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문제 정의
- 지표들의 개발 3) 위험감소제품의 선발 및위해성 감소효과를 입증하기 위해서이다.
- 첨가물 수용도 평가 과정은 첨가물 단일 성분 또는 혼합물에 대한 연기분석, 유전독성 평가, 세포독성 평가 및 흡입독성 평가로 이루어져 있다. 여기서는 Vanscheeuwijck 등 (2002)이 보고한 자료를 인용하여 첨가물 333종에 대한 흡입독성 평가법 및 주요 결과를 소개하였다. Vanscheeuwijck 등은 담배 제조에서 흔히 사용되는 첨가물 333종을 3개의 군으로 나누어 high와 low 농도로 담배에 첨가하여 시험용 담배를 조제하였다.
제안 방법
- 30 포트 흡연장치를 사용하여 ISO 3308 (ISO, 1991a) 표준 흡연조건에서 담배 연기를 발생시켰으며 (35mL, 2초 흡연시간, 흡연간격 60초) 담배연기를 청정공기와 섞어 WTPM 농도가 150ug/L되게 조절하여 담배연기를 Sprague-Dawley 흰쥐의 비강을 통해 노출시켰으며 노출 튜브의 온도는 22 ± 1 ℃, 상대습도 50 ± 4%로 조절하였다.
- Pentobai-bital 마취제를 주사하여 동물을 마취시킨 후 채혈하여 OECD guideline (OECD, 1981b) 에 기재된 혈액학 및 임상화학 시험항목들을 분석하였다. 부검 시 체내의 장기 조직을 육안으로 검사하여 병변의 유무를 관찰하였으며 개체 별 장기의 중량을 측정하였다.
- 2). 그 외 검체 제작된 후두에 대해 피열투영 상피세포의 두께를 측정하였다.
- 노출 부위의 연기를 채취하여 TPM, CO, aldehyde (formaldehyde, acetaldehyde, acrolein), nicotine, nitrogen oxide, 입자분포, 온도 및 상대습도를 정기적으로 분석, 모니터링하였다.
- 1981b). 담배 비교 평가를 위한 아만성 흡입독성 시험에서 전형적인 담배연기 노출 조건은 매일 1〜5시간씩하루 1〜2회, 주당 5〜7회로 13주 (90일)간 노출시험을 한다. 담배연기 농도, 노출 시간, 총 시험 기간 등의 다양한 조합으로' 시험이 수행되어 왔으며 이들 노출 변수들의 조정이 특정 반응의 최대화, 시험기간 최소화 또는 전체 시험에 드는 비용 등의 절감 관점에서 연구자의 중요도에 따라 수행되어도 좋다.
- 담배연기 노출 2주차 및 12주차에 혈 중 COHb 및 혈중 니코틴 함량 또는 뇨 중 니코틴 등 대사물 6종의 배출량을 측정한다.
- 담배연기 노출 3, 7 및 13주 차에 plethysmo-graphy를 이용하여 일회 호흡 용적, 호흡률 분당호흡량 및 기도저항을 측정한다.
- Vanscheeuwijck 등은 담배 제조에서 흔히 사용되는 첨가물 333종을 3개의 군으로 나누어 high와 low 농도로 담배에 첨가하여 시험용 담배를 조제하였다. 담배연기를 흰쥐에 150 ug TPM/L의 농도로 매일 6시간씩 90일간 노출시킨 후 흡입독성을 평가하였다. 대조군에 비해 첨가물이 들어간 시험군 간에 괄목할만한 생리적, 생화학적 및 병리조직학적 차이가 없었다.
- 부검 시 체내의 장기 조직을 육안으로 검사하여 병변의 유무를 관찰하였으며 개체 별 장기의 중량을 측정하였다.
- 실험동물 개개의 체중 및 사료 섭취량을 주당한번 측정하였으며 동물의 생존여부와 건강상태를 매일 관찰하였다.
