[논문]임피던스 측정을 이용한 세포의 변형성 분석용 미소유체 칩

김동일; 최은표; 최성식; 박정열; 이상호; 윤광석

doi:10.5369/jsst.2009.18.1.042

[국내논문] 임피던스 측정을 이용한 세포의 변형성 분석용 미소유체 칩
Microfluidic chip for characterization of mechanical property of cell by using impedance measurement 원문보기

센서학회지 = Journal of the Korean Sensors Society, v.18 no.1, 2009년, pp.42 - 47

김동일 (서강대학교 전자공학과) , 최은표 (서강대학교 기계공학과) , 최성식 (고려대학교 생명과학부) , 박정열 (서강대학교 기계공학과) , 이상호 (고려대학교 생명과학부) , 윤광석 (서강대학교 전자공학과)

Abstract ▼ AI-Helper

In this paper we propose a microfluidic chip that measures the mechanical stiffness of cell membrane using impedance measurement. The microfluidic chip is composed of PDMS channel and a glass substrate with electrode. The proposed device uses patch-clamp technique to capture and deform a target cell and measures impedance of deformed cells. We demonstrated that the impedance increased after the membrane stretched and blocked the channel.

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AI 본문요약
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문제 정의

본 논문은 패치 클램프의 세포 흡입 제어 기술을 기반으로 하되 세포의 전기적 특성을 이용한 새로운 측정 방법을 제안하여 세포의 기계적 특성의 변화를 측정할 수 있는 미소유체 칩을 제안한다. 현재까지 세포의 물리적, 구조적 특성의 변화를 측정하기 위해서 마이크로 피펫(micropipette)^[12], 광학 핀셋(optical tweezer)^[13,14]등이 제안되었다.
또한 많은 세포를 동시에 실험하지 못하고 늘어난 세포의 길이를 정량적으로 측정할 수 없다. 본 논문에서는 미소유체 칩 상에서 세포의 변형성을 전기적 측정 방법을 이용하여 임피던스로 확인할 수 있는 방법을 제안한다.
본 논문에서는 패치 클램프 동작 구조를 기반으로 하고, 전기적 측정을 이용하여 세포의 탄성을 분석하기 위한 미소유체 칩을 제작하여 유방상피세포의 흡입된 길이와 해당하는 측정 임피던스 값을 통하여 흡입된 세포의 길이에 비례하여 임피던스 값이 증가함을 확인하였으며, 이를 이용하여 여러 종류의 세포의 변형성을 분석할 수 있을 것이다. 현재까지 세포의 변형성을 측정하기 위해 정량적인 분석이 어려운 마이크로 피펫, 광학 핀셋 등을 이용하였지만, 제안하는 전기적 측정을 이용하면 세포의 종류에 따른 정확한 비교 분석이 가능할 것으로 기대한다.

