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문제 정의
- 이에 저자는 虛證의 氣血兩虛에 응용할 수 있는 歸脾湯이 다낭성 난소 증후군에 미치는 효과를 알아보고자 Estradiol Valerate(EV) 를 흰쥐에 근육 주사하여 다낭성 난소를 유발시킨 후 난소와 부신 및 자궁의 중량, 난소의 육안관찰 및 병리 조직학적 관찰, 난소 및 황체 수의 측정, 뇌, 뇌하수체, 부신 및 난소의 신경성장인자(NGF) 발현 차이와 corticotropin releasing factor(CRF) 면역조직화학적 검사를 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이에 저자는 기존의 다낭성 난소 증후군과 관련된 실험 논문들이 實證, 또는 虛實挾雜의 처방들을 활용한 연구였으며, 虛證으로 발생할 수 있는 다낭성 난소질환에 활용할 수 있는 처방에 관한 실험이 없었기에 氣血兩虛의 대표적인 처방인 歸脾湯이 다낭성 난소 증후군에 유의한 효과가 있는지 확인하고자 본 실험을 실시하였다.
제안 방법
- 분류하였다. EV 주사 8주 후에 부검하여 난소, 부신 및 자궁 중량 측정, 난소의 육안 및 병리조직학적 검사, 난포 및 황체 수의 측정, nerve growth factor(NGF) 및 corticotropin releasing factor(CRF) 면역조직화학적 검사를 실시하였다.
- Estradiol valerate(EV)(Sigma, USA)를 0.5 皿의 benzyl alcohol(Sigma, USA)에 용해시킨 후 sesame oil(Sigma, USA)에 20 mg/㎖의 농도로 혼합하고 이용액 0.2 ㎖를 1회 둔부 근육에 주사하여 PCO 를 유발시켰다.
- NGF 양성반응의 정도는 NGF에 염색된 세포의 수 및 염색강도를 기준으로 하였으며, 양성반응이 관찰되지 않을 경우를 -, 미약한 양성 반응을 +, 중정 도의 양성반응을 ++, 강한 양성반응을 + + +로 표시하였다.
- 歸脾湯 4첩 분량(218 g)을 2,000 ㎖의증류수에 2시간 동안 침지 시킨 후, 2시간 30분간 전탕하였다. 전탕액을 원심하여 침천된 성분을 제거한 후 감압농축기(EYELA, NE-1001, Japan) 로 100 ㎖로 농축시켰다.
- 歸脾湯이 흰쥐의 다낭성 난소 (polycystic ovaries, PCO)에 미치는 영향을 확인하기 위해서 체중 190 g 내외의 암컷 흰쥐에 4 mg의 estradiol valerate(EV)를 근육 주사한 대조군, EV 주사와 더불어 歸脾湯 농축액을 8주간 경구 투여한 처치 군으로 분류하였다. EV 주사 8주 후에 부검하여 난소, 부신 및 자궁 중량 측정, 난소의 육안 및 병리조직학적 검사, 난포 및 황체 수의 측정, nerve growth factor(NGF) 및 corticotropin releasing factor(CRF) 면역조직화학적 검사를 실시하였다.
- 개체 당 한 쪽 난소를 일반적인 조직처리 과정을 거쳐서 파라핀 포매하고 5 ㎛의 박절 편을 만들어 Hematoxylin-Eosin(H&E) 염색하여 광학현미경하에서 일반적인 병리 조직학적 소견을 관찰하였다. 또한 각 난 소조직에서의 난포 수 및 황체의 수를 계수하였다.
- 고정 후 양측 난소, 부신 및 자궁을 적출하여 정밀화학저울 (AND GR-202, Japan) 로 무게를 측정하였다.
- 고정된 뇌조직의 정중융기 (median eminence) 부위의 시상단면을 만들어 일반적인 처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하고 5 ㎛ 두께의 박절편을 제작하였다. 탈 파라 핀 및 함수 과정을 거친 조직을 protinase K(10 ㎍/ml, Roche, Germany)에 20분간 처리하여 항원성을 부활시키고, 1% H2O2 용액에 1시간 처리하여 내인성 과산화 반응을 억제한 후 ABC kit(Vector Lab.
- 고정하였다. 고정된 조직을 일반적인 처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하고 5 ㎛ 두께의 박절편을 제작하였다. 탈 파라핀 및 함수 과정을 거친 조직을 citrate buffer(pH 6.
