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문제 정의
- 또한 같은 비용 및 노력을 투하한다면 조직배양의 효율성 특히 재분화율을 높이는 것이 형질전환의 효용성을 높일 수 있는 가장 효과적인 방법이 될 수 있다. 따라서 본 연구는 국화의 형질전환 효율 향상을 위한 조건을 구명하기 위하여 적정 품종을 선정하고 재분화율을 향상시키는 주요한 방법들인 식물체에 적당한 기본배지를 선정하거나 탄소공급원의 변화나 배지응고제의 선택 그리고 기본적으로 재분화에 효율성이 있다고 알려진 화학물질을 배지 내에 첨가시키는 방법에 대하여 검토하고자 하였다.
- 형질전환을 위하여 선발된 각 품종의 유전적 특성에 따른 배양 및 배지조건을 설정하기 위하여 배양부위 및 기본배지, 탄소원 및 농도, 배지응고제원 및 농도를 정하는 연구를 수행하였다. 조직배양을 위하여 생장조절제를 단용 또는 혼용으로 처리 하였는데 auxin 계열로 NAA, 2, 4-D, IAA가 사용되 었고 cytokinin 계열로 BA, kinetin, 2ip, TDZ 등이 0.
제안 방법
- 첨가하여 신초분화율과 신초수 형성 정도를 관찰하였다. Polyamine 은 putrescine, spermidine, spermine 3종을 사용하였고 처 리농도는 polyamine과 AgN0 공히 5, 10, 15, 20, 25, 50 mg/L 이었다.
- 국화의 최적 분화 및 기내생장에 적합한 배지를 선발하고자 MS, B5, white, LS, SH 배지를 배지표에 따라 조성하여 사용하였다. 치상부위는 7-8 매 유엽 전개시의 줄기로 잎을 제거한 후 0.
- 시험을 실시하였다. 배양부위는 잎과 엽병, 줄기로 3분하였으며 배양 8주후에 캘러스 형성과 신초형성을 위주로 배양반응을 조사하였다. 배양결과 기관별 반응양상이 상이하였는데 잎을 배양재료로 하는 경우에는 캘러스가 100% 발생하여 embryogenic 캘러스로의 전환 그리고 신초가 발생하는 형태로 배양반응이 진행되었으나, 엽병과 줄기에서는 주로 캘러스 형성과정을 거치지 않고 배양체로부터 신초가 직접 발생하는 directing shooting 이 주로 일어나 신초발생시 소요되는 기간이 단축되고형성율이 상대적으로 높게 나타났으며 발생하는 신초수도 상대적으로 많았다.
- 배양조건을 설정하기 위하여 우선 적절한 배양부위를 설정하는 시험을 실시하였다. 배양부위는 잎과 엽병, 줄기로 3분하였으며 배양 8주후에 캘러스 형성과 신초형성을 위주로 배양반응을 조사하였다.
- 5%, 3%, 6%로 공시하여 캘러스형성율과 기관분화 정도를 조사하였다. 배지응고제 선발을 위하여 agar 와 phytagel 을 일정량씩 배지에 투입하였는데 agar 는 0.8%, 1.0%,1.2% 농도로 투입하였고 phytagele 0.2%, 0.3%, 0.4%를 첨가하였다.
- 생장조절제 처리에 따라 선발된 활력이 우수한 5개 품종을 대상으로 최상의 기관 분화율을 보일 수 있는 배양 및 배지조건을 설정하였다.
- 식물체 분화에 효과가 있다고 알려진 polyamine과 AgNO3 을 선발된 국화 5품종을 대상으로 조직배양 배지에 첨가하여 신초분화율과 신초수 형성 정도를 관찰하였다. Polyamine 은 putrescine, spermidine, spermine 3종을 사용하였고 처 리농도는 polyamine과 AgN0 공히 5, 10, 15, 20, 25, 50 mg/L 이었다.
