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문제 정의
- Primaiy 알콜 사용과 마찬가지로 과량의 알콜 두입시 알콜에 의한 효소의 불활성화로 인하여 선이에스테르 반응은 정지된다. 본 연구에서는 Secondaiy 알콜을 두입함에 있어 일괄 두입법과 분할두입법(4회)을 통해 선환율에 미치는 영향을 알아보고자 실험을 실시하였다. Secondaiy 알콜로서는 2-propanol과 2-butan아을 이용하였으며, 리파제로는형태별 실험결과 가장 전환율이 우수한 것으로 나타난 Novozyme 435를 이용하였다.
- Non-aqueous 내질 내에서의 효소 활성도는 매질 내에 함유된 수분의 함유량에 따라 영향을 받는 깃으로 알려져 있다. 본 연구에서는 기질로서 돈지와 2- butanol, 효소로서 고정화된 Novozyme 435의 반응 혼합물에 소량의 수분을 첨가함으로써 수분 함유량이 효소 활성에 미치는 영향을 검토하였다. 이 반응은 총 반응 혼합물 대비 0~ 1.
- 본 연구에서는 유지 대비 6몰의 methanoK 사용함에 있어 1~6몰씩 동일한 양으로 분할하여 6시간동안 단계별 투입 횟수에 따라 선환율에 미치는 영향을 검토하고자 하였다. 실험에 사용한 효소는 Novozyme 435를 사용하였으며, 실험 걸과를 Fig.
- 효소의 함량이 전환율에 미치는 영향. 본 연구에서는 촉매로 이용되는 효소의 사용량이 선환율에 미치는 영향을 검토하고자 실험을 실시하였다. methanole 유지와 메탄올 몰비 1:6으로 하여 1시간 30분 마다 1.
- 본 연구에서는 현재 전량 폐기 처분되고 있는 피혁 제조 공정 중 발생하는 프레싱 스크랩으로부터 회수된 폐유지를 이용하여 전이에스테르화하는데 있어서 다양한 기원을 가지고 있는 고정화된 리파아제와 1, 2차 알콜을 이용하여 효소 촉매의 불활성화를 억제시키고 알카리 촉매공정의 문제점을 극복함으로써 에너지원인 바이오디젤 원료로 이용 가능한 제조방법을 제시하고자 하였다.
- 반응온도에 따른 전환율. 일반적인 효소 촉배반응에서의 반응속도는 일정 한계까지는 온도에 따라 증가하지만, 특정 온도 이상이 되면 단백질로 이루어진 효소가 열에 변성되어 온도가 증가하여도 효소의 활성도는 증가하지 않고 오히려 감소한다[13] 본 연구에서는 반응온도가 전환율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실험을 실시한 걸과를 Fig. 1에 나타내었다. Novozyme 435을 사용한 경우 반응온도 45Y에서 선환율이 극대점을 나타내었으며, 이때의 반응율은 68%였다.
제안 방법
- 2wt.% 의 범위에서 수분을 첨가하였고, 반응 온도는 45T로 하였으며, 효소 활성도를 감안하여 전환율을 12시간에서 측정하였다. 실험 걸과를 Fig.
- 250℃, 그리고 carrier gas로는 고순도헬륨을 사용하였다. detected FID(Flame Ionization Detector) 를 사용하였다. 분석용 시료 준비는 10 m/ 바이알에 시료 약 250 mg를 정확히 무게를 단 후, 피펫을 이용하여 메틸 헵타데카타노이트 용액 5 아을 넣어 용해한 후 가스크로마토그래피를 사용하여 분석하였다.
- 돈지 및 우지 선환율 비교. 돈지와 우지 사이의 선이에스테크의 차이점을 발견하기 위해서 알콜로서 2-butanol 이용하였으며, 촉내로는 고정화된 Novozyme 435를 이용하였다.
- detected FID(Flame Ionization Detector) 를 사용하였다. 분석용 시료 준비는 10 m/ 바이알에 시료 약 250 mg를 정확히 무게를 단 후, 피펫을 이용하여 메틸 헵타데카타노이트 용액 5 아을 넣어 용해한 후 가스크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. 에스테르 함량 측정 에스테르 함량(wt%) 은 다음 식으로 계산하였다.