- 또한 각 난 소조직에서의 난포 수 및 황체의 수를 계수하였다. 난포의 수는 난모세포가 관찰되는 난포만을 대상으로 계수하였으며, 난포막이 형성되고 과립막세포가 중층으로 증식된 2차 난포, 난포동이 형성된 성숙난포, 난모세포의 변성 또는 과립 막 세포의 고사(apoptosis)가 관찰되는 폐쇄 난포를 각각 구분하여 계수하였다. 황체는 외난포막으로 뚜렷하게 둘러싸인 것만을 계수 하였으며, 황체의 경계가 불분명한 퇴화 중인 것은 계수에서 제외하였다.
- 뇌, 뇌하수체, 부신 및 난소를 적출하여 picric acid가 포함된 Zamboni 액에 12시간 고정하였다. 고정된 조직을 일반적인 처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하고 5 ㎛ 두께의 박절편을 제작하였다.
- 소견을 관찰하였다. 또한 각 난 소조직에서의 난포 수 및 황체의 수를 계수하였다. 난포의 수는 난모세포가 관찰되는 난포만을 대상으로 계수하였으며, 난포막이 형성되고 과립막세포가 중층으로 증식된 2차 난포, 난포동이 형성된 성숙난포, 난모세포의 변성 또는 과립 막 세포의 고사(apoptosis)가 관찰되는 폐쇄 난포를 각각 구분하여 계수하였다.
- 5)로 10분씩 3회 세척하였다. 반응이 종료된 절편을 DAB(Roche, Germany) 로 5분간 발색시키고 hematoxylin 으로 대조염색하여 광학현미경으로 CRF 양성반응의 정도를 확인하였다.
- 5)로 10분씩 3회 세척하였다. 반응이 종료된 절편을 DAB(Roche, Germany) 로 5분간 발색시키고 hematoxylin으로 대조염색하여 광학현미경으로 NGF 양성반응의 정도를 확인하였다.
- 부검하여 적출된 양측 난소를 육안으로 관찰하고 군별로 모든 난소를 사진 촬영 하였다.
- 실험개시일, 실험 후 2주, 4주, 6주 및 8주에 체중을 측정하였다.
- 실험종료일에 흰쥐를 ether로 마취하고 전혈을 심장을 통해서 채혈한 후 4% paraformaldehyde 액으로 관류고정 하였다. 고정 후 양측 난소, 부신 및 자궁을 적출하여 정밀화학저울 (AND GR-202, Japan) 로 무게를 측정하였다.
- 정중융기에서 CRF에 염색된 부위의 광선 투과도를 측정하고, 정상군에서 측정된 투과도의 평균을 100%로기준하여 대조군과 처치군의 투과도를 환산하여 양성반응의 정도를 표시하였다.
- 칼라영상분석기 (Media Cybernetics, Image-Pro Plus, USA)를 이용하여 정중 융기에서 CRF 양성 반응의 강도를 측정하였다. 정중융기에서 CRF에 염색된 부위의 광선 투과도를 측정하고, 정상군에서 측정된 투과도의 평균을 100%로기준하여 대조군과 처치군의 투과도를 환산하여 양성반응의 정도를 표시하였다.
- 고정된 뇌조직의 정중융기 (median eminence) 부위의 시상단면을 만들어 일반적인 처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하고 5 ㎛ 두께의 박절편을 제작하였다. 탈 파라 핀 및 함수 과정을 거친 조직을 protinase K(10 ㎍/ml, Roche, Germany)에 20분간 처리하여 항원성을 부활시키고, 1% H2O2 용액에 1시간 처리하여 내인성 과산화 반응을 억제한 후 ABC kit(Vector Lab., USA)를 이용하여 CRF 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 일차 항체인 rabbit anti-human CRF(Santa Cruz Biotechnology Inc.
- 고정된 조직을 일반적인 처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하고 5 ㎛ 두께의 박절편을 제작하였다. 탈 파라핀 및 함수 과정을 거친 조직을 citrate buffer(pH 6.0) 에 넣어 500 W 출력의 microwave 로 5분간 3회 처리하여 항원성을 부활시키고, 1% H2O2 용액에 1시간 처리하여 내인성 과산화 반응을 억제한 후 ABC kit(Vector Lab., USA)를 이용하여 NGF 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 일차 항체인 rabbit anti-mouse nerve growth factor (Chemicon International Inc.