- 특히 국화는 현재 재배하는 품종 중 외국 육성 품종점유 비율이 높지만 우수 형질의 국내 육성 품종들이 꾸준히 증가하고 있어 생명공학 분야에서도 그 시험재료를 국산 품종으로 대체해야 할 필요성이 강하게 제기되고 있다. 이러한 필요성을 감안하여 국내 육성 품종을 위주로 하고 국내 시장 점유율이 높은 외국산 품종을 대비로 하여 28품종의 국화 품종을 수집하여 (Table 1) 기내화 과정을 거친 후 이를 재료로 하여 조직배양을 시행하고 생장조절제 처리에 따른 조직배양의 반응성을 조사하였다. 각 수집된 품종들을 생장조절제를 단용처리하여 각 품종별 반응성을 조사한 결과, 품종별로 각자 왕성하게 반응하는 생장조절제가 구분되었는데 수방력, 백선, 금수, 예스모닝, 백마, 오렌지메모리, 일월, 차밍아이, 써니팡팡, 등 9종은 NAA 에 활발하게 반응하였으며 신마, 백광 등 2품종은 BA에 그리고 포드, 플레져다모르, 핑크 프라이드, 핑크팡팡 등 4품종은 kinetin 반응형으로 구분되었다 (Table 2).
- 나머지 14품종은 특별하게 뛰어난 분열효과를 나타내는 생장조절제가 없이 70% 이하의 캘러스형성율을 보여 대체적으로 낮은 분열반응 특성을 나타내었다 (Data was not shown). 이상 생장조절제 단용처리에 대하여 우수한 분열효과를 보인 13품종을 대상으로 auxin 과 cytokinin 혼용처리 효과를 분석하였다
- 0 mg/L 농도로 첨가되었다. 적절한 배양부위를 정하기 위하여 배양재료를 크게 잎, 줄기, 엽병으로 구분하여 배양하고 신초 분화율 및 분화기간을 관찰함으로서 배양의 효율성을 비교하였으며 MS, B5, White, SH, LS (Murashige and Skoog. 1962; Bhojwani et al. 1989; Linsmaier and Skoog. 1965) 등 5종을 공시하여 기본배지를 설정하고 탄소원으로는 sucrose와 fructose 그리고 lactose 를 1.5%, 3%, 6%로 공시하여 캘러스형성율과 기관분화 정도를 조사하였다. 배지응고제 선발을 위하여 agar 와 phytagel 을 일정량씩 배지에 투입하였는데 agar 는 0.
- 연구를 수행하였다. 조직배양을 위하여 생장조절제를 단용 또는 혼용으로 처리 하였는데 auxin 계열로 NAA, 2, 4-D, IAA가 사용되 었고 cytokinin 계열로 BA, kinetin, 2ip, TDZ 등이 0.1~5.0 mg/L 농도로 첨가되었다. 적절한 배양부위를 정하기 위하여 배양재료를 크게 잎, 줄기, 엽병으로 구분하여 배양하고 신초 분화율 및 분화기간을 관찰함으로서 배양의 효율성을 비교하였으며 MS, B5, White, SH, LS (Murashige and Skoog.
- 사용하였다. 치상부위는 7-8 매 유엽 전개시의 줄기로 잎을 제거한 후 0.5 cm 길이로 잘라 사용하였으며 각 배지에 NAA 1.0 mg/L 과 BA 1.0 mg/L 의 생장조절제를 첨가하여 캘러스 및 체세포배와 신초분화를 유도하였다. B5배지에서 국화 줄기를 배양할 경우 전체적으로 분화하는 세포가 적어 캘러스 발생률이 떨어졌으며 발생한 캘러스도 배발생캘러스 비율이 낮게 형성되었다.
대상 데이터
- 국화에 있어서 효율적 형질전환 체계를 구축하기 위하여 국내외에서 육종되고 시장지배력이 강한 34개의 품종을 수집하고 이 중 우수한 신초생성 능력을 가진 5개 품종인 수방력, 백마, 신마, 핑크프라이드, 금수 등을 선발하였다. 이들 품종에 적합한 생장조절제를 선발한 결과 5개 품종에 공통으로 적용할 수 있는 생장조절제 처리는 1.
- 형질전환의 기초단계인 조직배양 단계에서 효율성 강화를 목적으로 배양기간 및 배양의 난이도와 높은 재분화율 특성을 가진 국화품종을 선발하기 위하여 원예작물전문육종기 관인 원예 연구소와 예산국화시험장 그리고 화훼자원연구소로부터 국내외 육성 품종 28종을 수집하여 기내증식 하여 조직배양의 재료로 사용하였다. 수집된 품종 중 5종은 대국 (standard type) 이었고 나머지 23종은 소국 (spray type) 이 었다 (Table 1).
