[논문]Corynebacterium glutamicum에서 발현된 L-Threonine Aldolase를 이용한 파킨슨병 치료제 L-threo-2,3-Dihydroxyphenylserine (L-threo-DOPS)의 합성

백상호

Corynebacterium glutamicum에서 발현된 L-Threonine Aldolase를 이용한 파킨슨병 치료제 L-threo-2,3-Dihydroxyphenylserine (L-threo-DOPS)의 합성
Synthesis of L-threo-2,3-Dihydroxyphenylserine (L-threo-DOPS) by Thermostable L-Threonine Aldolase Expressed in Corynebacterium glutamicum R 원문보기

한국미생물·생명공학회지 = Korean journal of microbiology and biotechnology, v.36 no.2, 2008년, pp.128 - 134

초록
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Erro-prone PCR에 의해서 열안정성이 향상된 Streptomyces coelicolor A(3) 유래의 L-threonine aldolase를 Corynebacterium glutamicum R에서 과잉발현시키기 위하여 Corynebacterium용 vector plasmid인 pCRB1의 SD배열과 개시코든사이의 1염기를 제거한 고발현용 vector plasmid인 pCG-H44(2)를 구축하였다. pCG-H (2)에 의해서 형질전환된 C. glutamicum R 균주(CGH44-2)에서 L-TA를 발현시킨 결과, 기존의 Corynebacterium용 vector plasmid인 pCRB1(CGH44-1)보다 L-TA의 발현량이 높았다. L-threo-DOPS의 합성을 위한 최적조건은 $30^{\circ}C$, 0.1 M cirtric acid buffer(pH 7.0)이었으며, 0.1% TritonX-100를 첨가하였을 경우 보다 높은 활성을 보였다. 최적조건하에서 CGH44-2를 whole cell biocatalyst로 이용한 반복회분식반응에서 재조합대장균을 숙주로 이용한 경우보다 재조합Corynebacterium을 이용하였을 경우, 목적하는 L-threo-DOPS의 합성이 안정적으로 이루어졌다.

Abstract ▼ AI-Helper

In order to examine efficient L-threo-2,3-Dihydroxyphenylserine (L-threo-DOPS) synthesis process using whole cell biocatalyst, a thermostable L-threonine aldolase (L-TA), which cloned from Streptomyces coelicolor A3(2) and improved for stability, was expressed in a Corynebacterium glutamicum R strain. The constructed Corynebacterium expression vector, pCG-H44(1) successfully expressed L-TA in C. glutamicum R strain, but showed very low expression level. In order to improve the expression level, the expression vector named pCG-H44(2) was reconstructed by eliminating 1 nucleotide between SD sequence and start codon of L-TA. The pCG-H44(2) vector plasmid was able to overexpress L-TA approximately 3.2 times higher than pCG-H44(1) in C. glutamicum R strain (CGH-2). When the whole cell of CGH-2 was examined in a repeated batch system, L-threo-DOPS was successfully synthesized with a yield of 4.0 mg/ml and maintain synthesis rate constantly after 30 repeated batch reactions for 130 h.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

glutamicum R strain를 숙주로 L-TA 유전자를 이용한 L-threo-DOPS 합성 whole cell 생물반응기를 구축하고자 하였으나 예상외로 l-TA의 발현량이 낮아 효율성이 저하될 것이 예상되었다. 따라서 Corynebacterium 발현용 vector plasmid를 재구축함으로써 l-TA의 발현량을 향상시키고자하였다. Fig.
따라서 L-TA 유전자의 재조합 whole cell biocatalyst# 이용하여 lm/*o-DOPS를 효율적으로 생산하기 위해서는 더욱 안정한 재조합용 균주의 개발 에 대한 필요성 이 대두되었다. 따라서 본 연구에서는 S. coelicolor A3(2>유래의 L・TA를 이용한 효소적 합성법의 효율을 높인 공정을 개발하고자 열안정성이 확보된 L-TA 유전자의 Corynebacterium 발현시스템을 구축하였으며 이의 재조합 whole cell biocatalyst를 이용한 L-threo-DOPS 합성의 효율성에 대하여 검토하였다.

가설 설정

coelicolor A(3). A. Optimal temperature was determined in a temperature range from 20℃ to 50℃ for 25 h. B.

