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문제 정의
- 본 연구는 가바펜틴의 분석 방법을 개발하고 한국인에서의 가바펜틴의 약동학적 평가를 실시하여 국내 가바펜틴 제제의 생물학적 동등성을 평가 하고자 한다. 이 연구에서 사용한 가바펜틴 제제는 (주)한국화이자의 ''뉴론틴정 800 mg 을 대조약으로 하고 (주)종근당의 가바렙정 800 mg" 정을 시험약으로 설정하였다.
제안 방법
- 검량선 작성 - 가바펜틴 표준품을 메탄올에 녹여 농도를 1000μg/mL로 만든 후 냉동 보관시켰고, 냉동 보관했던 blank 혈장으로 이 용액을 희석하여 가바펜틴의 혈장 중 농도가 각각 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 |jg/mL 농도가 되도록 혈장시료를 만들었다. 각각의 표준혈장 50 μL에 증류수 200를 가하여 희석한 후 이 중 100를 취하여 Clopidogrel 용액 (40 ng/mL in acetonitrile) 1 μL로 채워진 SPE cartridge(Waters, Milford, MA, US A) 에 가하고 용출하였다.
- 주입하였다. 검체 분석 중에는 검량선 작성시료를 먼저 측정한 후 시료 전처리 시 각 배치의 시료 사이들마다 0.06, 4, 8/mg QC시료를 2회씩 측정하여 6 개 QC시료 중 4개 이상이 이론치의 15% 오차범위 이내에 들어오는지 확인하였다.
- 이 연구에서 사용한 가바펜틴 제제는 (주)한국화이자의 ''뉴론틴정 800 mg 을 대조약으로 하고 (주)종근당의 가바렙정 800 mg" 정을 시험약으로 설정하였다. 두 제제의 생물학적동등성을 평가하기 위하여 조사한 파라미터로는 cmax와 AUC를 주요 평가인 자로 설정하였으며 본 시험은 식품의약품안전청의 임상 계획서승인을 거친 후 임상시험윤리위원회의 감독 하에 국내 규정을 준수하여 실시하였다.
- 본 연구에서는 식품의약품안전청의 규정에 따라 대조약과 시험약간의 생물학적 동등성 평가를 혈중약물농도 시간곡선으로 부터 산출한 AUCt와 Cmax를 평가하여 시험하였다. 총 25명이 참가하여 약물 투여 후 각 항목을 산출하였으며 혈장농도 데이터는 K-BE Test 2002 프로그램을 통하여 통계처리 하였으며 대조약과 시험약의 비교평가항목의 실측치를 로그변환하여 유의수준 (a)=0.
- 다음날 오전 8시에 24시간째 채혈(마지막채혈)을 하고 담당 의사에 의해 혈압, 맥박, 기타 이상 유무를 확인하고 제II기 시험을 완료할 때까지 술이나 약물 복용을 일체 금지 하도록 다시 한 번 주의 사항을 주지시킨 후 귀가시켰다. 시험 전 과정을 통하여 피험자 개개인의 상태를 관찰하여 증례기록서에 기록하였다.
- 시험약과 대조약 간의 생물학적동등성 평가를 위한 비교항목은 혈장 중 약물농도시간곡선으로부터 산출한 혈중농도 시간곡선하면 적 (AUCt), 최고혈중농도(Cmax)로 하였으며 최고혈중농도 도달시간(TmQe 참고값으로 하였다. 생물학적 동등성 시험 통계처리용 프로그램 (K-BE Test 2007, 1.
- 채혈된 혈액은 3,000이에서 10분간 원심분리 한 후 혈장만을 취하여 eppendorf tube에 옮겨 담고 -70℃ 이하에서 분석 시까지 보관하였다. 식사에 의한 영향을 배제하기 위하여 투약 전 10시간 이상 절식한 상태에서 투약 후 4시간까지는 금식 (식수 포함) 상태를 유지시켰다. 피험자들은 투약 후 4시간째 채혈이 끝난 시점과 투약 후 10시간째 채혈이 끝난 시점에서 동일한 식사 (일반식)를 하였다.
