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문제 정의
- 본 연구는 TNT 분해능이 우수한 세균인 S. maltophilia OK-5를 이용하여 TNT 함유 폐수인 pink water의 미생물학적 처리 가능성에 대한 연구를 하였다. Pink water에 함유된 TNT 제거를 위해 S.
- 본 연구에서는 이 S. maltophilia OK-5를 이용하여 교반탱크 반응조 내에서 TNT 제조 공정에서 발생하는 pink water의 생물학적 처리가능성을 조사하였으며, 처리과정에서 생성되는 TNT 분해대사산물들을 HPLC와 GC-MS 등에 의한 분석을 통하여 확인하였다. 또한 S.
제안 방법
- 0으로 적정한 후, 동량의 ethyl acetate와 배양액을 분획깔대기에 넣고 세게 흔든 후 층을 분리시켰으며, 용매 분획은 3회 반복추출하였다. Ethyl acetate 층을 취해서 감압 증발기 (vacuum rotary evaporator, EYELA, Co., Japan)로 감압 증발시킨 후, ethyl acetate 층을 증발시켜 얻은 시료를 GC-MS로 분석하였다.
- 1). Pink water 내의 TNT 제거는 배양기간 동안 매 24시간 마다 시료를 채취하여 HPLC로 측정하였다 (Fig. 2). S.
- TNT 생분해 경로의 중요한 요소로 작용하는 nitroreductase (pnrB) 유전자의 발현량 검사를 위해 real-time PCR법으로 상대적 정량분석을 시행하였다 [26,27]. Pink water가 첨가된 교반 반응 탱크조에서 배양된 S. maltophilia OK-5로부터 RNA 추출 kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였으며, reverse transcriptase 반응은 RT-PCR kit (Bio-Rad. Co., USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. Real-time PCR은 SYBR Green의 활성을 CFX96 (Bio-Rad Co.
- Pink water에 S. maltophilia OK-5를 접종하고 배양기간 경과에 따른 배양액의 색깔 변화를 알아보기 위하여 분광광도계의 파장 475 nm에서 흡광도를 측정하였다 (Fig. 3). 교반탱크 반응조에서 배양 기간 동안 매 24시간 마다 배양액을 채취하여 분광광도계로 흡광도를 확인한 결과, 배양 3일째부터 배지의 색깔 변화가 급격히 변하기 시작하였으며 배양 4일 이후부터 색깔 변화는 완만하게 진행되는 것이 관찰되었다.
- maltophilia OK-5를 이용하여 TNT 함유 폐수인 pink water의 미생물학적 처리 가능성에 대한 연구를 하였다. Pink water에 함유된 TNT 제거를 위해 S. maltophilia OK-5를 교반탱크 반응조에서 배양한 결과 pink water 내에 존재하는 100 mg/L의 TNT를 배양 6일 만에 완전 분해하였다. Hydride-Meisenheimer complex에서 유래하는 진한 적갈색은 배양기간 내에 증가하였으며, 이를 정량적으로 확인하였다.
- Pink water에 함유된 화합물을 알아보기 위하여 GC chromatogram 상에서 나타난 주요 peak들에 대하여 massspectrometry (MS) 분석을 실시하였다. 이들 peak 가운데 표준 TNT와 동일한 retention time을 가지고 있는 peak를 제외한 나머지 주요 peak들에 대해 MS 분석결과는 2,4-dinitrotoluene (2,4-DNT), 2,6-dinitrotoluene (2,6-DNT), 2,4-dinitro-6-hydroxytoluene으로 각각 확인되었다 (Fig.
- Pink water의 성분 분석을 위해 GC-MS를 이용하여 분석하였다. GC-MS 분석에 사용한 기기는 Hewlett-Packard 5970 mass selective detector가 부착된 Hewlett-Packard 5890 series II gas chromatograph를 사용하였고, 컬럼은 HP-5MS capillary column (25 m × 0.
