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문제 정의
- oligospermae}- 100% 상동성을 보였다. 보다 자세하게 동정하기 위해서는 다른 유전자(rDNA-ITS, Beta-tubulin, actin, calmodulin 등) 의 염기서열을 분석 비교하고 형태적으로 자세하게 관찰을 해야겠지만 본 논문의 목적은 중금속을 제거하는 균주의 제거 특성을 알아보는 것이기 때문에 Exophiala sp로 표기하고자 한다.
제안 방법
- LH2 균주를 10%(v/v)가 되도록 접종한 후, 다양한 조건에서 7일간 진탕 배양 및 정치 배양하였다. Biosorption 배지에는 5종의 중금속을 각각 10, 50, 100, 150, 200 ppm으로 첨가하여 배양하였다. 균주 생장에 미치는 배지의 pH 및 온도영향을 알아보기 위하여 pH 4, 5, 6, 7로 설정하였으며, 온도는 25, 37, 45℃로 설정하여 각각의 조건에서 최적 성장조건 및 중금속 제거효율을 관찰하였다.
- 본 연구에서는 분리균주 Exophiala sp. LH2 균주를 이용하여 중금속 농도를 달리하여 중금속 제거효율을 조사하였으며 , 또한, 용액의 pH와 온도변화에 따른 상관관계를 알아보았다.
- 환경에서 Exophiala sp. LH2 균주를 접종하여 25℃, 37℃, 45℃의 온도에서 배양하며 온도의 차이에 따른 중금속 제거능을 알아보았다. 모든 중금속은 온도가 25℃에서 45℃로 증가함에 따라 제거효율이 감소하는 경향을 보였다.
- LH2 의 성장을 관찰하였다. 초기 pH깂을 각각 4, 5, 6, 7로 설정하였으나 중금속의 농도가 증가할수록 초기 pH값이 낮게 나타났다.
- 분리균주 Exophiala sp. LH2를 이용하여 중금속 제거효율 및 생장을 알아보았다. 분리균주는 중금속 Cr, Cu, Ni, Pb, Zn에 대한 내성을 가지고 있어 중금속 농도가 각각 200 ppm이 초과되지 않았을 경우 생육에 저해를 받지 않는 것으로 판단된다.
- 분리균주 Exophiala sp. LH2를 중금속이 함유된 배지에서 배양하면서 각각의 중금속 농도 변화 및 pH 변화가 중금속(Cr, Cu, Ni, Pb, Zn) 제거 효율에 미치는 영향을 알아보았다. 초기 pH가 4, 5, 6, 7인 배지에 첨가되는 중금속을 종류별로 각각 100 ppm씩 첨가한 후 접종한 분리균주 Exophiala sp.
- Biosorption 배지에는 5종의 중금속을 각각 10, 50, 100, 150, 200 ppm으로 첨가하여 배양하였다. 균주 생장에 미치는 배지의 pH 및 온도영향을 알아보기 위하여 pH 4, 5, 6, 7로 설정하였으며, 온도는 25, 37, 45℃로 설정하여 각각의 조건에서 최적 성장조건 및 중금속 제거효율을 관찰하였다. 매일 일정량의 시료 5ml를 회수하여 pH 및 O.
- 그러나 본 실험의 경우 중금속이 함유된 배지이며 배양 균주가 균사체를 만드는 곰팡이 이기 때문에 흡광도의 변화가 균주의 생장을 반드시 의미하지는 않는다. 따라서 실험이 종료된 5일째 배양액을 회수하여 건조중량을 측정하였다. 각각의 중금속의 첨가량이 10-150 ppm으로 증가될 경우 균체의 건조중량(50~70 mg) 에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으나, 첨가량이 200 ppm 이상으로 증가할 경우 건조중량이 절반이하로 나왔고 이는 고농도의 중금속 첨가로 균체의 성장이 저해 받았음을 의미한다.
- 균주 생장에 미치는 배지의 pH 및 온도영향을 알아보기 위하여 pH 4, 5, 6, 7로 설정하였으며, 온도는 25, 37, 45℃로 설정하여 각각의 조건에서 최적 성장조건 및 중금속 제거효율을 관찰하였다. 매일 일정량의 시료 5ml를 회수하여 pH 및 O.D를 측정하였으며 , 실험 종료 후 건조중량을 측정하기 위하여 시료 10 ml를 회수하여 원심분리(10, 000 rpm, 10 min)하였다. 원심분리 후 상등액을 버린 후 남겨진 균체를 90P의 건조기에서 24시간 건조 후 실온에서 방냉하여 중량을 측정하였다.