- catheter> 설치하고 아뎁타를 연결한 후 blank 혈액으로 각각 10mL씩을 채혈하였다. 실수로 인한 채혈시간의 변동을 사전에 방지하기 위해 시험 전에 채혈자에게 채혈시간표를 배부하였으며, 각 피험자에게는 피험자의 번호를 매 채혈 시마다 확인할 수 있도록 시험 전날 지급한 명찰표를 착용하도록 하였다.
- 이 용출액 5 μL를 취하여 LC-MS/MS에 주입하였다. 여기에서 얻은 내부표준물질의 피크 면적에 대한 가바펜틴의 피크 면적비를 가지고 검량선을 작성하였으며, 하루에 실험을 5번 시행하여 일내 재현성을 구하였고 연속하여 5일간 실험을 행하여 일간 재현성을 구하였다.
- 판정되었다. 용출이 동등하게 판정된 대조약 및 시험약을 피험자에게 투여한 후 구한 시간 별 혈장 중 약물 농도를 그리고 일반적인 약동학적 파라미터를 구하였다. 평균 혈장 중 약물농도- 시간 곡선으로 그려보면 Fig.
- 정확성 (n=5)은 검량선에 의하여 정량한 농도의 평균값을 기지의 농도로 나눈 비의 백분율 (%)로서 구하였다(Table I). 정량한계(0.02 ng/mL, LLOQ)는 신호 대 잡음비(S/N ratio)를 10으로 하고 정밀성이 20% 이하이고, 정확성이 80~120%인 조건을 만족하는 농도로 구하였다.
- 농도를 구하였다. 정밀성 (n=5)은 검량선에 의하여 정량한 농도의 표준편차를 농도의 평균값으로 나눈 비의 백분율 (%)로서 구하였다. 하루에 5번 시행하여 일내 정밀성 (C.
- V %로 표시)을 구하였다(Table I). 정확성 (n=5)은 검량선에 의하여 정량한 농도의 평균값을 기지의 농도로 나눈 비의 백분율 (%)로서 구하였다(Table I). 정량한계(0.
- 총괄 지휘하였다. 채혈 방법은 I.V. 카테터 중에 남아 있는 헤파린 처리 생리식염수를 완전히 제거하기 위해 매번 약 1 mL의 혈액을 빼내어 버리고 vacutainer에 9mL의 혈액을 채취하였다. 채혈 후 마다 I.
- 카테터 중에 남아 있는 헤파린 처리 생리식염수를 완전히 제거하기 위해 매번 약 1 mL의 혈액을 빼내어 버리고 vacutainer에 9mL의 혈액을 채취하였다. 채혈 후 마다 I.V. 카테터 중에 잔류하는 혈액의 응고를 방지하기 위하여 주사용 헤파린을 넣은 주사용 생리식염수를 주입하여 잔류 혈액을 혈관 내로 밀어 넣었다. 채혈된 혈액은 3,000이에서 10분간 원심분리 한 후 혈장만을 취하여 eppendorf tube에 옮겨 담고 -70℃ 이하에서 분석 시까지 보관하였다.
- 채혈은 익물의 혈중소실반감기를 토대로 반감기의 3배 이상 (또는 AUC가 AUC의 80%에 해당되는 시점)인 24 hr 동안으로 하였고, 채혈횟수는 약물투약 직전과 투약 후 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 및 24hr의 총 12 시점에서 실시하였다.
- 투약 당일 오전 8시에 시험책임자와 시험담당자인 담당 의사의 감독하에 투약 및 채혈을 하였고 시험 전 과정은 시험책임자가 총괄 지휘하였다. 채혈 방법은 I.
- 피험자들은 투약 후 4시간째 채혈이 끝난 시점과 투약 후 10시간째 채혈이 끝난 시점에서 동일한 식사 (일반식)를 하였다. 투약 후 12시간째 채혈이 끝난 후 전날과 동일한 투숙 장소로 이동하여 휴식을 취하고 밤 10시경에 취침을 하였다. 다음날 오전 8시에 24시간째 채혈(마지막채혈)을 하고 담당 의사에 의해 혈압, 맥박, 기타 이상 유무를 확인하고 제II기 시험을 완료할 때까지 술이나 약물 복용을 일체 금지 하도록 다시 한 번 주의 사항을 주지시킨 후 귀가시켰다.
- 피험자 간 복약시간의 차이는 채혈시간을 고려하여 2분간격으로 하였다.