제안 방법

C. glutamicum R strain를 숙주로 L-TA 유전자를 발현시키기 위하여 lacP게 의한 유도발현계 vector plasmid를 구축하였다(Fig. 1). 열안정화 l-TA, H₄₄를 포함한 plth-SCA3 (2)-H44를 EcoRI/PstI으로 절단하여 cohesive 말단의 L-TA을만든 후 Corynebacterium-E.
C. glutamicum R 발현용 재조합 vector를 구축하기 위하여 열안정화 L-TA, H₄₄를 포함한 plth-SCA3(2)-H₄₄를 E. coli에서 정제한 후, plth-SCA3(2)-H₄₄의 DNA를 주형으로 한 중합연쇄 반응(PCR)을 이용하여 목적하는 L-TA 유전자를 증폭시켰다. PCR에 사용된 primers는 N말단과 C 말단에 각각 EcoRI/Pstl의 제한효소부위를 포함하도록 설계하였다.
따라서 Corynebacterium 발현용 vector plasmid를 재구축함으로써 l-TA의 발현량을 향상시키고자하였다. Fig. 2의 pCG-H₄₄(l)의 lacP의 하류에 존재하는 Shine-Dalgamo(SD) 배열과 삽입된 L-TA 유전자의 개시코든 사이의 염기를 하나 삭제한 5860 bp의 Corynebacterium 발현용 vector plasmid pCG-H₄₄(2)을 재구축하였다. 구축된 pCG-H44(2)을 C.
5%의 polyacrylamide get을 사용하여 전개 분리 후 Coomassie brilliant blue을 사용하여 염색하였다[17]. L-㎛%-DOPS의 분석은 HPLC(HITACHI; column, COSMOSIL 5C₁₈-MS 4.6x150 mm; 이동상, 0.1% (w/v) 1-heptanesulfonic acid sodium salt/10% MeOH)을사용하여 측정하였다&rsquo;
PCR에 사용된 primers는 N말단과 C 말단에 각각 EcoRI/Pstl의 제한효소부위를 포함하도록 설계하였다. PCR 반응은 50 ng의 template DNA을 주형으로 5 U/gl LA Taq polymerase, 1 xhigh GC buffer, 2.5 mM dNTP 그리고 25 pmol oligonucleotide primers를 포함하는 용액을 사용하였으며 94℃에서 40초, 6VC에서 3(초 그리고 72℃ 에서 2분간 29회 반복하였다. PCR 증폭 단편을 QIAGEN PCR Purification kit을 사용하여 정제한 후, EcoRI/Pstl으로제한효소 처리한 후 얻어진 l-TA 유전자 단편을 동일하게 EcoRI/Pstl으로 제한효소 처리한 Corynebacterium 발현용 vector plasmide! pCRBl에 재조합하고 E.
5 mM dNTP 그리고 25 pmol oligonucleotide primers를 포함하는 용액을 사용하였으며 94℃에서 40초, 6VC에서 3(초 그리고 72℃ 에서 2분간 29회 반복하였다. PCR 증폭 단편을 QIAGEN PCR Purification kit을 사용하여 정제한 후, EcoRI/Pstl으로제한효소 처리한 후 얻어진 l-TA 유전자 단편을 동일하게 EcoRI/Pstl으로 제한효소 처리한 Corynebacterium 발현용 vector plasmide! pCRBl에 재조합하고 E. coli JM109을 형질전환 시켜 재조합 vector plasmid pCG-H₄₄(l)을 구축하였다. 구축된 vector plasmid pCG-H₄₄(l)를 E.
coli에서 정제한 후, plth-SCA3(2)-H₄₄의 DNA를 주형으로 한 중합연쇄 반응(PCR)을 이용하여 목적하는 L-TA 유전자를 증폭시켰다. PCR에 사용된 primers는 N말단과 C 말단에 각각 EcoRI/Pstl의 제한효소부위를 포함하도록 설계하였다. PCR 반응은 50 ng의 template DNA을 주형으로 5 U/gl LA Taq polymerase, 1 xhigh GC buffer, 2.
Whole cell biocatalysis을 이용한 파킨슨병 치료제 인 L-threo-DOPS 합성용 생물반응기의 효율적인 프로세스를 구죽하기 위하여 비자화성 세포벽을 지닌 C. glutamicum 日을 이용한 whole cell biocatalysis 반응계를 구축하였다. 본 연구에 사용한 C.
열안정화 l-TA, H₄₄를 포함한 plth-SCA3 (2)-H44를 EcoRI/PstI으로 절단하여 cohesive 말단의 L-TA을만든 후 Corynebacterium-E. coli shuttle vector 인 pCRBl 의 lacP의 하류에 삽입하여 5861 bp의 Corynebacterium 발현용 vector plasmid pCG-H₄₄(l)을 구축하였다. 사용된 pCRBle pUC계열의 클로닝용 vector plasmid로서 chloroamphenicol 내성 선택 marker와 lacP를 지닌 pHSG398 vector plasmid를 개량하여 C.
조효소액은 현탁 균체를 초음파로 2회 처리한 후 14, 500 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻어진 상등액으로 하였다. pCG-H44(l)에서 목적하는 열안정성 L-TA의 발현을 확인하기 위하여 SDS-PAGE로 분석하였다(Fig. 2). S.
2의 pCG-H₄₄(l)의 lacP의 하류에 존재하는 Shine-Dalgamo(SD) 배열과 삽입된 L-TA 유전자의 개시코든 사이의 염기를 하나 삭제한 5860 bp의 Corynebacterium 발현용 vector plasmid pCG-H₄₄(2)을 재구축하였다. 구축된 pCG-H44(2)을 C. glutamicum R strain에 형질전환시킨 재조합 균주(CGH₄₄-2)를 사용하여 전술의 pCG-H₄₄(l)을 형질전환 시킨 CGH₄₄-1 와 동일한 조건하에서 삽입한 S. coelicolor A3(2) 유래 열안정화 L-TA의 발현을 유도하였다. C.
재조합 C. glutamicum R을 이용하여 고발현된 L-TA를 이용한 LMreo-DOPS의 최적합성조건을 찾기 위하여 합성반응조건에 대하여 검토하였다. 최적반응 pH를 검토한 결과 Fig.