- 배양액 중의 중금속 농도는 유도결합 플라즈마 원자 방사분 광기 (ICP-MS, Elan 6100, Perkin Elmer, U.S.A.)를 이용하여 분석하였다. 배양이 종료된 후 10, 000 rpm에서 10분간 원심분리(20PR-52D, HITACHI, Japan)하여 균체를 제거한 후 배양액 0.
- )를 이용하여 분석하였다. 배양이 종료된 후 10, 000 rpm에서 10분간 원심분리(20PR-52D, HITACHI, Japan)하여 균체를 제거한 후 배양액 0.5 ml에 존재하는 유기물을 제거하기 위해서 질산 용액(85%)을 2 ml 넣고 건조하는 전처리과정을 거친 후 분석하였다.
- 배양하였다. 약 20여회의 계대배양이 진행되면서 최종적으로 배양액 1 ml를 9 ml 증류수와 섞어 10배 희석법을 이용하여 10-4~10-10의 시료를 만들어 중금속이 함유되어진고체 배지에 도말하였다. 도말한 plate를 일부는 30℃ incubatoi에서 호기적으로 배양하였으며, 일부는 혐기조에 넣은 뒤에 질소가스로 혐기조를 채운 후에 뚜껑을 닫아 공기가 들어가지 않도록 기밀하여 incubatoi를 이용하여 30。(2에서 약 10일간 배양한 뒤 군락체 형태 , 색깔, 크기에 따라 선별하여 다시 plate에 접종하여 한차례 더 순수분리를 시도하였다.
- 원심분리 후 상등액을 버린 후 남겨진 균체를 90P의 건조기에서 24시간 건조 후 실온에서 방냉하여 중량을 측정하였다. 온도에 대한 영향을 제외한 모든 실험은 30OC에서 수행되었으며 , 모든 실험조건은 3회 반복 실험하였다.
- LH2 균주 배양이 종료된 5일째 배양액으로부터 원심분리 (10, 000 rpm, 10 min) 후 균사체를 건조하여 얻은 건조 세포중량 값을 얻었다. 이로부터 총 5일의 배양 기간 동안 제거된 중금속을 미생물 생물량(건조세포중량)으로 나누어 미생물 생물량에 근거한 비제거속도를 구하였다.
- 이후 CLUSTAL W[16]를 사용하여 , 염기서열을 조합하여 NCBI(The National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih)에서 제공하는 Advanced Blast search-f- 이용하여 Genebank의 염기서열과 비교함으로써 곰팡이의 분자 동정을 하였다.
- 위의 결과를 종합적으로 균주는 호기적 성장을 하는 것으로 사료된다. 이후 모든 실험은 Shaking condition(진탕배양)으로 수행하였다.
- 또한, CuSO4-5H2O, PbSO4, CrK(SO4)2- 12HZO, ZnSO4-7H2O, NiSQfSHzC를 각각 1,000 ppm으로 제조하였다. 이후 필요에 의하여 10, 50, 100, 150, 200 ppm으로 희석하여 사용하였다. 각 배지 및 실험 시 사용되는 실험 재료는 Autoclave (TOMY, SS-325, Japan)를 사용하여 12FC에서 15분간 멸균한 후 사용하였다.
대상 데이터
- 2는 Exophiala sp. LH2를 현미경 (BX41TF, OLYMPUS, Japan)으로 1,000배에서 관찰한 사진이다. 균체는 PDA에서 25℃에서 5일간 배양한 것을 멸균수에 현탁한 후 관찰한 것으로 단균사는 직경이 o.
- 이후 필요에 의하여 10, 50, 100, 150, 200 ppm으로 희석하여 사용하였다. 각 배지 및 실험 시 사용되는 실험 재료는 Autoclave (TOMY, SS-325, Japan)를 사용하여 12FC에서 15분간 멸균한 후 사용하였다. 멸균 시 배지와 glucose는 따로 분리하여 각각 멸균하였다.