- 피험자는 시험 전날에 소집되어 일정한 식사를 제공 받은 후 투약 4시간까지 일체의 식이를 제한 받았으며 시험내용 및 일정에 대하여 설명하고 피험자 준수사항을 교육시킨 후 저녁식사를 마친 후 중앙대학교 용산병원 내 임상시험센터에 투숙하였으며 운동, 식사, 흡연, xanthine계 음료 및 음주등을 제한 관리하였고 시험의 목적, 방법, 약물유해반응 가능성 및 이에 대한 대책 등에 대하여 다시 주지시킨 후 오후 10시에 취침하도록 하였다.
- 식사에 의한 영향을 배제하기 위하여 투약 전 10시간 이상 절식한 상태에서 투약 후 4시간까지는 금식 (식수 포함) 상태를 유지시켰다. 피험자들은 투약 후 4시간째 채혈이 끝난 시점과 투약 후 10시간째 채혈이 끝난 시점에서 동일한 식사 (일반식)를 하였다. 투약 후 12시간째 채혈이 끝난 후 전날과 동일한 투숙 장소로 이동하여 휴식을 취하고 밤 10시경에 취침을 하였다.
- 착수하였다. 피험자들의 상완 정맥부위에 22 gauge heparin-locked I.V. catheter> 설치하고 아뎁타를 연결한 후 blank 혈액으로 각각 10mL씩을 채혈하였다. 실수로 인한 채혈시간의 변동을 사전에 방지하기 위해 시험 전에 채혈자에게 채혈시간표를 배부하였으며, 각 피험자에게는 피험자의 번호를 매 채혈 시마다 확인할 수 있도록 시험 전날 지급한 명찰표를 착용하도록 하였다.
- 피험자에 대한 투약은 오전 8시부터 대조약과 시험약 각 1정 (가바펜틴 800 mg/정)을 식수 240 mL와 같이 복용시켰다. 피험자 간 복약시간의 차이는 채혈시간을 고려하여 2분간격으로 하였다.
- 정밀성 (n=5)은 검량선에 의하여 정량한 농도의 표준편차를 농도의 평균값으로 나눈 비의 백분율 (%)로서 구하였다. 하루에 5번 시행하여 일내 정밀성 (C.V. %로 표시)을 구하였고 5일간 실험을 반복 시행하여 일간 정밀성 (C.V %로 표시)을 구하였다(Table I). 정확성 (n=5)은 검량선에 의하여 정량한 농도의 평균값을 기지의 농도로 나눈 비의 백분율 (%)로서 구하였다(Table I).
- 혈중 농도 및 정밀성과 정확성의 계산 - 얻어진 크로마토그램으로 부터 내부표준물질의 피크 면적에 대한 가바펜틴의 피크면적비를 구하여 미리 작성한 검량선으로부터 혈장 중 가바펜틴의 농도를 구하였다. 정밀성 (n=5)은 검량선에 의하여 정량한 농도의 표준편차를 농도의 평균값으로 나눈 비의 백분율 (%)로서 구하였다.
대상 데이터
- 가바펜틴의 표준품과 Clopidogrel (내부표준물질)은 (주)종근당에서 공급받았으며 Ammonium formate, Methanol, Acetonitrile, Formic acid 등은 Merck사"(Darmstadt, Germany) 에서 구입하였고 기타의 모든 분석 시약은 분석용 특급 및 1급 시약을 구입하여 사용하였다.
- 시험약으로 (주)종근당의 가바렙정 800 mg" (제조번호: JA001, 사용기한:2009. 02. 14.), 대조약으로 (주)한국화이자의 ''뉴론틴정 80011(제조번호:22856 사용기한:2008. 10. 31.)을 사용하였다.
- 생물학적 동등성을 평가 하고자 한다. 이 연구에서 사용한 가바펜틴 제제는 (주)한국화이자의 ''뉴론틴정 800 mg 을 대조약으로 하고 (주)종근당의 가바렙정 800 mg" 정을 시험약으로 설정하였다. 두 제제의 생물학적동등성을 평가하기 위하여 조사한 파라미터로는 cmax와 AUC를 주요 평가인 자로 설정하였으며 본 시험은 식품의약품안전청의 임상 계획서승인을 거친 후 임상시험윤리위원회의 감독 하에 국내 규정을 준수하여 실시하였다.