대상 데이터

IsQpropyl・|3-D-thiogalactoside(IPTG), lycine, 그리고 3, 4-dihydroxybenzaldehyde는 Wako chemicals(Japan)에서 구입하여 사용하였다 L-threonine과 ortho-phthalaldehyde(OPA) 는 Lancastei.사(Alfa Aesar Co.
glutamicum R strain을 사용하였으며, vector로는 Corynebacterium-E. coli shuttle vectoi인 pCRBl< RITE의 Yukawa박사로부터 공여 받아 사용하였다 [11].
본 연구에서 사용한 숙주세포로는 E. coli JM109(endAl, rec Al, gyrA96, thi,# 로서 plasmid 회수 및 대장균 발현용으로 사용하였다. L~Threonine aldolase(L-TA) 유전자 공여 plasmide S.
Lancastei.사(Alfa Aesar Co. Ltd., USA)에서 구입하여사용하였다 Research Institute of Innovative Technology for the Earth(RITE, Kyoto)에서 분양받은 Corynebacterium glutamicum R 배양에는 A배지 (Table 1)를 사용하였으며, E. coli의 배양은 Luria-Bertani(LB)배지를 사용하였다* 형질 전환된 C. glutamicum R 및 Escherichia coli의 배양에는 50 μg/ml chloramphenicol의 항생물질을 첨가궁]여 선택배지로 사용하였다.
coli shuttle vector 인 pCRBl 의 lacP의 하류에 삽입하여 5861 bp의 Corynebacterium 발현용 vector plasmid pCG-H₄₄(l)을 구축하였다. 사용된 pCRBle pUC계열의 클로닝용 vector plasmid로서 chloroamphenicol 내성 선택 marker와 lacP를 지닌 pHSG398 vector plasmid를 개량하여 C. glutamicum R을 숙주로 외래유전자의 고발현을 가능하게 제작된 Corynebacterium 발현용 vector plasmid이다. 구축된 pCG-H₄₄(l)를 heat shock법에 의해서 E.