성능/효과
- 따라서 국화 배양에 있어서 putrescine, spermidine, spermine 등 polyamine 이 체세포성 배의 발생정도 및 식물체의 분화와 발생에 미치는 영향을 구명하고 체세포배의 발생을 극대화시킬 수 있는 적정 농도를 밝히고자 수행한 시험결과는 표 8 과 같다. Triamine 인 spermidine 과 tetramine 인 spermine, putrescine 의 체세포배 발생 촉진효과는 선발된 4개 품종의 거의 대부분의 처리농도에서 발생하였는데 품종별로 약간의 차이는 있었으나 최대 8% 이상의 신초 생성증가와 leaf disc 당 1.2개의 신초수 증가 효과를 나타내었다. 처리별로 효과를 살펴보면 품종별로 약간의 상이한 패턴을 나타내는 경우도 있었으나 가장 효율적인 처리농도는 3종류 polyamine 모두에서 10~15 mg/L 이었으며 체세포배의 발생과 신초 분화 및 생장 발달을 위한 가장 적절한 polyaminee putrescine 이었다.
- 이러한 필요성을 감안하여 국내 육성 품종을 위주로 하고 국내 시장 점유율이 높은 외국산 품종을 대비로 하여 28품종의 국화 품종을 수집하여 (Table 1) 기내화 과정을 거친 후 이를 재료로 하여 조직배양을 시행하고 생장조절제 처리에 따른 조직배양의 반응성을 조사하였다. 각 수집된 품종들을 생장조절제를 단용처리하여 각 품종별 반응성을 조사한 결과, 품종별로 각자 왕성하게 반응하는 생장조절제가 구분되었는데 수방력, 백선, 금수, 예스모닝, 백마, 오렌지메모리, 일월, 차밍아이, 써니팡팡, 등 9종은 NAA 에 활발하게 반응하였으며 신마, 백광 등 2품종은 BA에 그리고 포드, 플레져다모르, 핑크 프라이드, 핑크팡팡 등 4품종은 kinetin 반응형으로 구분되었다 (Table 2). 나머지 14품종은 특별하게 뛰어난 분열효과를 나타내는 생장조절제가 없이 70% 이하의 캘러스형성율을 보여 대체적으로 낮은 분열반응 특성을 나타내었다 (Data was not shown).
- 결과이다. 결과를 보면 탄소원을 첨가하지 않은 배지에서는 캘러스의 발생 및 분화가 전혀 이루어지지 않아 배지조성에 탄소원이 반듯이 첨가되어야 함을 알 수 있었다. 배지 내 탄소원 첨가 농도별 기관분화 양상을 보면 배양 12주 경과 탄소원 3.
- 1991). 공시된 품종들 간의 분열능력을 상호 비교해본 결과, 대국형인 수방력, 백마, 신마, 백선 등 4품종과 핑크프라이드, 금수 등 소국형 2품종이 생장조절제 조합에 따라 100%의 캘러스 형성 을보이면서 큰 반응활력을 가진 품종으로 평가되어 조직배양 및 형질전환에 적합한 품종으로 선발되었다. 또한 품종 간 신초발생정도 및 발생수를 비교한 것이 그림 2이다.
- 이에 비해 MS 와 LS 그리고 SH 배지는 상대적으로 높은 분열반응을 이끌어 내었는데 품종별로 약간의 차이는 있었으나 3종류의 배지 모두에서 대체적으로 90% 이상의 캘러스 형성률을 나타내었다. 그러나 신초형성 반응에서는 3종류 배지 간에 차이를 나타내었는데 MS 배지에서 80.6%의 신초형성 반응을 보인 백마를 제외하고 수방력의 96.4%를 포함하여 신초 형성율을 90% 이상으로 유지시킨 반면 LS 와 SH 배지는 수방력과 핑크프라이드 품종을 제외하고는 신초형성율이 60% 대로 하락하여 상대적으로 기관분화 유도 능력이 저하되는 것을 알 수 있었다 (Table 4).
- 또한 품종 간 신초발생정도 및 발생수를 비교한 것이 그림 2이다. 그림 3에 의하면 캘러스로부터 신초가 100% 발생된품종은 역시 반응활력이 뛰어난 5개 품종이었으며 생성된 개체수도 배양절편 하나 당 최대 4.8 개 까지 발생하여 높은 신초생성 능력을 가지고 있음이 확인되었다.
