지역 특산 천연산물 전호, 파고지, 희첨 및 산수유의 항비만효과 규명 Exmination of Anti-Obesity Effect of Regional Special Natural Products of Anthrisci radix, Psoraleae semen, Siegesbeckiae herba and Corni fructus원문보기
본 연구에서는 신생혈관형성 제어에 바탕을 둔 비만세포제어 정도를 확인하기 위하여 4가지 지역 천연산물인 전호(Anthrisci radix), 파고지 (Psoraleae semen), 희첨 (Siegesbeckiae herba) 및 산수유 (Corni fructus)를 이용한 지방 축적물 변화 및 기전을 확인하기 위해 3T3-L1 adipocyte를 이용한 Oil Red O 염색 및 western blot을 실시하였다. 그 결과 전호, 파고지, 희첨, 산수유의 세포 독성 이내의 농도 증가에 따라 지방 축적물이 감소됨을 보였다. 또한 western blot을 위해 lipogenesis와 관련된 SREBP-1 및 adipogenesis와 관련된 $PPAR\gamma$와 C/$EBP\alpha$의 신호전달 정도를 확인한 결과 4가지 지역 천연산물의 농도 증가에 따라 단백질의 발현양이 감소됨을 확인하였다. 이는 4가지 지역 천연산물 추출물이 지방분화와 관련된 신호분자를 차단함으로써 지방형성이 억제되었음을 보였다. 따라서 4가지 지역 천연산물인 전호, 파고지, 희첨 및 산수유는 신생혈관형성 억제에 따른 항비만제제로서의 이용 가능함을 시사하였다.
본 연구에서는 신생혈관형성 제어에 바탕을 둔 비만세포제어 정도를 확인하기 위하여 4가지 지역 천연산물인 전호(Anthrisci radix), 파고지 (Psoraleae semen), 희첨 (Siegesbeckiae herba) 및 산수유 (Corni fructus)를 이용한 지방 축적물 변화 및 기전을 확인하기 위해 3T3-L1 adipocyte를 이용한 Oil Red O 염색 및 western blot을 실시하였다. 그 결과 전호, 파고지, 희첨, 산수유의 세포 독성 이내의 농도 증가에 따라 지방 축적물이 감소됨을 보였다. 또한 western blot을 위해 lipogenesis와 관련된 SREBP-1 및 adipogenesis와 관련된 $PPAR\gamma$와 C/$EBP\alpha$의 신호전달 정도를 확인한 결과 4가지 지역 천연산물의 농도 증가에 따라 단백질의 발현양이 감소됨을 확인하였다. 이는 4가지 지역 천연산물 추출물이 지방분화와 관련된 신호분자를 차단함으로써 지방형성이 억제되었음을 보였다. 따라서 4가지 지역 천연산물인 전호, 파고지, 희첨 및 산수유는 신생혈관형성 억제에 따른 항비만제제로서의 이용 가능함을 시사하였다.
4 kinds of Regional Special Natural Products (RSNPs), such as Anthrisci radix, Psoraleae semen, Siegesbeckiae herba and Corni fructus were examined to verify for anti-obesity effect. $PPAR\gamma$ (peroxisome proliferator-activated receptor $\gamma$) from 3T3-L1 cell concerning ...
4 kinds of Regional Special Natural Products (RSNPs), such as Anthrisci radix, Psoraleae semen, Siegesbeckiae herba and Corni fructus were examined to verify for anti-obesity effect. $PPAR\gamma$ (peroxisome proliferator-activated receptor $\gamma$) from 3T3-L1 cell concerning adipocyte differentiation was suppressed by different concentraton of 4 RSNPs with western blot, when treated RSNPs' extract and MDI (IBMX, Dexamethasone, Insulin) at the same time. Also, SREBP-1 (Sterol regulatory element binding protein) controlling lipogenesis and $PPAR\gamma$ expression levels were reduced by these 4 RSNPs' extract, when these chemicals after differentiation of 3T3-L1 cell. And lipid droplets were reduced by 7.5%, 14.4%, 18.3% and 30% at different concentration of Anthrisci radix from Oil Red O staining. Also, it was reduced by 2%, 4.9%, 9.3% and 38% at different concentration of Psoraleae semen. For Siegesbeckiae herba, it was inhibited by 1.4%, 6.4%, 16.4% and 30.1%, respectively. And Corni fructus was also showed by 0.9%, 6.3%, 13.7% and 33% at same concentration of Siegesbeckiae herba. These 4 kinds of RSNPs were expected for a useful material for anti-obesity materials.