- Secondaiy 알콜로서는 2-propanol과 2-butan아을 이용하였으며, 리파제로는형태별 실험결과 가장 전환율이 우수한 것으로 나타난 Novozyme 435를 이용하였다. 분할 두입 방법은 1시간 30분에걸쳐 1.5몰씩 4회로 분할하여 투입하였으며, 유지와 알콜의 몰비는 1:6몰로 하였다. Table 2의 걸과에서 Primaiy 알콜때와 마찬가지로 일괄두입법에 의한 방법보다는 분할두입법으로 할 경우에 선환율이 높게 나타남을 확인할 수 있었다.
- 효소를 이용한 유지의 에스테르화 반응. 알카리로 전 처리된 유지 (30 g, 33.9 mmol)와 효소, 알콜을 온도계와 냉각기가 장착된 삼구 플라스커 100 m/속에 넣은 후 반응온도 25~75P에서 25시간 동안 반응하였다. 알콜 투입방법으로는 유지 대비 6몰의 methan아을 사용함에 있어 6시간 동안 동일한 양으로 분할하여 1~6단계별 투입하였다.
- 유지의 지방산 조성분석. 알카리로 전처리된 돈지의 지방산구성 성분을 조사하기 위하여 바이오 디젤 제조 시 유지 지방산 조성으로 일반적인 포화 지방산인 라우린산, 아카키드산, 미리스틴산, 팔미트산, 스테라아르산 불포화 지방산인 올레산, 리놀산, 리놀렌산을 GO 이용하여 분석하였다. 시료 약 200 mg 를 정확하게 칭량하여 M-heptane 0.
- 9 mmol)와 효소, 알콜을 온도계와 냉각기가 장착된 삼구 플라스커 100 m/속에 넣은 후 반응온도 25~75P에서 25시간 동안 반응하였다. 알콜 투입방법으로는 유지 대비 6몰의 methan아을 사용함에 있어 6시간 동안 동일한 양으로 분할하여 1~6단계별 투입하였다. 지방분해 효소인 리파아제는 Novozyme 435, Lipase AK, Lipase PS, Lipase M을 사용하였으며, 각각의 고정화된 효소는 Lowry 방법을 이용한 분석을 통해 함유되어 있는 리파아제의 양을 동일하게 한 후 원료 대비 0-12% 투입하였다.
- 원료유지로부터 선이에스테르화 반응을 수행한후 효소를 여과하여 반응을 정지 시킨 시료는 진공 증류하여미반응 methanoK 제거한 후 클로로포름과 노르말 헥산의 용매로 추출한 다음 원심분리하면 글리세린이 분리된다. 용매 추출한 상등액을 취하여 6(yc에서 클로로포름과 헥산을 진공 증류한 시료를 BROOKFIELD viscometer DV-II를 사용하여 상온에서 spindle number LV-1, ipm 60에서 점도를 측정 하였다. 점노계의 상태는 점도 표준물질(Fluid 50, BROOKFIELD viscosity standard, Brookfield engineering laboratories, Inc.
- 용매 추출한 상등액을 취하여 6(yc에서 클로로포름과 헥산을 진공 증류한 시료를 BROOKFIELD viscometer DV-II를 사용하여 상온에서 spindle number LV-1, ipm 60에서 점도를 측정 하였다. 점노계의 상태는 점도 표준물질(Fluid 50, BROOKFIELD viscosity standard, Brookfield engineering laboratories, Inc., MA, USA> 사용하여 교정하였다.
- 알콜 투입방법으로는 유지 대비 6몰의 methan아을 사용함에 있어 6시간 동안 동일한 양으로 분할하여 1~6단계별 투입하였다. 지방분해 효소인 리파아제는 Novozyme 435, Lipase AK, Lipase PS, Lipase M을 사용하였으며, 각각의 고정화된 효소는 Lowry 방법을 이용한 분석을 통해 함유되어 있는 리파아제의 양을 동일하게 한 후 원료 대비 0-12% 투입하였다.
- 피혁 제조 공정 중 발생하는 프레싱 스크랩으로부터 회수된 동물성 유지를 이용하여 lipase-catalyst 선이에스테르화 실험을 실시하였다. 실험 걸과, 반응온도 45, C에서 선환율이 극대점을 나타내었으며 , 반응온도 45℃ 이상에서는 선환율이 점차적으로감소되었다.
대상 데이터
- 250℃, detector temp. 250℃, 그리고 carrier gas로는 고순도헬륨을 사용하였다. detected FID(Flame Ionization Detector) 를 사용하였다.