- Pink water의 함유화합물 및 TNT의 분해과정에서 생성되는 중간대사물질들을 확인하기 위해 pink water와 S. maltophilia OK-5의 배양시료에 대하여 gas chromatography를 사용하여 분석하였다 (Fig. 4). Pink water에 접종된 S.
- 각 반응에 사용한 pnrB primer는 forward 5′-CGAGATGACTGAAGAACACCTGAAC-3′와 reverse 5′-GTAGTGACGGCGGCTCTGG-3′를, 그리고 16S rRNA primer는 forward 5′-AAGGAACACCAGTGGCGAAGG-3′와 reverse 5′-CCAGGCGGTCAACTTAATGCG-3′를 사용하였다. Real-time PCR 반응은 iScriptTM One-Step RT-PCR Kit (Bio-Rad Co., USA)를 이용하였으며, PCR 반응 조건은 95℃에서 30초간 1회 denaturation 시킨 후 95℃에서 5초간 denaturation, 60℃에서 5초간 annealing, 72℃에서 5초간 extension 조건으로 50회 반복하였다. PCR 산물 결과는 Bio-Rad CFX 분석프로그램을 이용하여 분석하였다.
- , USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. Real-time PCR은 SYBR Green의 활성을 CFX96 (Bio-Rad Co., USA)를 이용하여 실시간 확인하였다. 각 반응에 사용한 pnrB primer는 forward 5′-CGAGATGACTGAAGAACACCTGAAC-3′와 reverse 5′-GTAGTGACGGCGGCTCTGG-3′를, 그리고 16S rRNA primer는 forward 5′-AAGGAACACCAGTGGCGAAGG-3′와 reverse 5′-CCAGGCGGTCAACTTAATGCG-3′를 사용하였다.
- TNT 분해세균인 S. maltophilia OK-5를 TNT 함유폐수인 pink water에 적용하기 위하여 2.5 L의 총 용량 가운데 운전 용량이 1.5 L인 교반탱크 반응조 내에서 TNT의 미생물학적 제거실험을 실시하였다. 사용한 배지는 1 L pink water에 S.
- TNT 함유 폐수에서 미생물학적으로 제거된 TNT를 측정하기 위하여 UV/Vis detector (Shimadzu SPD-10A, Japan)가 부착된 LC-10AT HPLC 시스템 (Shimadzu. Co., Japan)을 사용하였다. 사용한 컬럼은 Agilent 사의 Zorbax ODS reverse-phase column (250 mm × 4.
- maltophilia OK-5를 이용하여 교반탱크 반응조 내에서 TNT 제조 공정에서 발생하는 pink water의 생물학적 처리가능성을 조사하였으며, 처리과정에서 생성되는 TNT 분해대사산물들을 HPLC와 GC-MS 등에 의한 분석을 통하여 확인하였다. 또한 S. maltophilia OK-5가 pink water를 생물학적으로 분해하는 동안 TNT 대사에 관여하는 nitroreductase (pnrB) 유전자의 발현량을 RT-PCR로 측정하였다.
- 45 μm의 syringe filter로 여과하여 HPLC 분석에 이용하였다. 또한 pink water에 함유된 TNT의 정량은 HPLC 분석을 통해 측정하였다.
- 본 연구에서 pink water에 잔류하는 TNT 뿐만 아니라 2,4-dinitrotoluene, 2,6-dinitrotoluene, 2,4-dinitro-6-hydroxytoluene 등의 대사산물도 HPLC 분석방법으로 측정하였으며, GC-MS를 사용하여 확인하였다. 또한 pink water에서 배양된 S. maltophilia OK-5에서 발현되는 nitroreductase (pnrB)의 유전자 발현 정량을 real time PCR로 측정하였다. 그 결과 배양 5일째 pnrB copy 수가 103 이상 증가하는 것을 확인하였다.