4 kinds of Regional Special Natural Products (RSNPs), such as Anthrisci radix, Psoraleae semen, Siegesbeckiae herba and Corni fructus were examined to verify for anti-obesity effect. $PPAR\gamma$ (peroxisome proliferator-activated receptor $\gamma$) from 3T3-L1 cell concerning adipocyte differentiation was suppressed by different concentraton of 4 RSNPs with western blot, when treated RSNPs' extract and MDI (IBMX, Dexamethasone, Insulin) at the same time. Also, SREBP-1 (Sterol regulatory element binding protein) controlling lipogenesis and $PPAR\gamma$ expression levels were reduced by these 4 RSNPs' extract, when these chemicals after differentiation of 3T3-L1 cell. And lipid droplets were reduced by 7.5%, 14.4%, 18.3% and 30% at different concentration of Anthrisci radix from Oil Red O staining. Also, it was reduced by 2%, 4.9%, 9.3% and 38% at different concentration of Psoraleae semen. For Siegesbeckiae herba, it was inhibited by 1.4%, 6.4%, 16.4% and 30.1%, respectively. And Corni fructus was also showed by 0.9%, 6.3%, 13.7% and 33% at same concentration of Siegesbeckiae herba. These 4 kinds of RSNPs were expected for a useful material for anti-obesity materials.
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문제 정의
특히, 지역의 다양한 특산물을 신생혈관형성 억제작용에 이용한다면, 부작용이 적고, 원료구입의 용이함과 1차 산업 생산물을 가공하여 부가 가치를 향상시킴으로써 지역경제의 활성화를 촉진할 수 있을 것이다. 따라서 본 연구에서는 이러한 신생혈관형성 억제작용을 가지는 4가지 천연산물인 전호 (Anthrisci radix), 파고지 (Psoraleae semen), 희첨(Siegesbeckiae herba) 및 산수유 (Corni fructus)의 추출물을 이용하여 이 물질들의 작용기전을 규명하여 항비만제제로서의 가능성을 밝히고자 한다.
본 연구에서는 신생혈관형성 제어에 바탕을 둔 비만세포 제어 정도를 확인하기 위하여 4가지 지역 천연산물인 전호 (Anthrisci radix), 파고지 (Psoraleae semen), 희첨 (Siegesbeckiae herba) 및 산수유 (Corni fructus)를 이용한 지방 축적물 변화 및 기전을 확인하기 위해 3T3-L1 adipocyte를 이용한 Oil Red O 염색 및 western blot을 실시하였다. 그 결과 전호, 파고지, 희첨, 산수유의 세포 독성 이내의 농도 증가에 따라 지방 축적물이 감소됨을 보였다.
제안 방법
Preadipocyte를 adipocyte로 분화 시에는 confluence된 3T3-L1 cells를 2일 더 배양한 후, DEEM/10% BBS 배지 및 분화유도 물질인 MAI (0.5 mb 3-isobuty-1-methyl-xanthine, 1 μM dexamethasone 및 10 μg/mL insulin)를 처리한 후, 이틀 후 DMEM/10% FBS 및 insulin 만을 함유한 배지로 교환하였다.
두 번째 그룹은 3T3-L1 preadipocyte에서 adipocyte로 완전히 분화시킨 후, 이틀 간격으로 chemical을 농도별로 총 3회 처리하였다.
먼저 6 well plate (SPL)에 3T3-L1 preadipocyte를 9.6 × 104 cell/well 이 되게 분주한 다음, confluence가 되면 adipocyte로의 분화유도를 위해 이틀 더 배양한 후, 분화유도물질인 MDI 및 시료를 처리하고, 이틀 후 DMEM/10% FBS 및 Insulin 그리고 시료를 함유한 배지로 교환하였다.