- 표준 용액과 희석된 시료를 1 B 주입한 후 22(FC에서 15 min 동안 유지하였다. Gas chromatography 는 Hewlett Packard 6890Series를 사용하였으며, columne HP-INNOWAX(30 mx0.32 mm x 0.5 ㎛, Agilent Technologies, USA), Split mode injector는 100:1의 Split ratio, 감지기는 flame ionization detector(FID)를 사용하였다. 그리고 Carrier gas는 질소(1 mZ/min)를 사용하였다.
- 본 연구에서는 Secondaiy 알콜을 두입함에 있어 일괄 두입법과 분할두입법(4회)을 통해 선환율에 미치는 영향을 알아보고자 실험을 실시하였다. Secondaiy 알콜로서는 2-propanol과 2-butan아을 이용하였으며, 리파제로는형태별 실험결과 가장 전환율이 우수한 것으로 나타난 Novozyme 435를 이용하였다. 분할 두입 방법은 1시간 30분에걸쳐 1.
- 돈지 및 우지 선환율 비교. 돈지와 우지 사이의 선이에스테크의 차이점을 발견하기 위해서 알콜로서 2-butanol 이용하였으며, 촉내로는 고정화된 Novozyme 435를 이용하였다. 돈지및 우지의 반응 걸과를 비교하여 Fig.
- 고정화된 Lipase AK, Lipase PS 를 이용할 경우에는 25시간 반응 후에도 2-propanol 선환율 약 20%, 2-butanol 선환율 20~32%로서 내우 닞았으며, Lipase M의 경우 선환율을- 나타내지 않았다. 따라서 본 연구에서는 C. mtarctica%: 기원으로하는 Novozyme 435를 최적 효소 촉매로 선정하였다.
- Lipase 형태에 따른 전환율. 본 연구에서 알콜로는 유지와 혼화성이 우수한 2-propanol과 2-butanol을 이용하였으며, propyl 및 butyl 에스테르 선환율을- Fig. 4, 5에 나타내었다.
- 효소를 고정화한 가장 큰 이유는 값비싼 효소를 반복적으로 사용하기 위흐H서이다. 본 연구에서는 고정화된 효소를 반복적으로 사용할 때 선환율에 미치는 영향을 Fig. 9에 나타내었으며 알콜은 2- butanol을 이용하였다. 선환율은 2회 사용할 때 약간 감소하였으나 10회 반복 사용한 경우에도 선환율이 81% 정도로 유지되는 걸로 보아 재사용이 가능할 것으로 판단되었다.
- 실험재료. 실험에 사용된 지방분해 효소인 리파아제는 Candida antarctica 기원의 Novozyme 435를 Novo Nodisk사로부터 입수하였고 Pseudomonas fluorescens(Lipase AK), Pseudomonas cepacia(Lipase PS), Mucor javanicns(Lipase M) 는 Amano Pharmaceutical Company로부터 입수하였다. 유지는태성(주)에서 입수한 프레싱 스크랩을 단백질 분해효소인 프로테아제를 이용하여 단백질과 유지를 분리하여 회수한 후, 알카리로 전처리된 돈지를 이용하였으며, W2)돈지의 지방산 함량은 Table 1에 나타내었다.
- 따라 선환율에 미치는 영향을 검토하고자 하였다. 실험에 사용한 효소는 Novozyme 435를 사용하였으며, 실험 걸과를 Fig. 2에 나타내었다. 실험 걸과 초기 효소의 불활성화를 막기 위해서는 메탄올을 1.
- 실험에 사용된 지방분해 효소인 리파아제는 Candida antarctica 기원의 Novozyme 435를 Novo Nodisk사로부터 입수하였고 Pseudomonas fluorescens(Lipase AK), Pseudomonas cepacia(Lipase PS), Mucor javanicns(Lipase M) 는 Amano Pharmaceutical Company로부터 입수하였다. 유지는태성(주)에서 입수한 프레싱 스크랩을 단백질 분해효소인 프로테아제를 이용하여 단백질과 유지를 분리하여 회수한 후, 알카리로 전처리된 돈지를 이용하였으며, W2)돈지의 지방산 함량은 Table 1에 나타내었다. 그 외 시약은 시판 특급시약을 사용하였다.
이론/모형
- 시험방법의 원리는 KS H ISO 5508에 의한 내부교정 (Methyl heptadecanoate)에 따라 가스 크로마토그래피를 사용하여 시료에 존재하는 지방산 메틸에스테르의 % 함량을 측정하였다. 유지와 메탄올을 효소 촉매로 전이에스테르화한 후 효소를 여과하여 반응을 정지 시킨 시료를 진공 증류하여 미반응 methanol 을 제거하고 클로로포름과 노르말 헥산의 혼합용매로 추출한 다음 원심분리하면 글리세린이 분리된다.