- 경안천 유역에서 채취한 퇴적토를 10% 접종원으로 하여 혈청 병에 Biosorption 배지를 넣고 첨가된 중금속의 농도를 10 ppm에서 최대 200 ppm까지 점차적으로 증가시켜주며계대 배양하였다. 약 20여회의 계대배양이 진행되면서 최종적으로 배양액 1 ml를 9 ml 증류수와 섞어 10배 희석법을 이용하여 10-4~10-10의 시료를 만들어 중금속이 함유되어진고체 배지에 도말하였다.
- 5로 보정하였다. 또한, CuSO4-5H2O, PbSO4, CrK(SO4)2- 12HZO, ZnSO4-7H2O, NiSQfSHzC를 각각 1,000 ppm으로 제조하였다. 이후 필요에 의하여 10, 50, 100, 150, 200 ppm으로 희석하여 사용하였다.
이론/모형
- 균의 분자생물학적 동정을 위해서 plate에서 배양한 균체를 Bionics에 의뢰하여 18S rDNA sequencing 방법에 의거하여 동정하였다.
성능/효과
- 진탕배양 시 배지의 pH가. 4, 5, 6, 7인 환경 모두에서 전반적으로 시간이 지남에 따라 미생물 성장이증가됨을 알 수 있었으며 , 기질 농도가 증가함에 따라서 pH 가 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 배지의 pH를 6, 7로 설정한 후 중금속의 농도를 달리하여 성장하는 균주의 흡광도 및 pH를 측정한 결과를 Fig.
- Exophiala sp. LH2 균주는 150 ppm의 Zn이 첨가된 배지에서 최고 98%의 Zn을 제거하였으며 , 200 ppm의 농도가 첨가될 경우 제거율이 다소 감소하는 경향을 보였다. Exophiala sp.
- Exophiala sp. LH2 균주는 배지에 첨가되는 중금속 Pb을 초기농도 10 ppm에서 200 ppm인 모든 범위에서 99% 이상 제거하였으며, Zn의 경우엔 첨가량이 증가됨에 따라 87-98% 이상의 제거효율을 보였다.
- pH를 6으로 설정한 배지에서 생장하는 Exophiala sp. LH2 균주는 첨가된 Ni을 22~78%가량 제거하여 다소 낮은 제거효율을 보였으며, 첨가된 Cre 중금속의 농도가 증가됨에 따라 제거효율도 71-97%로 증가하였다. Exophiala sp.
- 농도가 증가함에 따라 Exophiala sp. LH2 균주에 의한 제거효율이 증가되어 각각 22-91%, 70-99%의 제거효율을 보였다(Fig. 5). Exophiala sp.
- 이상의 결과에서 분리균주 Exophiala sp. LH2를 이용한 중금속의 제거는 pH 4 및 5의 약산성 환경보다는 중성 환경이 효율적임을 알 수 있었다. 이러한 결과는 최근 사상곰팡이류인 Phanerochaete duyosporium를 이용한 Cd(II), Pb(II) 그리고 Cu(II) 등의 실험결과에서 pH 6일 때 최고의 금속 흡착률을 보였으며, 그 흡착률은 Langmuir sorption model과 일치한다는 보고 [14] 와 유사한 결과를 보인다.
- 이후 배지의 pH가 6 이상으로 증가하게 됨에 따라 제거효율은 비약적으로증가하여 최저제거효율이 79% 이상의 값을 보였다' 중금속 Pb의 경우는 pH의 영향을 거의 받지 않은 채 모든 영역에서 최저 92% 이상의 제거효율이 유지되었다. pH 4인 배지환경에선 Zn이 거의 제거되지 않았으나, 배지의 pH가 5 이상으로 증가하면서 98% 이상의 제거효율이 유지되었다. 이상의 결과에서 분리균주 Exophiala sp.
- pH 변화에 따른 제거효율을 관찰한 결과 중금속을 각각 100 ppm씩 첨가할 경우 pH가 4에서 7로 제거효율이 증가하여, pH 7인 경우 Cr 97.58%, Cu 89.84%, Ni 89.6%, Pb 99.22%, Zn 98.98%로 나타났다. 반면 pH 7의 경우 첨가된 중금속을 각각 100 ppm으로 설정한 경우 Cr 97.
- pH가 6, 7인 환경에서 정치배양 할 경우 시간이 지날 수록 균체 성장이 감소되는 것을 관찰할 수 있었으며, pH가 현저히 떨어지는 것을 관찰할 수 있었다(data not shown). 위의 결과를 종합적으로 균주는 호기적 성장을 하는 것으로 사료된다.