반응완료 후, 1 × TBST로 4회 세척한 다음 2차 항체를 실온에서 1시간 반응한 다음, 1 × TBST로 4회 세척 후, BCL reagent로 5분 반응 후 암실에서 film 현상하였다.
조건하에서 배양하였다. 세포가 가득 배양되면 이틀 더 배양한 후, 첫 번째 그룹은 분화유도물질인 MDI와 sample을 동시에 처리하고 이틀 뒤에 배지를 제거한 다음 DMEM/10% FBS, Insulin 및 시료를 함유하는 배지로 교환하였다. 다시 이틀 뒤에 DMEM/10% FBS와 시료만을 함유한 배지로 교환해 주었다.
시료 처리에 의한 지방세포의 분화정도를 알아보기 위해 Oil Red O 염색을 실시하였다. 먼저 6 well plate (SPL)에 3T3-L1 preadipocyte를 9.
6 × 104 cell/well 이 되게 분주한 다음, confluence가 되면 adipocyte로의 분화유도를 위해 이틀 더 배양한 후, 분화유도물질인 MDI 및 시료를 처리하고, 이틀 후 DMEM/10% FBS 및 Insulin 그리고 시료를 함유한 배지로 교환하였다. 이후에는 DMEM/10% FBS 배지로 1회 더 교환한 다음, 배지를 제거한 후 각 well 당 10% formalin 2.4 mL씩 투여 후 5분간 고정시켰다.
정량된 단백질을 이용하여 전기영동 및 membrane transfer를 실시하였으며, 3T3-L1 adipocyte 단백질의 특이적 발현 패턴을 확인하기 위해 adipogenesis와 관련이 있는 signal molecules인 C/EBPα, SREBP-1, PPARγ의 3가지 antibody를 5% NFDM, 실온조건에서 1시간 반응 후, 1% NFDM에 1：1000의 비율로 희석하여 4℃에서 overnight하였다.
천연산물 추출물의 adipogenesis 및 lipogenesis 제어정도를 protein level에서 확인하기 위해 western blot을 분화물질과 시료를 동시에 투여한 군과, 분화유도 후에 시료 투여군으로 나누어서 western blot를 실시하였다. 정량된 단백질을 이용하여 전기영동 및 membrane transfer를 실시하였으며, 3T3-L1 adipocyte 단백질의 특이적 발현 패턴을 확인하기 위해 adipogenesis와 관련이 있는 signal molecules인 C/EBPα, SREBP-1, PPARγ의 3가지 antibody를 5% NFDM, 실온조건에서 1시간 반응 후, 1% NFDM에 1：1000의 비율로 희석하여 4℃에서 overnight하였다.
대상 데이터
3T3-L1 cells (Mouse embryonic fibroblast-adipose like cell line)은 한국세포주은행에서 3~5세대의 세포를 분양받아 Oil Red O staining [22] 및 western blot을 위해 사용하였고, 세포의 성장을 위해 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Gibco)에 NaHCO3 (3.7 g/L), Penicillin G (63 mg/L), Streptomycin (100 mg/L)을 함유하고, preadipocyte 배양시에는 BS (Bovine Serum, Gibco)가 10% 되게 첨가하여 배양하였으며, 배지의 교환은 이틀 간격으로 하였고, confluence에 도달하였을 때 본 실험에 사용하였다.
4가지 지역 천연산물인 전호 (Anthrisci radix), 파고지 (Psoraleae semen), 희첨 (Siegesbechiae herba) 및 산수유 (Corni fructus)를 구매 후, 재료 600 g에 3000 mL의 70% ethyl alcohol로 5시간 동안 환류, 추출한 후 증발농축기에서 농축하여 동결건조 한 후 DMSO에 녹여 세포독성을 갖지 않는 범위 내에서 사용하였다.
성능/효과
3T3-L1 cells를 분화 유도 후, 천연산물 추출물을 처리한 군의 단백질 발현을 확인한 결과, Anthrisci radix 0.1, 0.5, 1 mg/L 처리 시 lipogenesis 및 adipogenesis의 매개분자인 SREBP-1, 그리고 PPARγ에서 농도 의존적으로 감소함을 보였다.