제안 방법

이 때, 더 강한 흡입 압력을 가하면 세포막이 터지면서 이온 채널이 외부와 통할 수 있는 상태가 된다. 그리고 세포의 바깥쪽에서 이온 채널을 통한 반대쪽으로 전압을 가해주면, 이온 채널에서의 전류 변화 상태를 측정함으로써 세포의 유전체적 특성 즉, 전기적 특성을 분석한다.
이와 같이 본 디바이스의 세포를 포획하는 동작은 패치 클램프와 비슷하다. 다만, 패치 클램프는 세포가 패치채널에 흡입되었을 때, 입구 포트와 세포를 흡입하는 포트 사이의 저항(sealing resistance)을 측정하는 반면, 제안하는 칩에서는 세포가 흡입되는 정도에 따른 임피던스의 변화를 측정한다. 이를 위하여 세포가 흡입되는 채널 양쪽에 전극이 놓이도록 설계하였다.
다만, 패치 클램프는 세포가 패치채널에 흡입되었을 때, 입구 포트와 세포를 흡입하는 포트 사이의 저항(sealing resistance)을 측정하는 반면, 제안하는 칩에서는 세포가 흡입되는 정도에 따른 임피던스의 변화를 측정한다. 이를 위하여 세포가 흡입되는 채널 양쪽에 전극이 놓이도록 설계하였다. 이 때, 세포가 흡입됨에 따라 전극 사이의 전기적 저항이 증가하게 되며 따라서 임피던스의 증가가 예상된다.
2는 제안하는 미소유체 칩을 제작하는 공정 과정이다. 본 연구에서는 세포의 이동을 관찰할 수 있도록 투명한 재질의 유리 기판과 polydimethylsiloxane(PDMS)를 이용하였다^[16]; (a) 먼저 하부 기판을 위해, 유리 기판에 크롬/금 (Cr/Au)을 증착하고, 원하는 전극 모양으로 패터닝 하였다. (b) 상부 PDMS 구조체를 형성하기 위해 실리콘 기판을 준비한다.
(b) 상부 PDMS 구조체를 형성하기 위해 실리콘 기판을 준비한다. 그리고 흡입 채널을 위한 마스터 구조를 형성하기 위해 실리콘 기판을 RIE로 식각하였다. (c) 다음으로 SU-8(SU-8 2025,MicroChem Co.
그리고 흡입 채널을 위한 마스터 구조를 형성하기 위해 실리콘 기판을 RIE로 식각하였다. (c) 다음으로 SU-8(SU-8 2025,MicroChem Co.)을 이용하여 세포들이 이동할 수 있는 두꺼운 채널을 위한 마스터 구조를 제작하였다. (d) 제작된 실리콘 기판 위에 PDMS 액상 폴리머를 부운 다음 진공 챔버를 이용하여 PDMS에 존재하는 기포를 제거하고, 핫플레이트 위에서 (80℃) 60분 동안 경화하였다.
(d) 제작된 실리콘 기판 위에 PDMS 액상 폴리머를 부운 다음 진공 챔버를 이용하여 PDMS에 존재하는 기포를 제거하고, 핫플레이트 위에서 (80℃) 60분 동안 경화하였다. 그리고 실리콘 기판에서 PDMS를 떼어낸 후, 튜브를 꽂을 수 있는 입구 및 출구, 흡입 압력을 위한 포트 등을 형성하였다. (e) 마지막으로 전극이 제작된 유리 기판과 채널이 형성된 PDMS를 산소 플라즈마 처리 후 접합하여 미소유체 칩을 완성하였다^[17].
제작된 칩은 세포와 용액이 들어가고 나가게 되는 입구와 출구 그리고 흡입압력을 제어할 수 있는 흡입 제어 포트가 형성되어 있다. 또한, 세포가 원하는 패치 채널로 이동이 쉽도록 조작 가능한 채널(manipulation channel) 2개를 패치 채널을 향하도록 설계하였다. 그리고 칩의 확대된 사진을 보면, 임피던스 측정을 위한 전극이 측정 채널(measurement channel) 안과 흡입 채널 양쪽에 위치하는 것을 확인할 수 있다.
임피던스는 AD 5934(analog devices)를 이용하여 측정하였다. 세포를 이용한 실험을 진행하기 전에 제작된 칩의 입출구에 연결된 튜브를 이용하여 메탄올과 증류수 순서로 세척하였다. 또한, 세포를 주입하기 전에 모든 채널을 phosphate buffered saline(PBS) 용액으로 채웠다.
세포를 흡입 채널에 위치하기 위하여 세포가 포함된 배양액을 입구를 통하여 주입하였으며, 하나의 세포가 잡히도록 흡입 채널에 흡입 압력을 인가하였다. 흡입 압력은 주사기를 이용하여 제어하였기 때문에 정확한 압력을 인가하는 것은 불가능하였으나, 약 20~ 30 kPa의 압력이 인가되도록 조절하였다.
4는 패치 채널에 하나의 세포가 흡입된 사진이다. 흡입된 세포의 길이를 정확히 구분하기 위하여 세포 핵 염색을 하고 파란색 필터의 형광 현미경으로 확인하였다. Fig.
5는 각각의 세포에 대한 흡입 전후의 임피던스 값을 측정한 결과이다. 세포를 포획한 뒤, 각각의 실험에 대해 총 5회씩 반복하여 임피던스를 측정하였다. 흡입 전의 임피던스 값은 745 Hz에서 약 1.