- 따라서 실험이 종료된 5일째 배양액을 회수하여 건조중량을 측정하였다. 각각의 중금속의 첨가량이 10-150 ppm으로 증가될 경우 균체의 건조중량(50~70 mg) 에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으나, 첨가량이 200 ppm 이상으로 증가할 경우 건조중량이 절반이하로 나왔고 이는 고농도의 중금속 첨가로 균체의 성장이 저해 받았음을 의미한다.
- 3에서 나타내었다. 균주의 성장을 간접적으로 알 수 있는 지표 중의 하나인 흡광도의 증가 경향을 분석한 결과 pH 6인 환경에서 균주의 성장이 조금 더 활발하게 나타났다(Fig. 3). 그러나 본 실험의 경우 중금속이 함유된 배지이며 배양 균주가 균사체를 만드는 곰팡이 이기 때문에 흡광도의 변화가 균주의 생장을 반드시 의미하지는 않는다.
- 4에 도시하였다. 모든 중금속에서 pH가 4에서 7로 증가됨에 따라 중금속의 제거효율이 증가되는 경향을 관찰할 수 있었다. Pb 을 제외한 Cr, Cu, Ni 등의 중금속은 약산성 환경 인 pH 4 또는 5인 배지에서 균주에 의한 제거효율이 최저 5%에서 최고 38%였다.
- LH2 균주를 접종하여 25℃, 37℃, 45℃의 온도에서 배양하며 온도의 차이에 따른 중금속 제거능을 알아보았다. 모든 중금속은 온도가 25℃에서 45℃로 증가함에 따라 제거효율이 감소하는 경향을 보였다. Ci의 경우 25℃에서 80.
- 첨가된 중금속 중 N과 Ziri- 제외 할 경우 배지의 pH 가 6 및 7인 환경에서 중금속의 농도가 증가함에 따라 제거효율도 증가하였으며, 첨가량이 200 ppm 이하인 경우는 균주에 의한 제거효율에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 반면, 중금속 Ni과 Zne 각각 첨가량이 100 ppm 및 150 ppm 이상인 환경에서는 분리균주에 의한 제거효율이 감소함을 알 수 있었다. pH를 6으로 설정한 배지에서 생장하는 Exophiala sp.
- 위의 결과를 종합적으로 균주는 호기적 성장을 하는 것으로 사료된다. 이후 모든 실험은 Shaking condition(진탕배양)으로 수행하였다.
- 5에서 나타내었다. 첨가된 중금속 중 N과 Ziri- 제외 할 경우 배지의 pH 가 6 및 7인 환경에서 중금속의 농도가 증가함에 따라 제거효율도 증가하였으며, 첨가량이 200 ppm 이하인 경우는 균주에 의한 제거효율에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 반면, 중금속 Ni과 Zne 각각 첨가량이 100 ppm 및 150 ppm 이상인 환경에서는 분리균주에 의한 제거효율이 감소함을 알 수 있었다.
- 클로닝 된 유전자는 556 bp로 밝혀졌으며(Fig. 1), 종 간의 염기서열의 유사성 검정은 NCBI(The National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih) 에서 제공하는 Advanced Blast search를 이용한 결과 Exo- phialaer 높은 상동성을 보였고 그 중에서 E. oligospermae}- 100% 상동성을 보였다. 보다 자세하게 동정하기 위해서는 다른 유전자(rDNA-ITS, Beta-tubulin, actin, calmodulin 등) 의 염기서열을 분석 비교하고 형태적으로 자세하게 관찰을 해야겠지만 본 논문의 목적은 중금속을 제거하는 균주의 제거 특성을 알아보는 것이기 때문에 Exophiala sp로 표기하고자 한다.
후속연구
- 즉 중금속의 첨가량이 각각 200 ppm 이하인 경우 pH가 4에서 7로 증가할수록 제거효율이 증가하였다. 따라서 여러가지 중금속이 오염되어 있는 실제 오염원에 적용하기 위해서는 생장율을 일정하게 유지시킬수 있는 방법과 여러가지 오염물질의 처리효율을 동시에 증진시키기 위한 방법이 검토되어야 할 것으로 판단되며 이러한 문제점을 보완하면 실제 중금속 오염원에 적용할 경우 매우 좋은 처리효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다.
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