3T3-L1 cells를 분화 유도물질과 함께 Anthrisci radix 0.05, 0.1, 0.25 mg/L의 각각 다른 농도로 세포에 처리 시 adipogenesis을 매개하는 PPARγ의 단백질 레벨이 농도 의존적으로 감소함을 보였다.
7%, 33%의 비슷한 저해효과를 나타내었다. 4가지의 천연산물은 모두 유효량에서 30% 정도의 지방형성을 저해하는 것으로 나타났다 (Fig. 1). Lee [25]등은 isorhamnetin이 사람의 양막장간막줄기세포(human amniotic mesenchymal stem cell：hAMSC)세포에 adipocyte억제한다는 보고를 한바가 있는데 본 연구팀보다 장시간 (25일) 투여하여 Oil Red O staining을 하였는데 본 연구자와 비슷한 효과를 나타내고 있음을 보았다.
Oil Red O 염색을 통한 4가지 지역특산물의 Anti-obesity 효과를 측정한 결과 Anthrisci radix의 경우 0.1, 0.25, 0.3, 0.5 mg/L에서 7.5%, 14.4%, 18.3%, 30%의 저해율을 보였으며, Psoraleae semen의 경우 10, 25, 50, 100 mg/L에서 각각 2%, 4.9%, 9.3%, 38%의 저해율을 보였다. Siegesbeckiae herba 10, 25, 50, 100 mg/L 처리 시 1.
Psoraleae semen, Siegesbeckiae herba, Corni fructus를 각각 1, 5, 10 mg/L 처리한 후, PPARγ의 레벨을 확인한 결과 역시 농도 의존적으로 감소함을 보였다.
3%, 38%의 저해율을 보였다. Siegesbeckiae herba 10, 25, 50, 100 mg/L 처리 시 1.4%, 6.4%, 16.4%, 30.1%의 저해효과를 보였으며, 같은 농도의 Corni fructus 처리 시 0.9%, 6.3%, 13.7%, 33%의 비슷한 저해효과를 나타내었다. 4가지의 천연산물은 모두 유효량에서 30% 정도의 지방형성을 저해하는 것으로 나타났다 (Fig.
본 연구에서는 신생혈관형성 제어에 바탕을 둔 비만세포 제어 정도를 확인하기 위하여 4가지 지역 천연산물인 전호 (Anthrisci radix), 파고지 (Psoraleae semen), 희첨 (Siegesbeckiae herba) 및 산수유 (Corni fructus)를 이용한 지방 축적물 변화 및 기전을 확인하기 위해 3T3-L1 adipocyte를 이용한 Oil Red O 염색 및 western blot을 실시하였다. 그 결과 전호, 파고지, 희첨, 산수유의 세포 독성 이내의 농도 증가에 따라 지방 축적물이 감소됨을 보였다. 또한 western blot을 위해 lipogenesis와 관련된 SREBP-1 및 adipogenesis와 관련된 PPARγ와 C/EBPα의 신호전달 정도를 확인한 결과 4가지 지역 천연산물의 농도 증가에 따라 단백질의 발현양이 감소됨을 확인하였다.
Lee [25]등은 isorhamnetin이 사람의 양막장간막줄기세포(human amniotic mesenchymal stem cell：hAMSC)세포에 adipocyte억제한다는 보고를 한바가 있는데 본 연구팀보다 장시간 (25일) 투여하여 Oil Red O staining을 하였는데 본 연구자와 비슷한 효과를 나타내고 있음을 보았다. 그러나, 본 연구팀과는 사용한 세포가 달라 직접적인 비교는 어려움이 있었으나, 파고지의 38% 정도의 저해율은 상당히 높은 제어율로 사료된다.
이는 4가지 지역 천연산물 추출물이 지방분화와 관련된 신호분자를 차단함으로써 지방형성이 억제되었음을 보였다. 따라서 4가지 지역 천연산물인 전호, 파고지, 희첨 및 산수유는 신생혈관형성 억제에 따른 항비만제제로서의 이용 가능함을 시사하였다.