대상 데이터

1은 제안하는 미소유체 칩의 구조를 보여준다. 세포 및 용액이 이동할 수 있는 주 채널과 흡입 압력을 가하여 빨아들일 수 있는 흡입 채널로 구성된다. 흡입 채널은 세포가 채널을 통과하여 빠져 나갈 수 없도록 너비 4 µm, 두께 2 µm로 설계되었다.
2는 제안하는 미소유체 칩을 제작하는 공정 과정이다. 본 연구에서는 세포의 이동을 관찰할 수 있도록 투명한 재질의 유리 기판과 polydimethylsiloxane(PDMS)를 이용하였다^[16]; (a) 먼저 하부 기판을 위해, 유리 기판에 크롬/금 (Cr/Au)을 증착하고, 원하는 전극 모양으로 패터닝 하였다. (b) 상부 PDMS 구조체를 형성하기 위해 실리콘 기판을 준비한다.
세포 및 용액을 주입할 수 있는 튜브와 세포의 흡입 압력 및 용액주입 압력을 제어하기 위해 주사기 펌프를 사용하였다. 임피던스는 AD 5934(analog devices)를 이용하여 측정하였다. 세포를 이용한 실험을 진행하기 전에 제작된 칩의 입출구에 연결된 튜브를 이용하여 메탄올과 증류수 순서로 세척하였다.
흡입 압력은 주사기를 이용하여 제어하였기 때문에 정확한 압력을 인가하는 것은 불가능하였으나, 약 20~ 30 kPa의 압력이 인가되도록 조절하였다. 실험에 사용한 세포는 유방상피세포였으며, Fig. 4는 패치 채널에 하나의 세포가 흡입된 사진이다. 흡입된 세포의 길이를 정확히 구분하기 위하여 세포 핵 염색을 하고 파란색 필터의 형광 현미경으로 확인하였다.

성능/효과

또한, 세포가 원하는 패치 채널로 이동이 쉽도록 조작 가능한 채널(manipulation channel) 2개를 패치 채널을 향하도록 설계하였다. 그리고 칩의 확대된 사진을 보면, 임피던스 측정을 위한 전극이 측정 채널(measurement channel) 안과 흡입 채널 양쪽에 위치하는 것을 확인할 수 있다.
세포막이 11 µm 늘어 났을 때, 최대 17% 정도 오차가 측정되었으며, 늘어난 길이가 30 µm 일 때 최대 19 % 정도의 오차가 확인되었다.
Guck 등의 논문을 보면^[18], 세포의 기계적 특성변화를 광학 핀셋을 이용하여 측정하고 있으나, 그 경우 변형 정도가 크지 않으며 육안으로 측정하게 된다는 문제가 있다. 그러나 본 연구에서 제안한 미소유체 칩의 경우, 세포막의 기계적 변화에 의한 막의 유연성을 전기적으로 측정할 수 있다는 장점이 있다.