- 2 L/min으로 주입하였다. 배양기간 동안 매 24시간 마다 시료를 채취하여 분해 세균의 생장과 잔존 TNT의 양을 관찰하였다. 분해 세균의 생장은 배양액을 적당한 비율로 멸균된 0.
- 본 연구실에서는 TNT 분해능이 우수한 Stenotrophomonas maltophilia OK-5를 분리하여 다양한 생리화학적 및 분자유전학적 특성 연구를 통하여 이 균주의 산업적 이용가능성을 조사하였으며, 특히 게놈 셔플링 및 단백질체학 분석을 통해 TNT 대사작용에 관여하는 중요 유전자들에 대한 탐색을 실시하였다 [21-25].
- Hydride-Meisenheimer complex에서 유래하는 진한 적갈색은 배양기간 내에 증가하였으며, 이를 정량적으로 확인하였다. 본 연구에서 pink water에 잔류하는 TNT 뿐만 아니라 2,4-dinitrotoluene, 2,6-dinitrotoluene, 2,4-dinitro-6-hydroxytoluene 등의 대사산물도 HPLC 분석방법으로 측정하였으며, GC-MS를 사용하여 확인하였다. 또한 pink water에서 배양된 S.
- 배양기간 동안 매 24시간 마다 시료를 채취하여 분해 세균의 생장과 잔존 TNT의 양을 관찰하였다. 분해 세균의 생장은 배양액을 적당한 비율로 멸균된 0.8% 생리식염수에 희석하여 LB 고체 평판배지에 평판 도말하여 30℃에서 배양한 후 형성된 집락을 계수하여 측정하였다.
- 2로 조절하였으며, 배양온도는 30℃에서 150 rpm으로 진탕혼합 배양기에서 전배양 (pre-culture)을 하였으며, 이를 교반탱크 반응조 내에 접종하였다. 분해 세균인 S. maltophilia OK-5의 생장은 분광광도계 (V-550 UV/Vis spectrophotometer, Jasco Co., Japan)를 이용하여 파장 660 nm에서 흡광도 측정을 통하여 관찰하였다.
-
교반탱크 반응조에서 pink water에 함유된 TNT 생분해
분해능이 우수한 S. maltophilia OK-5 균주를 이용하여 교반탱크 반응조 내에서 TNT 생산공정에서 얻어지는 pink water에 함유된 TNT의 분해실험을 실시하였다 (Fig. 1). Pink water 내의 TNT 제거는 배양기간 동안 매 24시간 마다 시료를 채취하여 HPLC로 측정하였다 (Fig.
- 폐수가 함유된 배양액으로부터 채취한 시료는 3,500 × g에서 10분간 원심분리한 후 0.45 μm의 syringe filter로 여과하여 HPLC 분석에 이용하였다.
대상 데이터
- GC-MS 분석에 사용한 기기는 Hewlett-Packard 5970 mass selective detector가 부착된 Hewlett-Packard 5890 series II gas chromatograph를 사용하였고, 컬럼은 HP-5MS capillary column (25 m × 0.20 mm × 0.33 μm)을 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 TNT 분해세균은 폭약에 오염된 지역의 토양으로부터 농화배양 기법으로 분리된 S. maltophilia OK-5를 사용하였다. 분리균주의 배지조성과 배양조건은 Lee 등 [17]에 의해 발표된 방법에 따랐다.
- 5 L인 교반탱크 반응조 내에서 TNT의 미생물학적 제거실험을 실시하였다. 사용한 배지는 1 L pink water에 S. maltophilia OK-5의 전배양에 사용한 생장배지를 첨가하여 사용하였다. Pink water를 포함한 배양액은 pH 7.
- 사용한 컬럼은 Agilent 사의 Zorbax ODS reverse-phase column (250 mm × 4.6 mm, 입자 크기 5 μm)을 사용하였다.