- 검출을 위한 MS/MS조건은 ESI(electrospray ionization) 이온화 방법을 선택하였고 positive ion mode에서 MRM(multiple reaction monitoring) 방법을 사용하여 분석하였다. Collision gas는 Argon을 사용하였고 Nebulizing gas는 질소 가스를 사용하였다. 내부표준물질 Clopidogrel 의 가바펜틴의 precursor 이온은 각각 m/z 322.
- 1 이다. 분석용 칼럼은 Luna HPLC (3 150 mm L.x2.0mm I.D.)을 사용하였다
- 사용한 분석기기의 구성은 HPLC시스템으로 Waters 2795 AllianceHT (Waters, Milford, MA, US A)을 MS/MS 시스템으로 Waters Quattro micromass Premier XE (Waters, Milford, MA, USA)을 사용하였으며 사용한 데이터 처리 장치는 MassLynx 4.1 이다. 분석용 칼럼은 Luna HPLC (3 150 mm L.
- 시험 당일 오전 6시 30분에 피험자 전원을 기상시켜 세면 및 샤워를 하고 중앙대학교 용산병원 내 임싱시험센터로 7시까지 피험자 전원을 소집하여 시험 준비에 착수하였다. 피험자들의 상완 정맥부위에 22 gauge heparin-locked I.
- 채혈 및 관리인원으로는 시험담당자인 전문의 및 약사 1 인, 임상병리사 2인, 채혈보조인원 2인 및 시험책임자로 총 7인을 참여시켰다.
- 피험자는 식품의약품안전청 생물학적동등성시험 기준에 근거하여 19~55세의 건강한 성인으로서 과거에 소화기계, 간장, 신장, 심혈관계, 중추신경계 내분비계 및 혈액 질환의 병력이 없고 현재 타 약물을 복용하고 있지 않은 지원지를 모집 공고하여 지원자 26명을 모집하였다 모집된 피험자는 중앙대학교 용산병원 내 임상시험센터로 피험자 전원을 소집한 후 건강검진을 실시하고 피험자 선정 기준에 합당한 자를 선발하였다.
데이터처리
- 생물학적 동등성 시험 통계처리용 프로그램 (K-BE Test 2007, 1.1.0판)을 이용하여 Tmax를 제외한 각 파라미터들을 로그변환한 값에 대하여 대조약과 시험약의 로그변환한 평균치 차의 90% 신 뢰구간을 구하였다. (주)종근당 “가바렙정 800 mg”과 (주)한 국화이자제약 “뉴론틴정 800mg”에 대한 동등성 여부를 종 합적으로 판단하여 보면 생물학적동등성시험의 판단 기준인 2 항목 (AUCt, Cmax)중 AUC값의 경우 대조약과 시험약의 로그변환한 평균치 차의 90% 신뢰구간이 log0.
- 총 25명이 참가하여 약물 투여 후 각 항목을 산출하였으며 혈장농도 데이터는 K-BE Test 2002 프로그램을 통하여 통계처리 하였으며 대조약과 시험약의 비교평가항목의 실측치를 로그변환하여 유의수준 (a)=0.05에서 분산분석을 실시하였다. 통계처리결과 군간 순서효과에서 F값이 F 분석표의 한계 값인 4.
이론/모형
- LC-MS/MS의 조건 - 전처리된 혈장 시료는 다음의 LC-MS/MS조건에서 정량하였다. 검출을 위한 MS/MS조건은 ESI(electrospray ionization) 이온화 방법을 선택하였고 positive ion mode에서 MRM(multiple reaction monitoring) 방법을 사용하여 분석하였다. Collision gas는 Argon을 사용하였고 Nebulizing gas는 질소 가스를 사용하였다.
성능/효과
- 시험약과 대조약의 용줄특성을 비교하기 위하여 (주)종근당 “가바렙정 800 mg”과 (주)한국화이자제약 "뉴론틴정 800mg의 비교용출시험을 생물학적동등성시험 대상 생산로트에 대하여 의약품동등성시험관리규정에 따라 비교 판정한 결과 두 제제는 용출양상이 동등한 것으로 판정되었다. 용출이 동등하게 판정된 대조약 및 시험약을 피험자에게 투여한 후 구한 시간 별 혈장 중 약물 농도를 그리고 일반적인 약동학적 파라미터를 구하였다.