또한 western blot을 위해 lipogenesis와 관련된 SREBP-1 및 adipogenesis와 관련된 PPARγ와 C/EBPα의 신호전달 정도를 확인한 결과 4가지 지역 천연산물의 농도 증가에 따라 단백질의 발현양이 감소됨을 확인하였다.
후속연구
특히, 지역의 다양한 특산물을 신생혈관형성 억제작용에 이용한다면, 부작용이 적고, 원료구입의 용이함과 1차 산업 생산물을 가공하여 부가 가치를 향상시킴으로써 지역경제의 활성화를 촉진할 수 있을 것이다. 따라서 본 연구에서는 이러한 신생혈관형성 억제작용을 가지는 4가지 천연산물인 전호 (Anthrisci radix), 파고지 (Psoraleae semen), 희첨(Siegesbeckiae herba) 및 산수유 (Corni fructus)의 추출물을 이용하여 이 물질들의 작용기전을 규명하여 항비만제제로서의 가능성을 밝히고자 한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
혈관의 성장 메커니즘에서 가장 뛰어난 역할을 하는 그룹은 어디인가?
신생혈관형성 (Angiogenesis)에 의한 새로운 혈관형성은 기존의 혈관으로부터 내피세포의 전이 및 발아가 외막의 기질의 붕괴와 함께 결합함으로써 새로운 혈관이 생성되는 기작을 의미하며 [1,2], 분열된 내피세포들이 결합조직 내로 이동을 하게 되고, 이때 내피세포 주변의 결합조직 세포 또는 민무늬근육 세포로부터 분비된 신생혈관 형성인자 또는 세포 외막의 기질이 내피세포의 이동을 유도하게 된다 [3]. 혈관의 성장 메커니즘에는 다양한 분자들이 수반되며, 이러한 분자들 중에 VEGF 그룹과 Ang (angiopoietin) 그룹은 가장 뛰어난 역할을 가지고 있다. VEGF의 신생혈관 형성력은 유전자 사용량에 따라 엄격히 조절되며, 많은 신생혈관 저해인자를 포함한 몇몇의 분자들은 주로 암의 신생혈관형성에 밀접하게 관련되어 있다 [4,5].
신생혈관형성에 의한 새로운 혈관형성은 무엇을 의미하는가?
신생혈관형성 (Angiogenesis)에 의한 새로운 혈관형성은 기존의 혈관으로부터 내피세포의 전이 및 발아가 외막의 기질의 붕괴와 함께 결합함으로써 새로운 혈관이 생성되는 기작을 의미하며 [1,2], 분열된 내피세포들이 결합조직 내로 이동을 하게 되고, 이때 내피세포 주변의 결합조직 세포 또는 민무늬근육 세포로부터 분비된 신생혈관 형성인자 또는 세포 외막의 기질이 내피세포의 이동을 유도하게 된다 [3]. 혈관의 성장 메커니즘에는 다양한 분자들이 수반되며, 이러한 분자들 중에 VEGF 그룹과 Ang (angiopoietin) 그룹은 가장 뛰어난 역할을 가지고 있다.
VEGF 그룹의 신생혈관 형성력은 무엇에 의해 조절되는가?
혈관의 성장 메커니즘에는 다양한 분자들이 수반되며, 이러한 분자들 중에 VEGF 그룹과 Ang (angiopoietin) 그룹은 가장 뛰어난 역할을 가지고 있다. VEGF의 신생혈관 형성력은 유전자 사용량에 따라 엄격히 조절되며, 많은 신생혈관 저해인자를 포함한 몇몇의 분자들은 주로 암의 신생혈관형성에 밀접하게 관련되어 있다 [4,5]. 지난 10여 년간의 연구는 지방조직 및 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, Ang-1, Ang-2, PAI-1, TGFβ, leptin 및 maspin 등을 포함한 in vitro에서 배양된 지방세포 등에 의해서 pro-/antiangiogenic 성장인자들이 발현됨을 밝혔다.
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