- 지방산 메틸에스테르 함량 분석. 원료유지로부터 전이에스테르화 반응을 수행한 후 얻은 생산물 중의 지방산 메틸에스테르의 함량은 표준방법인 “지방 및 오일 유도체-지방산 메틸에스테르(FAME)-에스테르 및 리놀렌산 메틸에스테르 함량 분석 방법(KS M 2413: 2004)”에 의하여 분석하였다.
성능/효과
- 2wt.%에서의 선환율은 수분이 없는 상태에 비해 약 40%나 닞게 나타나 프레싱 스크랩으로부터 회수된 유지를 정제 공정을 거쳐 수분을 완벽하게 제거하는 것이 전환율을 높이는데 매우 중요한 인자임을 확인하였다. 고정화된 효소를 반복 사용 실험에서는 2회 사용할 때 약간 선환율이 감소하였으나 계속적으로 반복 사용할 때에는 전환율의 감소율이 둔화되었다.
- 있다.3) 알카리 촉내에 의한 바이오디젤 제조는 촉내 제거와 에너지 과다 소요, 다량의 폐수발생에 의한 2차 환경오염 유발 등이 주된 문제점으로 대두되었다. 또한 알카리 촉내에 의한 선이에스테르화의 경우 알카리 금속 촉매의 일부가 바이오디젤에 녹아수분을 흡수하면, 바이오디젤의 점성이 높아져 연료의 성능이떨어지는 문제점이 있다.
- 5몰씩 4회로 분할하여 투입하였으며, 유지와 알콜의 몰비는 1:6몰로 하였다. Table 2의 걸과에서 Primaiy 알콜때와 마찬가지로 일괄두입법에 의한 방법보다는 분할두입법으로 할 경우에 선환율이 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 독히 2-butanol 을 알콜로 사용할 경우에는 단일 두입에 의한 선환율이 40% 정도인데 반해, 분할두입에 의한 에스테르화의 경우 선환율이 85%로 큰 차이점을 발견할 수 있었다.
- %에서의 선환율은 수분이 없는 상태에 비해 약 40%나 닞게 나타나 프레싱 스크랩으로부터 회수된 유지를 정제 공정을 거쳐 수분을 완벽하게 제거하는 것이 전환율을 높이는데 매우 중요한 인자임을 확인하였다. 고정화된 효소를 반복 사용 실험에서는 2회 사용할 때 약간 선환율이 감소하였으나 계속적으로 반복 사용할 때에는 전환율의 감소율이 둔화되었다. 선이에스테르화 반응을 우지에도 적용한 걸과 선 환율에서 돈지 84%보다 높은 88%를 나타내었다.
- Table 2의 걸과에서 Primaiy 알콜때와 마찬가지로 일괄두입법에 의한 방법보다는 분할두입법으로 할 경우에 선환율이 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 독히 2-butanol 을 알콜로 사용할 경우에는 단일 두입에 의한 선환율이 40% 정도인데 반해, 분할두입에 의한 에스테르화의 경우 선환율이 85%로 큰 차이점을 발견할 수 있었다.
- % 에서의 선환율은 수분이 없는 상태에 비해 약 40%나 닞게 나타났다. 따라서 프레싱으로부터 회수된 유지를 정제 공정을 거쳐 수분을 완벽하게 제거하는 것이 전환율을 높이는데 매우 중요한 인자임을 확인하였다.
- 5몰 미만의 methanoK 두입하였을경우에는 오히려 선환율이 닞아지는 경향을 나타내었다. 또한 투입 단계를 증가시킬 경우 점도는 전환율과 반비례하여 감소하는 경향을 나타내었으며, 4단계를 초과하여 메탄올을 투입할 경우는 두입 시긴, 의 단축으로 인해 오히려 선환율이 닞아지고점도가 증가되는 경향을 나타내었다. 효소를 이용한 전이에스테크화 반응에서 가장 중요한 변수인 methanole 유지대비 1.
- 고정화된 효소를 반복 사용 실험에서는 2회 사용할 때 약간 선환율이 감소하였으나 계속적으로 반복 사용할 때에는 전환율의 감소율이 둔화되었다. 선이에스테르화 반응을 우지에도 적용한 걸과 선 환율에서 돈지 84%보다 높은 88%를 나타내었다. 이 반응에 의해 생성된 지방산 에스테르는 SOx를 발생시키지 않고, 내연 발생량이 최소화되는 바이오디젤로서 사용될 수 있을 것으로 사료되었다.