- 첨가물을 넣은 시험담배를 Ingredient Group 1 (Casing materials, volatile top flavorings, 판상엽에 사용되는 첨가물, IG 1), Ingredient Group 2 (Casing materials, volatile top flavorings, IG 2) 및 Ingredient Group 3 (Casing materials, menthol, IG 3)로 나누었다. 첨가물의 농도는 통상적으로 담배에 사용되는 농도인 low level과 1.
- IG 3)로 나누었다. 첨가물의 농도는 통상적으로 담배에 사용되는 농도인 low level과 1.5 또는 3배에 해당하는 high level 수준이 되도록 담배엽의 7~15%를 첨가물로 대체하여 대조 담배와 무게를 맞추었다.
- 폐, 기도 및 후두의 병리조직학적 검사를 위해각 장기를 EAFS로 고정한 후, 조직을 일정한 두께로 삭정, 조직처리, 파라핀 포매를 거쳐 조직절편을 제작한 후 Hematoxylin & Eosin 염색을 실시하였다 (Fig. 2). 그 외 검체 제작된 후두에 대해 피열투영 상피세포의 두께를 측정하였다.
- 호흡율, 호흡용적, 분당 호흡량을 전신 plethy smography# 이용하여 biomonitoring하였으며, 담배연기 노출량 평가를 위해 혈중 carboxyhemo-globin과 24시간 수집한 뇨에서 니코틴 대사물 (nicotine, cotinine, hydroxucotinine, nicotine glucuronide, cotinine glucuronide, hydroxycotinine glucuronide) 총량을 분석하였다 (Rustemeier 등, 1993).
대상 데이터
- Sprague Dawley 흰쥐 (male, female) 5주령을 구입하여 8일간 적응시켰으며 성별로 5마리의 동물을 골라 미생물 검사, 호흡기계 및 장기의 병리적 검사 후 시험에 사용하였다. 실험동물들은 SPF 시설에서 사육하였으며 온도는 21 ± 1℃, 상대습도 58±4%, 명/암 사이클은 12시간씩 교대로 유지하였다.
- 청정공기 (sham), 표준담배인 1R4F, 대조담배, 시험담배의 연기를 150 ug TPMZL의 농도로 매일 6시간씩 주 당 7일간 총 90일동안 흰쥐에 노출시켰으며 42일간 회복기를 가졌다. 각 군 당 male, female 실험동물을 각 10 마리씩 (대조군은 14마리) 사용하였다.
데이터처리
- 등분산 데이터의 경우 One-way analysis of variance (ANOVA)를 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군과 유의차가 있는 시험군을 확인하기 위해 Duncan test의 다중검정을 실시하였다 (유의수준 : 양측 5% 및 1%).
이론/모형
- 모든 시험은 OECD guideHne 413과 OECD GLP 기준에 준하여 실시하였다. 청정공기 (sham), 표준담배인 1R4F, 대조담배, 시험담배의 연기를 150 ug TPMZL의 농도로 매일 6시간씩 주 당 7일간 총 90일동안 흰쥐에 노출시켰으며 42일간 회복기를 가졌다.
성능/효과
- 13주 담배연기 흡입 후 sham 대비 담배연기 노출군의 후두와 기도의 절대 중량 및 폐 중량 대비상대 중량이 유의하게 증가되었다 (Table 4).
- 관찰되었다. 1JR4F를 노출시킨 웅성흰쥐의 경우 대조군과 유사하였으나 시험군에 비해서는 약 20% 높게 나타났으며 female의 경우 병리조직학적인 변화의 심각성이 대조군보다 30% 높았으며 시험군과는 비슷하였다.
- IG 1 high level cigarettes의 담배연기에 노출된 female 흰쥐의 경우 비강 호흡상피 level 1에서 예비세포 증생이 대조군보다 유의하게 높았다. 이는 level 2 및 웅성 흰쥐에서는 나타나지 않았으므로중요하지 않게 생각된다.