데이터처리
- , USA)를 이용하였으며, PCR 반응 조건은 95℃에서 30초간 1회 denaturation 시킨 후 95℃에서 5초간 denaturation, 60℃에서 5초간 annealing, 72℃에서 5초간 extension 조건으로 50회 반복하였다. PCR 산물 결과는 Bio-Rad CFX 분석프로그램을 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- TNT 생분해 경로의 중요한 요소로 작용하는 nitroreductase (pnrB) 유전자의 발현량 검사를 위해 real-time PCR법으로 상대적 정량분석을 시행하였다 [26,27]. Pink water가 첨가된 교반 반응 탱크조에서 배양된 S.
- maltophilia OK-5를 사용하였다. 분리균주의 배지조성과 배양조건은 Lee 등 [17]에 의해 발표된 방법에 따랐다. 생장배지는 1 N NaOH를 이용하여 pH 7.
성능/효과
- Pink water에 함유된 TNT의 대사 작용 과정에서 발현되는 S. maltophilia OK-5의 nitroreductase (pnrB) 유전자 발현 정량을 real-time PCR로 분석한 결과 pink water 배양 배지 내에서 TNT의 제거율에 비례하여 pnrB 유전자의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다 (Fig. 6). 배양 초기에 비해 배양 5일째 pnrB 유전자 copy수는 102에서 105 이상으로 급격히 증가하였으며, pnrB 유전자발현 증가에 따라 TNT의 생분해율도 비례하여 분해되는 것을 확인하였다.
- 3). 교반탱크 반응조에서 배양 기간 동안 매 24시간 마다 배양액을 채취하여 분광광도계로 흡광도를 확인한 결과, 배양 3일째부터 배지의 색깔 변화가 급격히 변하기 시작하였으며 배양 4일 이후부터 색깔 변화는 완만하게 진행되는 것이 관찰되었다. Vorbeck 등 [28]은 TNT 분해과정 중 붉은 갈색의 대사물질인 Hydride-Meisenheimer complex가 일시적으로 생성된다고 보고하였다.
- maltophilia OK-5에서 발현되는 nitroreductase (pnrB)의 유전자 발현 정량을 real time PCR로 측정하였다. 그 결과 배양 5일째 pnrB copy 수가 103 이상 증가하는 것을 확인하였다.
- 또한 French 등 [15]은 TNT 중간대사물질 중 아질산염 (nitrite) 및 dinitrotoluene의 생성은 TNT가 먼저 Hydride-Meisenheimer complex로 전환된 이후 여러 다른 분해 경로를 통해 TNT가 분해된다고 보고하였다. 따라서 이러한 보고들을 통해서 TNT가 함유된 배지에서 TNT의 잔존량이 줄어들면서 S. maltophilia OK-5의 배양 배지의 색이 점점 붉은 갈색으로 변화되는 현상은 S. maltophilia OK-5가 TNT 생분해 경로에서 탈질소화 반응을 거친 후 분해되는 것으로 판단된다.
- 6). 배양 초기에 비해 배양 5일째 pnrB 유전자 copy수는 102에서 105 이상으로 급격히 증가하였으며, pnrB 유전자발현 증가에 따라 TNT의 생분해율도 비례하여 분해되는 것을 확인하였다. Beller 등 [26]은 hydrocarbon 분해세균에서 대사작용에 관여하는 α-subunit of benzylsuccinate synthase (bssA)의 발현량을 배양 기간동안 real-time PCR 기법으로 측정한 결과 기질 분해율에 비례하여 bssA 유전자도 증가한다고 보고하였다.
- maltophilia OK-5의 생장이 현저히 증가하기 시작하였으며, 접종균주의 생장과 더불어 TNT 제거도 동시에 진행되어, 이 기간 동안 pink water 내에 함유된 TNT의 양은 약 65% 이상이 분해되었다. 배양이 5일째 접어들면서 약 90% 정도가 분해되었으며, 궁극적으로 6일만에 교반탱크 반응조 내의 TNT는 완전히 분해되는 것을 HPLC를 통해 확인하였다 (Fig. 2). 이전에 보고된 연구결과에서 S.
