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문제 정의
- 본 연구에서는 고효율 에탄올 생산을 위해 최적의 전처리 조건을 탐색하고 동시당화발효 공정 (S.S.F. : Simultaneous Saccharification Fermentation)을 이용한 국내산 원료로부터 에탄올의 생산성과 발효수율을 비교하였다. 동시당화발효 공정은당화와 발효공정을 동시에 수행하기 때문에 공정이 간소화될 수 있을 뿐만 아니라 당화효소 투입량을 감소시킬 수 있어서 전체 공정의 비용을 절감할 수 있다.
- 동시당화발효 공정은당화와 발효공정을 동시에 수행하기 때문에 공정이 간소화될 수 있을 뿐만 아니라 당화효소 투입량을 감소시킬 수 있어서 전체 공정의 비용을 절감할 수 있다. 본 연구에서는 국내산원료의 전처리 (호화 및 액화) 공정조건을 최적화하여 에탄올생산성을 높이는데 그 목적이 있다.
제안 방법
- 1 mm이하로 분쇄된 현미, 쌀보리, 옥수수, 절간고구마분말 160 g에 증류수 550 mL (급수 비율 343%)을 가한 후 a-atnylase를 0.2~0.8 g/kg (효소/원료)로 투입하였다. 그리고 <z-amylase 적정온도인 90℃에서 105℃까지 5℃ 간격으로 1시간과 2시간 동안 각각 액화 시켰다.
- Internal standard로는 isopropanol을 사용하였고, carrier gas로는 질소를 사용하였다. Injector, oven, detector의 온도는 각각 200℃, 100℃, 250℃ 이었고, 운전 조건은 100℃에서 1분, 12 ℃/min으로 120℃까지 승온 시킨 후 20℃ /min으로 200℃까지 승온 시켜 3분간 유지하였다.
- 각각의 원료와 전처리 공정에 따른 전분의 입자 구조를관찰하였다. FESEM 분석결과, 현미의 전분입자는 각진 육면체형, 다른 원료의 전분입자는 계란형이었다.
- 공정에 따른 현미, 쌀보리, 옥수수, 절간고구마의 전분 구조를 관찰하기 위하여 분쇄된 입자, 호화공정 후 시료와 액화공정 후 시료를 동결건조 하여 전자주사 현미경으로 (FESEM, Field Emission Scanning Electron Microscope, Hitach Co., S-4300SE) 촬영 하였다.
- 8 g/kg을 넣어 9 5℃에서 2 hr 액화하였다. 그 후 60℃로 냉각하여 0.1 N HCl 로 pH를 4.5로 조절한 후 glucoamylase인 Spirizyme plus 1.0 g/kg 첨가하여 60℃ 에서 18 hr 당화 후 1 L로 mass-up하여 HPLC로 분석하였다.
- 25%-NaOH 용액에 24시간 동안 교반 시켜서단백질을 추출 한다. 그 후 각 원료들을 50, 100, 270 mesh sieve를 이용하여 차례로 걸러주면서 0.2%-NaOH 용액을흘려주며 단백질을 제거한다. 270 mesh까지 통과한 전분들만을 모아 여러 번 세척 후, 뷰렛반응으로 단백질이 완전히 제거된 것을 확인하고 45℃로 건조하여 다시 100 mesh sieve를통과한 분말을 시료로 사용하였다.
- 발효의 진행 정도를 알아보기 위하여 배양액 내의 에탄올함량과 잔당 (RDS, residual direct reducing sugar)성분을 분석하였다. 에탄올 함량은 배양액 50 mL를 간이 증류를 하여 얻은증류액을 gas chromatography (Agilent)를 이용하여 분석하였다.
- 산당화법과 Osmometer의 변형된 효소당화법(8)으로 생성된 환원당을 HPLC로 분석하여 전분가 (starch value)를 계산하였다.
- 액화-최적 액화 조건을 탐색하기 위하여 온도, 시간 그리고 a-amylase양의 변화에 따른 액화율을 알아보았다. 액화가 진행됨에 따라서 각 원료의 전분 고형물이 액체 상태로 전이되는원리를 응용하여 전체 부피 중 액체량을 측정하여 액화율을나타내었다.