대상 데이터
- 실험에 사용한 歸脾湯은 《方劑學》15) 에 의거하였으며, 약재는 세명대학교 한방병원에서 구입한 후 엄선하여 사용하였다. 처방의 내용과 1 첩당 분량은 Table 1과 같다.
- 체중 190 g 내외의 암컷 Sprague- Dawley계 흰쥐(샘타코, 한국)를 구입하여 온도 23±1℃, 습도 55±5%로 조정된세 명대학교 청정 동물사육실에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 전 실험 기간 동안 사료(제일제당, 한국)와 음수는 자유 섭취케 하였다.
데이터처리
- 측정된 항목의 결과에 대한 통계는 SPSS(SPSS 10.0 for Windows, USA)를이용하여 student's t-test를 실시하여 검증하였다.
이론/모형
- 다낭성 난소 (polycytic ovaries, PCO) 는 Brawer 등14)의 방법에 준하여 유발하였다. Estradiol valerate(EV)(Sigma, USA)를 0.
성능/효과
- 1. 체중(g)은 처치군(275±14)이 대조군 (253±8)보다 유의성 (p<0.01) 있게 증가되었다.
- 2. 난소 중량(mg)는 처치 군(75.8±16.7)이 대조군(37.4±6.7)보다 유의성 (p<0.001) 있게 증가되었다.
- 3. 성숙 난포 수는 처치군(3.6±1.2)이 대조군(1.5±1.5)보다 유의성 (p<0.01) 있게 증가되었다.
- 4. 폐쇄 난포 수는 처치군(8.0±3.1)이 대조군(18.6±6.0)보다 유의성 (p<0.01) 있게 감소되었다.
- 5. 낭성 난포 수는 처치군(0.5±0.5)이 대조군(2.3±1.3)보다 유의성 (p<0.01) 있게 감소되었다.
- 6. 황체 수는 처치군(6.1±3.9)이 대조군 (1.6±2.3)보다 유의성 (p<0.01) 있게증가되었다.
- 7. 난포 조직내 NGF 양성반응은 처치군이 대조군에 비해서 감소되어 나타났다.
- 난소 중량은 대조군이 정상군에 비해서 유의성 있게 감소하였으며, 처치군은 대조군에 비해서 유의성 있게 증가되었다(Table 3).
- 대조군에서는 많은 수의 간질세포, 난포 막과 과립막에서 강한 NGF 양성 반응이 확인되었다(Fig. 9 & 10).
- 감소를 보였다. 대조군은 실험 종료일까지 유의성 있는 체중의 감소를 보였으나 처치군은 대조군에 비해 실험 4 주부터 실험 종료일까지 유의성 있는 증가를 보였다. 이는 유 등12)의 연구에서와 같은 결과로, 사람의 다낭성 난소 증후군에서는 약 50% 정도에서 비만이 나타나는 현상1)과 비교되는 점으로 이에 대해서는 보다 정밀한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 대조군은 정상군에 비해서 2차 난포, 성숙 난포 및 황체 수가 유의성 있게 감소되었으며, 폐쇄 난포 및 낭성 난포는 유의성 있게 증가되었다.
- 대조군은 정상군에 비해서 실험 2주부터 실험 종료일까지 유의성 있는 체중의 감소를 보였다. 처치군은 대조군에 비해서는 실험 4주부터 실험 종료일까지 유의성 있는 증가를 보였다(Table 2).
- 낭성 난포의 벽은 1층 또는 2층의 얇은 세포로 둘러싸여 있었으며 강내에 변성된 탈락세포들이 산재해 있었다. 또한 난포 과립막 세포의 고사(apoptosis)가 진행된 폐쇄 난포의 소견이 빈번하게 관찰되었으며, 많은 부위에 난모세포의 변성이 동반된 폐쇄된 난포들이 집단을 이루고 있는 소견이 모든 예에서 관찰되었다(Fig. 7).
- 있었다. 또한 성숙 난포와 황체 수는 대조군과 비교하여 유의성 있는 증가를 보였으며, 폐쇄 난포와 낭성 난포의 수는 유의성 있게 감소되었다. 이는 歸脾湯이 흰쥐의 다낭성 난소 발달을 억제하며 난소의 성장 발달에 유익한 영향을 미친 것임을 시사한다.
- 본 실험에서 정중융기의 CRF 양성반응은 대조군이 정상군에 비해 유의성 있게 증가되었다. 이는 EV에 의한 흰쥐의 다낭성 난소 형성에 스트레스가 관련이 있다는 것을 시사한다.