- 각 수집된 품종들을 생장조절제를 단용처리하여 각 품종별 반응성을 조사한 결과, 품종별로 각자 왕성하게 반응하는 생장조절제가 구분되었는데 수방력, 백선, 금수, 예스모닝, 백마, 오렌지메모리, 일월, 차밍아이, 써니팡팡, 등 9종은 NAA 에 활발하게 반응하였으며 신마, 백광 등 2품종은 BA에 그리고 포드, 플레져다모르, 핑크 프라이드, 핑크팡팡 등 4품종은 kinetin 반응형으로 구분되었다 (Table 2). 나머지 14품종은 특별하게 뛰어난 분열효과를 나타내는 생장조절제가 없이 70% 이하의 캘러스형성율을 보여 대체적으로 낮은 분열반응 특성을 나타내었다 (Data was not shown). 이상 생장조절제 단용처리에 대하여 우수한 분열효과를 보인 13품종을 대상으로 auxin 과 cytokinin 혼용처리 효과를 분석하였다
- 4% 정도를 유지해 가장 우수한 결과를 나타내었는데 이는 배양 8주에 재분화율이 정점을 나타낸 후 (Data was not shown) 지속적으로 유지된 결과로서 배양기간은 8주 정도가 적합하였다. 당 처리 농도별 신초 발생 양상을 비교해보면 1.5% 처리에서는 전체적으로 신초발생이 약하고 분화된 신초도 적은 것으로 보아 국화 배양시 요구되는 최소 당 공급량이 1.5% 보다는 높은 것을 알 수 있었으며 4.5%와 6.0%의 고농도 처리 역시 신초생성율 하락과 분화수의 감소 현상을 발생시키는 결과를 나타내었는데 6.0% 처리 시 신초 분화율이 3.0% 처리에 비해 39.4% 하락하였고 분화되는 개체수도 절편 체당 0.8 개 감소하였다 이러한 경향은 뿌리 발생 과정에서 조금 더 현저하게 확인되었는데 절편체당 형성되는 뿌리분화수가 5.4 개로 3.0%의 7.0 개에 비하여 1.6 개나 감소하였고 생성된 뿌리의 길이도 3.4 cm 로 1.8 cm 짧았다 (Table 7). 이러한 결과는 백합의 인편 조직배양에서도 확인 할 수 있었는데 (Takayama and Misawa.
- 처리별로 효과를 살펴보면 품종별로 약간의 상이한 패턴을 나타내는 경우도 있었으나 가장 효율적인 처리농도는 3종류 polyamine 모두에서 10~15 mg/L 이었으며 체세포배의 발생과 신초 분화 및 생장 발달을 위한 가장 적절한 polyaminee putrescine 이었다. 대체적으로 국화에서의 polyamine 처리는 높은 농도 보다는 낮은 농도 처리가 효율적이었는데 0~15의 낮은 농도처리에서의 4품종 평균신초 발생율이 94.2%로 25~50 mg/L 의 고농도 처리에 비하여 2.4% 높게 형성되는 것을 확인할 수 있었다 (Table 8, Fig. 5).
- 배양부위는 잎과 엽병, 줄기로 3분하였으며 배양 8주후에 캘러스 형성과 신초형성을 위주로 배양반응을 조사하였다. 배양결과 기관별 반응양상이 상이하였는데 잎을 배양재료로 하는 경우에는 캘러스가 100% 발생하여 embryogenic 캘러스로의 전환 그리고 신초가 발생하는 형태로 배양반응이 진행되었으나, 엽병과 줄기에서는 주로 캘러스 형성과정을 거치지 않고 배양체로부터 신초가 직접 발생하는 directing shooting 이 주로 일어나 신초발생시 소요되는 기간이 단축되고형성율이 상대적으로 높게 나타났으며 발생하는 신초수도 상대적으로 많았다.
- 결과를 보면 탄소원을 첨가하지 않은 배지에서는 캘러스의 발생 및 분화가 전혀 이루어지지 않아 배지조성에 탄소원이 반듯이 첨가되어야 함을 알 수 있었다. 배지 내 탄소원 첨가 농도별 기관분화 양상을 보면 배양 12주 경과 탄소원 3.0% 공급 처리에서 신초 생성율 97.2%와 발근율 90.4% 정도를 유지해 가장 우수한 결과를 나타내었는데 이는 배양 8주에 재분화율이 정점을 나타낸 후 (Data was not shown) 지속적으로 유지된 결과로서 배양기간은 8주 정도가 적합하였다. 당 처리 농도별 신초 발생 양상을 비교해보면 1.
- 수집된 품종 중 5종은 대국 (standard type) 이었고 나머지 23종은 소국 (spray type) 이 었다 (Table 1).