- 그리고 <z-amylase 적정온도인 90℃에서 105℃까지 5℃ 간격으로 1시간과 2시간 동안 각각 액화 시켰다. 액화가 진행됨에 따라 전체 부피와 액층의 부피를 백분율로 계산하여액화율을 측정하였다.
- 변화에 따른 액화율을 알아보았다. 액화가 진행됨에 따라서 각 원료의 전분 고형물이 액체 상태로 전이되는원리를 응용하여 전체 부피 중 액체량을 측정하여 액화율을나타내었다. Rg.
- 에탄올 함량은 배양액 50 mL를 간이 증류를 하여 얻은증류액을 gas chromatography (Agilent)를 이용하여 분석하였다. 사용된 columne Supelco 6.
- 잔당의 함량은 HPLC (전분가 분석과 동일 방법)를 이용하여 glucose 함량을 분석하였다.
- 호화 및 액화 공정의 최적조건 탐색결과를 바탕으로 현미, 쌀보리, 옥수수, 절간고구마를 동시당화발효 공정으로 에탄올을 생산하여 각 원료별로 비교해 보았다(Table 3).
- 호화-전분의 호화 양상을 측정하는 방법으로 전분 현탁액을가열하면서 온도에 따라 변화되는 전분액의 투명도 (clarity) 로 측정하였다. 호화되는 단계에서 전분입자는 결정형 구조가무정형으로 바뀌면서 투명도가 급격히 증가하는 현상이 나타났다(Fig.
- 호화도 측정을 위해 전처리된 원료들을 각각 0.1 w/v% 원료혼합액을 제조하여 50~95℃ 까지 5 ℃ 간격으로 5분간 유지 후 UV Spectrometer (UV-1650PC, Shimadzu)를 이용하여 A =625 nm 에서 광투과도를 측정하였다.
대상 데이터
- 2%-NaOH 용액을흘려주며 단백질을 제거한다. 270 mesh까지 통과한 전분들만을 모아 여러 번 세척 후, 뷰렛반응으로 단백질이 완전히 제거된 것을 확인하고 45℃로 건조하여 다시 100 mesh sieve를통과한 분말을 시료로 사용하였다.
- HPLC분석에 사용된 컬럼은 RSpack KC-811 (8 mm I.D. x 300 mm) column을 사용하였고 검출기는 Refractive Index Detector (Waters 2414)을 사용하였다. 이동상으로 Q025 v/v% H2SO4용액을 분당 1 mL로 흘려 보냈다.
- 발효공정에 사용된 균주는 에탄올 생산 공장 주변 토양으로부터 분리한 고생산성 에탄올 발효 효모 Saccharomyces cerevisiae CHY 1011 (KCTC 11250BP)를 이용하였고, YPD배지 (2.5 g/L yeast extract, 2.5 g/L peptone, 100 g/L glucose, 0.25 g/L MgSO4 . 7H2O, 1 g/L K2HPO4)를 이용해 배양하였다.
- 에탄올 함량은 배양액 50 mL를 간이 증류를 하여 얻은증류액을 gas chromatography (Agilent)를 이용하여 분석하였다. 사용된 columne Supelco 6.6% CARBOWAX 20 M이고, detector는 FID 이다. Internal standard로는 isopropanol을 사용하였고, carrier gas로는 질소를 사용하였다.
- 사용된 원료는 음료용 에탄올 생산에 사용되고 있는 국내산 현미, 쌀보리, 옥수수, 절간고구마를 1 mm 이하로 분쇄하여이용 하였다. 전분 액화에 사용된 효소는 Bacillus licheniformis 에서 생산된 a-amylase인 Termamyl 120 L (Novozyme)을 사용하였고, 당화에는 glucoamylase인 Spirizyme plus (Novozyme) 를 이용하였다.
- 하였다. 전분 액화에 사용된 효소는 Bacillus licheniformis 에서 생산된 a-amylase인 Termamyl 120 L (Novozyme)을 사용하였고, 당화에는 glucoamylase인 Spirizyme plus (Novozyme) 를 이용하였다.