- 본 연구 결과 난소 조직내에서 NGF 양성 반응이 정상군에서는 드물게 보였고 대조군에서는 모든 부위에서 뚜렷한 양성 반응을 보였다. 이는 다른 연구들 11-13, 22)과 일치되는 소견으로 EV 가 난소조직 내의 NGF 과잉 생산에 의한 다낭성 난소 형성에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.
- 실험 종료 후 대조군은 심하게 위축되어 있는 난소와 많은 수의 낭이 육안적으로 관찰되 었고, 병 리 조직학적으로도 다양한 크기의 낭성 난포와 비정상적인 황체 및 난포가 확인되었으며, 2차 난포, 성숙 난포 및 황체 수도 유의성 있는 감소를 보였다. 이러한 결과는 EV의 투여로 흰쥐의 다낭성 난소가 성공적으로 유발되었음을 의미한다.
- 이상의 결과를 종합해 보면, 歸脾湯은 EV로 다낭성 난소를 유도한 흰쥐에서 난소의 NGF 발현을 줄임으로써 난포 및 황체의 성숙에 유의한 효과를 보였으며, 따라서 다낭성 난소 증후군의 치료에도 긍정적인 영향을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 성적을 토대로 할 때 歸脾湯은 EV로 유도된 흰쥐의 다낭성 난소에서 난포의 성숙을 유도하여 정상 배란을 촉진하는 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 자궁 중량은 대조군이 정상군에 비해 유의성 있게 증가되었으며, 처치군은 대조군에 비해 감소되었으나 유의성 있는 차이는 없었다(Table 4).
- 정상군, 대조군 및 처치군에서 뇌의 해마, 뇌하수체의 신경엽, 부신 피질에서는 NGF 양성 반응이 미약하고 드물게 관찰되었으며, 부신 수질에서는 중정 도의 양성반응이 확인되었다. 그러나 모든 군 간에 양성 반응의 빈도 및 강도에는 차이가 없었다.
- 정상군의 간질에서는 8예 모두에서 NGF 양성 세포가 드물게 산재되어 있었고, 난포막, 과립막 및 황체에서는 몇 예에서만 NGF 양성 반응이 관찰되었다.
- 처치군에서는 난소의 크기가 정상군과 비슷하거나 대조군에 비해 커져 있었고 병리 조직학적 소견에서도 성숙난포와 황체가 대조군보다 잘 발달되어 있었다. 또한 성숙 난포와 황체 수는 대조군과 비교하여 유의성 있는 증가를 보였으며, 폐쇄 난포와 낭성 난포의 수는 유의성 있게 감소되었다.
- 이는 다른 연구들 11-13, 22)과 일치되는 소견으로 EV 가 난소조직 내의 NGF 과잉 생산에 의한 다낭성 난소 형성에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다. 처치군에서는 대조군과 같은 부위에서 NGF 양성 반응이 확인되었으나 과립막, 난포막 및 황체에서의 양성 반응이 대조군에 비해 강도가 약하게 관찰되었다. 이는 歸脾湯이 난소의 과립 막, 난포막, 황체에서 NGF의 생산을 억제함으로써 난소낭종의 형성을 감소시키는 역할을 한다는 것을 의미한다.
- 처치군은 대조군과 같은 부위에서 NGF 양성 반응이 확인되었으나 과립막, 난포막 및 황체에서의 양성 반응은 대조군에 비해서 양성 반응의 강도가 약하게 관찰되었다 (Fig. 12).
- 처치군은 대조군에 비해서 성숙 난포 및 황체 수가 유의성 있게 증가되었으며, 폐쇄 난포 및 낭성 난포는 대조군에 비해서 유의성 있게 감소되었다(Table 5).
- 칼라영상분석기를 이용하여 반응의 정도를 측정한 결과, 대조군의 CRF 발현 비율은 정상군에 비해서 유의성 있게 증가되었다. 처치군은 대조군에 비해서 감소되었으나 유의성은 없었다(Fig.
후속연구
- 대조군은 실험 종료일까지 유의성 있는 체중의 감소를 보였으나 처치군은 대조군에 비해 실험 4 주부터 실험 종료일까지 유의성 있는 증가를 보였다. 이는 유 등12)의 연구에서와 같은 결과로, 사람의 다낭성 난소 증후군에서는 약 50% 정도에서 비만이 나타나는 현상1)과 비교되는 점으로 이에 대해서는 보다 정밀한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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