적암세포의 비율 30:1에서 대조군 대비 p<0.
- 본 연구에서도 이 방법을 도입하여 방사선 조사 24시간 전에 인삼 다당체 시료를 생쥐에 투여하고 9 Gy용량의 방사선을 조사한 다음 9일째 비장을 수거하여 콜로니 수를 확인한 결과, 중앙값을 기준으로 sam1과 sam2는 대조군 대비 각각 1.7배, 1.4배의 증가(p<0.001)를 나타냈다.
후속연구
- 또한 생체내 방사선 방어효능 지표인 endogenous CFU-s의 결과를 보면 galactose 함량이 높을수록 효능이 우수한 것을 알 수 있으며 sam3은 효과가 없는 것으로 나타났다. In vitro 실험법에서 시료간의 정확한 우열 비교가 되어야 in vivo실험에서도 어느 정도 효과가 나타나리라 예측되므로 sam1과 sam2의 활성이 유사하게 나타난 AK세포나 대식세포 활성능 실험보다는 임파구 증식능 시험이 생체내 방사선 방어효능을 가장 잘 예측할 수 있는 면역학적 활성지표가 될 수 있을 것으로 사료된다.
- 현재까지의 결과로는 실험관내 시험법에서 어느 수준 이상의 활성이 나타나야 동물실험에서의 효능을 확신할 수 있을지에 대한 해법은 제시하지 못하였으므로 추가적인 실험을 진행할 예정이다. 본 연구를 토대로 다양한 면역활성 물질들을 대상으로 여러 가지 검색법을 통해 실험하고 생체내 효능을 검증한 다음 가장 우수한 물질을 도출하는 다단계 검증 구조를 한 두 단계라도 줄일 수만 있다면 시간과 비용감소에 큰 도움이 될 것으로 생각한다.
- 신약의 후보 물질들을 발굴함에 있어 중요한 요인 중 하나가 어느 수준의 활성을 취하고 버릴 것인가 하는 기준점이라 할 수 있다. 현재까지의 결과로는 실험관내 시험법에서 어느 수준 이상의 활성이 나타나야 동물실험에서의 효능을 확신할 수 있을지에 대한 해법은 제시하지 못하였으므로 추가적인 실험을 진행할 예정이다. 본 연구를 토대로 다양한 면역활성 물질들을 대상으로 여러 가지 검색법을 통해 실험하고 생체내 효능을 검증한 다음 가장 우수한 물질을 도출하는 다단계 검증 구조를 한 두 단계라도 줄일 수만 있다면 시간과 비용감소에 큰 도움이 될 것으로 생각한다.
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