이론/모형
- 원료 내 전분 함량을 산당화법과 효소당화법으로 분석하였다. 대부분의 곡류는 ribose등 효모에 의하여 에탄올로 전환될 수 없는 비발효성 당을 많이 함유하고 있기 때문에 산당화법에 의한 분석만으로는 정확한 발효성 당 함량을 측정할 수없다.
성능/효과
- 3은 각 원료 별로 X축은 효소농도 y축은 온도와 시간, z축은 액화율로 하여 3차원 등고선 그래프를 이용해나타낸 그림이다. Fig. 3을 보면 현미와 옥수수는 KXTC 이상에서 급격히 액화가 진행되어 온도에 의해서 액화율이 크게영향을 받는 것으로 나타났으며, 절간고구마는 온도 보다는반웅 (체류) 시간의 차이가 액화율에 크게 영향을 미치는 것으로 나타났다. 각 원료에 따른 액화의 최적 조건을 Table 2 에 나타내었다.
- Table 1에각 원료별 호화 개시점을 나타내었다. 각 원료별로 호화 개시점은 현미의 경우 55℃로 가장 낮았으며 그 다음으로 쌀보리가 60℃, 옥수수와 절간고구마는 65℃로 나타났다.
- 0 g/L 로 나타났다. 그리고에탄올 전환수율은 옥수수가 90.54%로 가장 높게 나타났고그 뒤를 이어 절간고구마가 86.73%, 쌀보리가 85.75%로 나타났으며 현미는 78.81%로 가장 낮게 나타났다. 대부분 원료에서전분의 함량과 에탄올 전환수율은 비례하였으나 현미의 경우는 특이하게도 가장 높은 전분가를 가지고 있음에도 불구하고가장 낮은 전환수율 보였다.
- 모든 원료에서 효소당화법보다 산당화법이 높게 즉정되었다. 효소당화법은 효소에 의하여 발효가 가능한 환원당만이 측정되지만 산당화법은 원료에 포함된 모든 환원당의 양을 측정하기 때문이다.
- 호화가 되면전분입자 사이로 수분이 침투하여 전분 입자가 파괴되면서벌집모양으로 변했다. 특히 전분입자가 조밀한 현미와 쌀보리는 그 모양이 더욱 뚜렷하였으며, 그 후 액화가 진행됨에 따라전분입자는 더욱 파괴되어 형체를 알아 볼 수 없게 변화 됨을 알 수 있었다.
- 한편 호화도가 증가하는 경향을 살펴보면, 절간고구마를제외한 모든 원료에서 호화 개시점 온도에서 70~80t 까지는서서히 증가하다 급격히 투명도가 증가하는 현싱■이 나타났다. 이는 원료가 가지고 있는 전분입자의 조밀성의 영향 때문으로판단되는데 절간고구마는 입자가 조밀하지 못하기 때문에 낮은온도에서도 쉽게 수분이 침투하여 전분입자의 결정이 깨뜨려져 투명도가 서서히 증가한다.
- 측정하였다. 호화되는 단계에서 전분입자는 결정형 구조가무정형으로 바뀌면서 투명도가 급격히 증가하는 현상이 나타났다(Fig. 2). 바로 이 시점을 호화 개시점이라 할 수 있다.
후속연구
- 이는 원료에 따라효모의 적응속도와 기질 이용능력이 다르다는 것을 말해준다. 그러므로 보다 효율적이고 고생산성의 에탄올 공정을 위해서는 원료에 따른 특성뿐만 아니라 발효에 크게 영향을 미치는조효소나 보조인자의 역할에 대해서도 많은 연구가 필요할것으로 판단된다.
- 이는 현미 자체에 효모의 생장에필요한 요구성 영양물질이 부족하거나 기질 내에 발효 저해물질이 존재하기 때문인 것으로 사료된다. 이 부분에 대해서는더욱더 심화된 연구를 통하여 이 문제를 해결한다면 높은 전분가를 가지고 있는 현미는 에탄올 생산에 있어서 아주 효율적인 원료가 될 수 있을 것이라 판단된다.
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