성능/효과

0에서의 L-t»eo-DOPS의 합성활성이 가장 높았다. Buffere 종류에 따른 Corynebacterium 재조합 L-TA의 whole cell 반응시 L-㎛"-DOPS의 합성량을 최적활성 pH인 7.0에서 세종류의 buffer를 사용하여 비교한 결과, Fig. 3에서 보는 바와 같이 pH 7.0의 0.1 M cirtric acid buffer에서 동일 pH의 0.1 M sodium phosphate buffei와 0.1 M potassium phosphate buffer에 비해서 높은 L-threo-DOPS의 합성활성을 보였다. 재조합 l-TA의 whole cell 반응시 최적온도를 20~50℃의 범위에서 측정한 결과, 3VC에서 높은 L-threo-DOPS의 합성 활성을 보였다.
재조합 l-TA의 whole cell 반응시 최적온도를 20~50℃의 범위에서 측정한 결과, 3VC에서 높은 L-threo-DOPS의 합성 활성을 보였다. 4CTC에서는 L-threo-DOPS 합성능이 5시간 이후 감소되는 경향을 보였으며, 50℃에서 초기 합성농도는 가장 높았으나 시간의 경과와 함께 급격히 감소되는 경향을 보였다. 따라서 Corynebacterium 재조합 L-TA의 whole cell 반응시 최적온도는 3VC가 가장 적합할 것으로 사료되었다.
coelicolor A3(2) 유래 l-TA는 1071 bp의 DNA와 356개의 아미노산으로 구성되어 있는 단백질로서 추정되는 단량체의 분자량은 37 kDa이며 gel filtration의 결과 다른 미생물유래 l-TA 과 마찬가지로 homotetramer로 주정된다. C. glutamicum R strain에서 발현시킨 L-TA의 SDS-PAGE 분석 결과, Fig. 2 의 2번 lane에서 보여지는 것처럼 CGH₄₄(1)에서는 Fig. 2, 3번 lane에서 보이는 l-TA 유전자를 포함하지 않은 조 효소액과 비교하여 약 37kDa의 l-TA의 발현이 관찰되었으나 예상외로 발현량이 매우 낮음을 확인할 수 있었다. 또한 Table 2에서 보이는 것처럼 CGH₄₄ 조효소액의 L-threo-DOPS 합성 효소활성을 조사한 결과, CGH₄₄ 조효소액 단백질 mg당 0.
coelicolor A3(2) 유래 열안정화 L-TA의 발현을 유도하였다. C. glutamicum R strain에서 발현시킨 L-TA의 SDS-PAGE 분석 결과, Fig. 2의 1 번 lane에서 보여지는 것처럼 CGH44-2에서는 Fig. 2의 2번 lane에서 보이는 CGH₄₄-I 조 효소액과 비교하여 약 37 kDa의 L-TA이 뚜렷하게 관찰되어 고발현되어 있음을 확인할 수 있었다. 또한 Table 2에서 보이는 것처럼 CGH₄₄-2 조효소액의 L-threo-DOPS 합성 효소 활성은 CGH₄₄-1 조효소액 단백질 mg당 0.
따라서 Corynebacterium 재조합 L-TA의 whole cell 반응시 최적온도는 3VC가 가장 적합할 것으로 사료되었다. L-threo-DOPS의 최적합성을 위한 계면활성제에 대하여 검토한 결과, Fig. 4에서 보여지는 것처럼, 계면활성제를 첨가하지 않은 조건보다 계면활성제를 첨가한 경우 더 많은 L-threo-DOPS가 합성되었다. 사용된 두종류의 계면활성제 중 TritonX-100/} Tween20보다 더 높은 L-threo-DOPS의 합성활성을 보였기 때문에 계면활성제의 종류에 따라 L-threo-DOPS의 합성에 차이가 나타남을 시사하였다.
glutamicum R을 숙주로 외래유전자의 고발현을 가능하게 제작된 Corynebacterium 발현용 vector plasmid이다. 구축된 pCG-H₄₄(l)를 heat shock법에 의해서 E. coli JM109을 형질전환시킨 후 plasmid를 회수하여 삽입된 L-TA, H₄₄의 염기배열을 결정한 결과, 열 안정화에 영향을 미치는 치환아미노산인 H₁₇7Y는 보존되어 있었으나 그 외의 염기배열에서는 PCR에 의한 돌연변이는 없었다.
coelicolor A(3)의 wild type L-TA을 발현시킨 대장균에 비해서 안정적으로 L-㎛"-DOPS를 합성할 수 있었으나, 20회 이상 반복회분식 반응에서 100시간 이후 점차 합성능이 감소되어짐을 알 수 있었다. 그 결과, wild type L-TA의 경우 약 2.0 mg/ml을 합성하였으며, 열안정화 효소인 H₄₄의 경우, 약 4.0 mg/ml의 합성을 보여 효소의 반응을 향상시킬수 있었다. 그러나 반응이 100시간이상 연장되면서 그 반응효율은 더욱 감소되어 최종적으로 wild type L-TA의 경우 약 1.