- 0판)을 이용하여 Tmax를 제외한 각 파라미터들을 로그변환한 값에 대하여 대조약과 시험약의 로그변환한 평균치 차의 90% 신 뢰구간을 구하였다. (주)종근당 “가바렙정 800 mg”과 (주)한 국화이자제약 “뉴론틴정 800mg”에 대한 동등성 여부를 종 합적으로 판단하여 보면 생물학적동등성시험의 판단 기준인 2 항목 (AUCt, Cmax)중 AUC값의 경우 대조약과 시험약의 로그변환한 평균치 차의 90% 신뢰구간이 log0.9480에서 log 1.1711이고, Cm*값의 경우 대조약과 시험약의 로그변환한 평 균치 차의 90% 신뢰구간이 log0.9074에서 logl.1450로서 두 항목 모두 log0.8에서 logl.25이내이어야 한다는 생물학 적동등성시험 기준을 충족시켰다. 따라서 이상의 결과를 종 합하면 시험약인 “가바렙정 800 mg”은 대조약인 “뉴론틴정 800 mg”에 대하여 생물학적동등성시험의 판단 기준인 2항목 (AUC와)에서 모두 동등한 것으로 나타나 이 두 제제는 생물학적으로 동등하다고 생각된다.
- 0.02, 0.06, 4, 8 ng/mL 4가지 농도의 가바펜틴 혈장 표준액을 상기의 검체처리방법으로 처리하여 분석한 본 분석 방법의 정밀성 C.V. %는 일내 정밀성이 3.04~3.50%, 정량 한계농도에서의 일내 정밀성은 10.07%이었고, 일간 정밀성은 2.96-6.70%, 정량한계농도에서의 일간 정밀성은 9.56% 이었다. 일내 정확성은 99.
- 검체를 처리하여 LC-MS/MS로 분석하였을 때 얻어진 크로마토그램은 Fig. 1과 같았으며 가바펜틴 피크의 유지시간은 약 2.90 min, 내부표준물질 피크의 유지시간은 약 1.97 min이었고, 분석조건에서 가바펜틴 및 내부표준물질의 분리상태는 양호하였다.
- 25이내이어야 한다는 생물학 적동등성시험 기준을 충족시켰다. 따라서 이상의 결과를 종 합하면 시험약인 “가바렙정 800 mg”은 대조약인 “뉴론틴정 800 mg”에 대하여 생물학적동등성시험의 판단 기준인 2항목 (AUC와)에서 모두 동등한 것으로 나타나 이 두 제제는 생물학적으로 동등하다고 생각된다.
- 모든 피험자는 투약일 1개월 전부터 투약한 약물이 없었고 과도한 음주와 흡연을 하지 못하도록 관리하였다. 피험자는 시험 전날에 소집되어 일정한 식사를 제공 받은 후 투약 4시간까지 일체의 식이를 제한 받았으며 시험내용 및 일정에 대하여 설명하고 피험자 준수사항을 교육시킨 후 저녁식사를 마친 후 중앙대학교 용산병원 내 임상시험센터에 투숙하였으며 운동, 식사, 흡연, xanthine계 음료 및 음주등을 제한 관리하였고 시험의 목적, 방법, 약물유해반응 가능성 및 이에 대한 대책 등에 대하여 다시 주지시킨 후 오후 10시에 취침하도록 하였다.
- 56% 이었다. 일내 정확성은 99.99-108.70%, 정량한계농도에서의 일 내 정확성은 103.00%이었고, 일간 정확성은 95.67~ 106.60%, 정량한계농도에서의 일간 정확성은 102.00%이 었으며 , 정 량한계는 0.02 pg/mL이었다.
- 05에서 분산분석을 실시하였다. 통계처리결과 군간 순서효과에서 F값이 F 분석표의 한계 값인 4.325보다 작아 교차'시험 설계가 제대로 이루어 졌음을 확인할 수 있었고 로그변환한 AUG와 Cmax가 모두 log0.8에서 logl.25이내에 있어야 한다는 생물학적동등성 평가 기준을 만족시켰다 (Table IV).
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