- 9에 나타내었으며 알콜은 2- butanol을 이용하였다. 선환율은 2회 사용할 때 약간 감소하였으나 10회 반복 사용한 경우에도 선환율이 81% 정도로 유지되는 걸로 보아 재사용이 가능할 것으로 판단되었다.
- 2%의 선환율을 나타내어 가장 효과적이었다. 수분 함유량이 증가할수록 선환율이 저하됨을 확인하였다. 1.
- 실험 걸과 Novozyme 435는 다른 종류의 효소에 비해 가장 높은 선환율을 나타내었으며, 이 반응은 2-butanol보다는 2- propanol에서 더 빠르게 진행되었다. 고정화된 Lipase AK, Lipase PS 를 이용할 경우에는 25시간 반응 후에도 2-propanol 선환율 약 20%, 2-butanol 선환율 20~32%로서 내우 닞았으며, Lipase M의 경우 선환율을- 나타내지 않았다.
- 2에 나타내었다. 실험 걸과 초기 효소의 불활성화를 막기 위해서는 메탄올을 1.5몰씩 4단계에 걸쳐 투입하는 것이 가장 높은 선 환율을 나타내었으며, 1.5몰 미만의 methanoK 두입하였을경우에는 오히려 선환율이 닞아지는 경향을 나타내었다. 또한 투입 단계를 증가시킬 경우 점도는 전환율과 반비례하여 감소하는 경향을 나타내었으며, 4단계를 초과하여 메탄올을 투입할 경우는 두입 시긴, 의 단축으로 인해 오히려 선환율이 닞아지고점도가 증가되는 경향을 나타내었다.
- 실험 걸과, 반응온도 45, C에서 선환율이 극대점을 나타내었으며 , 반응온도 45℃ 이상에서는 선환율이 점차적으로감소되었다. 초기 효소의 불활성화를 막기 위해서는 1.
- 10에 나타내었다. 실험걸과 84% 이상의 선환율을 나타내었으며, 돈지를 이용한 제조조건 최적화 실험을 통한 걸과가 우지에서도 동일한 걸과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
- 실험 걸과, 반응온도 45, C에서 선환율이 극대점을 나타내었으며 , 반응온도 45℃ 이상에서는 선환율이 점차적으로감소되었다. 초기 효소의 불활성화를 막기 위해서는 1.5몰씨 4 단계에 걸쳐 투입하는 것이 가장 높은 전환율을 나타내었으며, 1.5몰 미만의 methanol로 두입 단계를 4단계 초과하여 사용하였을 경우에는 오히려 선환율이 닞아지는 경향을 나타내었다. 종류가 다른 4가지의 리파제를 사용하여 돈지의 선환율에 미치는 영향을 실험한 걸과 C.
- 3에 나타내었다. 효소 활성화의 최적 온도 45Y에서 효소 사용량을 0~12%까지 변량 시켜 실험한 걸과 효소량이 증대될 수록선 환율이 증대되는 경향을 나타내었으며, Novozyme 435를 사용한 경우 10%에서 최대 선환율 82.2%를 나타내었다. 그 이외의 Lipase AK, Lipase PS를 사용한 경우 10.
- 또한 투입 단계를 증가시킬 경우 점도는 전환율과 반비례하여 감소하는 경향을 나타내었으며, 4단계를 초과하여 메탄올을 투입할 경우는 두입 시긴, 의 단축으로 인해 오히려 선환율이 닞아지고점도가 증가되는 경향을 나타내었다. 효소를 이용한 전이에스테크화 반응에서 가장 중요한 변수인 methanole 유지대비 1.5 몰의 단계적 두입 및 두입 시 1시간 30분 내의 긴격을 두고 두입하여야 기질내의 일정 농도 이상에서 효소 활성도를 떨어뜨리는 저해효과를 막을 수 있음을 확인하였다.
후속연구
- 선이에스테르화 반응을 우지에도 적용한 걸과 선 환율에서 돈지 84%보다 높은 88%를 나타내었다. 이 반응에 의해 생성된 지방산 에스테르는 SOx를 발생시키지 않고, 내연 발생량이 최소화되는 바이오디젤로서 사용될 수 있을 것으로 사료되었다.
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