4 mg/ml의 합성을 보였다. 그러나, 본 연구에서 구축한 CGH₄₄-1의 경우 반응의 시간이 연장되어짐에도 불구하고 최종적으로 검토한 반응시간 내에서 약 4.0 mg/ml의 LMreo-DOPS를 합성함을 알 수 있었다. 이러한 결과는, 효소의 열안정화 및 Corynebacteriume] 도입에 의해서 효율적이고 안정적으로 L-threo-DOPS를 합성 가능한 반응프로세스의 구축이 가능함을 시사한다.
4CTC에서는 L-threo-DOPS 합성능이 5시간 이후 감소되는 경향을 보였으며, 50℃에서 초기 합성농도는 가장 높았으나 시간의 경과와 함께 급격히 감소되는 경향을 보였다. 따라서 Corynebacterium 재조합 L-TA의 whole cell 반응시 최적온도는 3VC가 가장 적합할 것으로 사료되었다. L-threo-DOPS의 최적합성을 위한 계면활성제에 대하여 검토한 결과, Fig.
2, 3번 lane에서 보이는 l-TA 유전자를 포함하지 않은 조 효소액과 비교하여 약 37kDa의 l-TA의 발현이 관찰되었으나 예상외로 발현량이 매우 낮음을 확인할 수 있었다. 또한 Table 2에서 보이는 것처럼 CGH₄₄ 조효소액의 L-threo-DOPS 합성 효소활성을 조사한 결과, CGH₄₄ 조효소액 단백질 mg당 0.433 mg을 합성함을 알 수 있었다. 이전의 연구에서 S.
glutamicum 日을 이용한 whole cell biocatalysis 반응계를 구축하였다. 본 연구에 사용한 C. glutamicum R straine 일반적으로 사용되는 대장균과 달리 비자화성 세포벽으로 구성되어 균체 자체가 견고하기 때문에 사용된 촉매의 효율적인 반복이용이 가능하다는 장점을 가지고 있다. C.
4에서 보여지는 것처럼, 계면활성제를 첨가하지 않은 조건보다 계면활성제를 첨가한 경우 더 많은 L-threo-DOPS가 합성되었다. 사용된 두종류의 계면활성제 중 TritonX-100/} Tween20보다 더 높은 L-threo-DOPS의 합성활성을 보였기 때문에 계면활성제의 종류에 따라 L-threo-DOPS의 합성에 차이가 나타남을 시사하였다. 이러한 결과는 계면활성제가 고밀도의 기질과 whole cell 사이의 mass transfer rate를 향상시켜주기 때문으로 추정된다.
0 mg/ml의 LMreo-DOPS를 합성함을 알 수 있었다. 이러한 결과는, 효소의 열안정화 및 Corynebacteriume] 도입에 의해서 효율적이고 안정적으로 L-threo-DOPS를 합성 가능한 반응프로세스의 구축이 가능함을 시사한다.
1 M potassium phosphate buffer에 비해서 높은 L-threo-DOPS의 합성활성을 보였다. 재조합 l-TA의 whole cell 반응시 최적온도를 20~50℃의 범위에서 측정한 결과, 3VC에서 높은 L-threo-DOPS의 합성 활성을 보였다. 4CTC에서는 L-threo-DOPS 합성능이 5시간 이후 감소되는 경향을 보였으며, 50℃에서 초기 합성농도는 가장 높았으나 시간의 경과와 함께 급격히 감소되는 경향을 보였다.
glutamicum R을 이용하여 고발현된 L-TA를 이용한 LMreo-DOPS의 최적합성조건을 찾기 위하여 합성반응조건에 대하여 검토하였다. 최적반응 pH를 검토한 결과 Fig. 3(a)에서 보이는 것처럼 pH 8.0 이상, pH 5.0 이하의산알카리 영역 에서는 효소활성이 약했으며 pH 7.0에서의 L-t»eo-DOPS의 합성활성이 가장 높았다. Buffere 종류에 따른 Corynebacterium 재조합 L-TA의 whole cell 반응시 L-㎛"-DOPS의 합성량을 최적활성 pH인 7.

후속연구

[1]. 그러나, 본 연구방법에 사용된 재조합대장균은 장기간의 whole cell 반응시에는 E. colie\ lysis에 의해서 효소가 E. coli 밖으로 배출되어 균체분리용 막을 사용한 연속식 반응기의 설계시효 소가 누출되어 반응효율을 저하시킬 수 있다는 문제점이 예상되었다. 따라서 L-TA 유전자의 재조합 whole cell biocatalyst# 이용하여 lm/*o-DOPS를 효율적으로 생산하기 위해서는 더욱 안정한 재조합용 균주의 개발 에 대한 필요성 이 대두되었다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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