- 이러한 보고에서처럼 환경오염의 주요 원인물질들을 에너지원 및 탄소원으로 이용하는 균주에서 기질대사 작용에 관여하는 유전자들의 발현량은 균주의 생장율과 상호 비례적으로 증가한다. 본 연구 결과에서도 TNT 대사에 작용하는 nitroreductase (pnrB) 유전자의 발현량은 단일 질소원으로 TNT가 함유된 배지에서 S. maltophilia OK-5의 생장율과 상호 비례적으로 증가하여 pink water에 포함된 TNT 제거에 영향을 미치는 것을 확인하였다.
- 2로 조절하였으며, 산업폐수를 직접 적용하는 바, 효율성을 고려하여 별도로 멸균은 하지 않았다. 분해세균인 S. maltophilia OK-5의 접종은 전체 용량의 10%를 접종하고 교반탱크 반응조의 운전은 호기적 조건하에서 진행되었다. 배양온도는 30℃를 유지하였고, 임펠러 (impeller)는 분당 300회 회전하며, 공기는 1.
- Pink water에 함유된 화합물을 알아보기 위하여 GC chromatogram 상에서 나타난 주요 peak들에 대하여 massspectrometry (MS) 분석을 실시하였다. 이들 peak 가운데 표준 TNT와 동일한 retention time을 가지고 있는 peak를 제외한 나머지 주요 peak들에 대해 MS 분석결과는 2,4-dinitrotoluene (2,4-DNT), 2,6-dinitrotoluene (2,6-DNT), 2,4-dinitro-6-hydroxytoluene으로 각각 확인되었다 (Fig. 5). Chang 등 [14]에 의하면 S.
- maltophilia OK-5는 TNT의 중간대사물질인 2,4-DNT와 2,6-DNT를 호기적 조건하에서 이 두가지 화합물을 모두 완전 분해한다고 보고한 바 있으며, Bhadra 등 [18]은 수서 식물인 Myriophyllum aquaticum에 의한 TNT의 주요 대사산물로서 2,4-dinitro-6-hydroxytoluene이 생성된다고 보고하였다. 이러한 보고에 근거하여, 본 연구에서 사용된 pink water에는 TNT 뿐만 아니라 2,4-DNT, 2,6-DNT, 2,4-dinitro-6-hydroxytoluene 등도 포함되어 있으며 이들 화합물은 분리세균인 S. maltophilia OK-5에 의해 모두 제거됨을 HPLC와 GC-MS 분석을 통해서 확인하였다.
- maltophilia OK-5는 TNT 농도가 100 mg/L가 되도록 희석된 pink water 내에 포함된 TNT를 반응조에서 6일 동안의 배양 기간 내에 완전히 제거하였다. 초기 배양 3일 동안 S. maltophilia OK-5의 생장과 TNT 제거의 변화는 뚜렷이 나타나지 않았으나, 배양 4일째부터 S. maltophilia OK-5의 생장이 현저히 증가하기 시작하였으며, 접종균주의 생장과 더불어 TNT 제거도 동시에 진행되어, 이 기간 동안 pink water 내에 함유된 TNT의 양은 약 65% 이상이 분해되었다. 배양이 5일째 접어들면서 약 90% 정도가 분해되었으며, 궁극적으로 6일만에 교반탱크 반응조 내의 TNT는 완전히 분해되는 것을 HPLC를 통해 확인하였다 (Fig.
후속연구
- 본 연구에서 얻어진 S. maltophilia OK-5의 pink water의 미생물학적 처리 결과를 토대로 하여, 향후 TNT 함유 폐수인 pink water에 대한 산업적 적용과 그 효율성을 규명하고, TNT 대사에 관여하는 유전자의 탐색 방향으로 진행될 것이다.
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