- 이들 품종에 적합한 생장조절제를 선발한 결과 5개 품종에 공통으로 적용할 수 있는 생장조절제 처리는 1.0 mg/L NAA 와 1.0 mg/L BA 의 혼용처리 이었으며 수방력에는 3.0 mg/L NAA 와 1.0 mg/L kinetin 처리가, 금수에는 0.5 mg/L NAA 와 3.0 mg/L BA 처리가 역시 효율적으로 적용되었다. 캘러스 유도와 재분화 능력을 종합적으로 검토한 결과 기본배지는 MS, 배지응고제는 phytagel 0.
- 1989). 이에 비해 MS 와 LS 그리고 SH 배지는 상대적으로 높은 분열반응을 이끌어 내었는데 품종별로 약간의 차이는 있었으나 3종류의 배지 모두에서 대체적으로 90% 이상의 캘러스 형성률을 나타내었다. 그러나 신초형성 반응에서는 3종류 배지 간에 차이를 나타내었는데 MS 배지에서 80.
- 4%로 상당히 큰 신초형성율 향상 효과를 나타내었다 (Table 5). 적정 사용농도도 품종 간 약간의 차이를 나타내었는데 백마의 경우 phytagel0.4% 가 가장 우수한 효과를 보인 반면 다른 품종들은 모두 phytagel 0.3%에서 가장 효과적이었다.
- 2개의 신초수 증가 효과를 나타내었다. 처리별로 효과를 살펴보면 품종별로 약간의 상이한 패턴을 나타내는 경우도 있었으나 가장 효율적인 처리농도는 3종류 polyamine 모두에서 10~15 mg/L 이었으며 체세포배의 발생과 신초 분화 및 생장 발달을 위한 가장 적절한 polyaminee putrescine 이었다. 대체적으로 국화에서의 polyamine 처리는 높은 농도 보다는 낮은 농도 처리가 효율적이었는데 0~15의 낮은 농도처리에서의 4품종 평균신초 발생율이 94.
- 0 mg/L BA 처리가 역시 효율적으로 적용되었다. 캘러스 유도와 재분화 능력을 종합적으로 검토한 결과 기본배지는 MS, 배지응고제는 phytagel 0.3% 그리고 폴리아민인 putrescine을 10-15 mg/L로 처리할 경우 재분화율이 8% 정도 향상되었으며 배양재료로 줄기를 사용할 경우 기관분화율이 26% 정도 향상되었으며 기관분화 소요일수도 14일 단축시킬 수 있었다.
- 품종별 혼용처리에 따른 캘러스 발생률을 분석해보면 포드 품종에서와 같이 생장조절제 혼용 처리가 단용처리에 비하여 오히려 캘러스 생성율이 떨어지는 경향을 보이는 품종도 있었지만 대체적으로 혼용처리 하는 경우 캘러스 발생률이 8.6~24.8% 까지 상승하였다. 혼용처리 중 가장 양호한 상승효과를 보인 조합은 NAA와 BA 이었는데 NAA 0.
- 8% 까지 상승하였다. 혼용처리 중 가장 양호한 상승효과를 보인 조합은 NAA와 BA 이었는데 NAA 0.1~3.0 mg/L 와 BA 0.5~3.0 mg/L를 혼용처 리하는 것이 양호하였으며 품종 간 약간의 차이는 있었지만 NAA는 낮은 농도인 1.0 mg/L 처리 에서 BA 1.0 mg/L를 혼용처리 하는 것이 평균적으로 높은 캘러스 형성과 신초발생률 및 발생수를 나타내었다 (Table 2). 이러한 생장조절제 혼용처리 조합은 Liu 등 (1986) 과 Choi 등 (1986)이보고 한 바와 같이 배양 중 체세포배의 발생을 유도하기 위해서는 2, 4-D를 고농도에서 저농도로 낮추거나 아주 제거한 배지에서 효율적이라는 기존의 보고서와 일치한결과를 나타내었다 (Carla et al.
후속연구
- 또한 Sakurai 와 Masuda (1977)의 Petroselinum hortens 의 배유조직과 Ilex 의 미숙 배 및 Smith 와 Krikorian (1980)의 보고서에서의 당근의 접합자 배의 경우는 생장조정제를 첨가하지 아니할 때에도 체세포배의 발생이 일어난다고 하였다. 그러나 국화의 경우에는 생장조절제 무첨가시 캘러스 형성 및 기관 발생이 거의 이루어지지 않고 있으며 캘러스의 질적 변화에 의한 기관 형성이 일정 비율로 이루어지고 있어 캘러스의 체세포배 발생 정도를 높이고 신초발생 양상을 양호하게 이끌 수 있는 첨가제의 처리 효과를 검정할 필요성이 제기되었다.
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