- Sham 대조군에 비해 담배연기 노출 흰쥐의 호흡률이 20% 낮았으며 일회 호흡용적은 변화가 없었다. 첨가물 시험군과 대조군간에는 유의한 차이가 없었다.
- 담배연기 노출부위의 연기 성분 분석 결과, IG 2 에서 formaldehyde, nicotine, nitric oxide 및 nitrogen oxides 함량이 대조군에 비해 낮았으며반면 IG 3의 경우 formaldehyde의 함량이 높았다. 입자크기 분포는 0.
- 담배연기 흡입 후 간에 존재하는 alkaline phosphatase, alanine aminotransferase 및 aspartate minotransferase의 활성이 두배 증가하였다. 이는 담배연기 흡입으로 간에서 지질과산화 반응이 증가되었기 때문으로 생각된다 (Table 3).
- 모든 담배연기 흡입군에서 백혈구 수치가 48% 증가하였으며 호중구 수치는 175% 높았으며 림프구는 60% 감소하였다. 대조군과 시험군 간에는 유의한 차이가 없었다.
- 모든 시험군에서 IG 2 high level의 체중감소는 20 ± 2 %로 다른 시험군 평균치인 28 ± 1 %에 비해 유의하게 낮았는 데 이는 니코틴 함량이 더 낮았기 때문으로 사료된다. 사료 섭취량은 담배연기 흡입군 보다 sham에서 많았으며 sham 및 흡연시킨 모든 동물의 생존률은 100 % 이었으며 첨가물로 인한 독성징후도 보이지 않았다.
- 조직병리학적 변화가 호흡기계 상피에서 일어났으며 제일 앞쪽 비강 부위에서 예비세포수의 증가, 배상 세포수 증가 및 편평 화생이 관찰되었다. 비강 level 2에서 에비세포 증식증이 관찰되었으나 심하지는 않았으며 level 2, 3, 4에서 후각 상피의 위축증과 편평화생이 관찰되었다.
- 기준에 준하여 실시하였다. 청정공기 (sham), 표준담배인 1R4F, 대조담배, 시험담배의 연기를 150 ug TPMZL의 농도로 매일 6시간씩 주 당 7일간 총 90일동안 흰쥐에 노출시켰으며 42일간 회복기를 가졌다. 각 군 당 male, female 실험동물을 각 10 마리씩 (대조군은 14마리) 사용하였다.
- 호흡기 상피의 배상세포수의 증가가 모든 흡연군의 폐에서 관찰되었으며 웅성 흰쥐에서 보다 female 흰쥐에서 더 심하게 나타났다. 또한 모든 흡연군에서 색소성 폐포 대식세포가 발견되었다.
후속연구
- 일치하지는 않는다. 그럼에도 불구하고 담배연기의 독성을 이해할 수 있는 더 좋은 방법이 개발될 때까지는 다양한 노출경로를 통한 실험동물을 이용한 생체 내 시험이 계속되어야 할 것이다.
- EU 등의 담배첨가물에 대한 규제 감시는 향 후 이런 생체 내 시험에 대한 지속적이고도 구체적인 요구를 나타낸다. 또한 생체 내 독성평가는 신제품 및 잠재적 노출 감소 제품의 (potentially reduced exposure products, PREPs, ) 독성 감소 정도 및 새로운 독성이 나타나지 않음을 증명하는 데 활용될 수 있으며 PREPs으로 승인을 받기위해서 절대적으로 필요한 시험과정이다.
- 생체내 독성평가는 담배 첨가물, 재료품 또는 제품 설계를 변경할 경우 담배연기 독성이 증가 또는 감소되었는 지를 평가할 수 있으며 이 결과는 제품보증에 활용될 수 있다. 캐나다의 독성평가자료 제출 및 EU 등의 담배첨가물에 대한 규제는 향 후이런 생체 내 시험에 대한 지속적이고도 구체적인요구를 할 것으로 사료된다.
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