후속연구

제안된 칩에서 인가압력과 세포막이 늘어난 길이 사이의 관계는 위의 식보다 좀 더 복잡할 것으로 예상되는데, 이는 현재 제작된 칩은 세포 막의 일부분만 늘리는 방식이며, 또한 채널의 단면이 직사각형이므로 이에 따른 압력손실 등이 발생하기 때문이다. 향후 정확한 실험적 해석을 위해서는 다양한 흡입압력에 대한 측정이 필요하다.
앞으로 보완해야 할 점은 측정 임피던스 오차를 줄이는 것이다. 세포막이 11 µm 늘어 났을 때, 최대 17% 정도 오차가 측정되었으며, 늘어난 길이가 30 µm 일 때 최대 19 % 정도의 오차가 확인되었다.
세포막이 11 µm 늘어 났을 때, 최대 17% 정도 오차가 측정되었으며, 늘어난 길이가 30 µm 일 때 최대 19 % 정도의 오차가 확인되었다. 이는 전극 사이가 세포막에 의해 막혀서 주변 커플링 노이즈 성분으로 큰 오차가 생긴 것으로 보이며, 보다 정확한 오차의 원인 파악 및 이의 개선을 위해서는 정밀한 임피던스 분석기를 이용한 추가적인 실험이 필요하다.
본 논문에서는 패치 클램프 동작 구조를 기반으로 하고, 전기적 측정을 이용하여 세포의 탄성을 분석하기 위한 미소유체 칩을 제작하여 유방상피세포의 흡입된 길이와 해당하는 측정 임피던스 값을 통하여 흡입된 세포의 길이에 비례하여 임피던스 값이 증가함을 확인하였으며, 이를 이용하여 여러 종류의 세포의 변형성을 분석할 수 있을 것이다. 현재까지 세포의 변형성을 측정하기 위해 정량적인 분석이 어려운 마이크로 피펫, 광학 핀셋 등을 이용하였지만, 제안하는 전기적 측정을 이용하면 세포의 종류에 따른 정확한 비교 분석이 가능할 것으로 기대한다. 또한 전기적 측정을 이용한 미소유체 칩을 도입함으로써 한번에 여러 개의 세포를 분석할 수 있는 고속 분석시스템으로 발전 할 수 있을 것이며, 패치 클램프 측정과 결합함으로써 세포의 전기적 특성과 기계적 특성을 동시에 분석하는 시스템에 응용될 수 있을 것으로 기대한다.
현재까지 세포의 변형성을 측정하기 위해 정량적인 분석이 어려운 마이크로 피펫, 광학 핀셋 등을 이용하였지만, 제안하는 전기적 측정을 이용하면 세포의 종류에 따른 정확한 비교 분석이 가능할 것으로 기대한다. 또한 전기적 측정을 이용한 미소유체 칩을 도입함으로써 한번에 여러 개의 세포를 분석할 수 있는 고속 분석시스템으로 발전 할 수 있을 것이며, 패치 클램프 측정과 결합함으로써 세포의 전기적 특성과 기계적 특성을 동시에 분석하는 시스템에 응용될 수 있을 것으로 기대한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	패치 클램프란?	또한 전기가 생체에 미치는 작용과 생체에 의해 발생되는 전기현상을 연구하는 전기생리학적인 방법 중의 하나인 패치 클램프와 같은 기술이 1970년대부터 발달해 왔다[6,7]. 패치 클램프는 세포 안의 이온 채널 사이의 전류 흐름을 관찰할 수 있는 기술이다. 기존의 패치 클램프는 유리 피펫을 이용하여 수조작으로 세포를 잡아야 하는 등 실험에 어려움이 많았다.
	기존의 패치 클램프는 유리 피펫을 이용하여 수조작으로 세포를 잡아야 하는 등 실험에 어려움이 많이 있었는데 이를 보완하기위해 개발된 방법에는 무엇이 있는가?	기존의 패치 클램프는 유리 피펫을 이용하여 수조작으로 세포를 잡아야 하는 등 실험에 어려움이 많았다. 이러한 문제점을 보완하기 위하여 구조적으로 기판 평면에 구멍을 제작하여 세포가 포함된 용액을 흘려주어 자연스럽게 패치 될 수 있는 방법과[8] 벽면에 구멍을 제작하여 세포막이 잘 흡입되어 패치 구멍에서의 커플링 노이즈(coupling noise)를최소화 하기 위한 구조 등이 발표되었으며(lateral patch aperture)[9], 최근에는 세포의 포획 처리량을 높이기 위해서 다수의 병렬 구조의 패치 클램프를 연구하고 있다[10,11]. 패치 클램프의 기본 원리는 (1) 세포를 주 채널을 통하여 입구에서 출구로 흘려주고, (2) 입구와 출구 사이에 위치한 패치 채널(patch channel)에 세포가 지나갈 때, 패치 채널 반대쪽에서 흡입 압력을 주어 세포를 채널로 빨아들인 뒤, (3) 흡입 압력을 계속 가하여 세포가 변형되어 채널에 위치하도록 하는 것이다.
	패치 클램프의 기본 원리를 설명하시오.	이러한 문제점을 보완하기 위하여 구조적으로 기판 평면에 구멍을 제작하여 세포가 포함된 용액을 흘려주어 자연스럽게 패치 될 수 있는 방법과[8] 벽면에 구멍을 제작하여 세포막이 잘 흡입되어 패치 구멍에서의 커플링 노이즈(coupling noise)를최소화 하기 위한 구조 등이 발표되었으며(lateral patch aperture)[9], 최근에는 세포의 포획 처리량을 높이기 위해서 다수의 병렬 구조의 패치 클램프를 연구하고 있다[10,11]. 패치 클램프의 기본 원리는 (1) 세포를 주 채널을 통하여 입구에서 출구로 흘려주고, (2) 입구와 출구 사이에 위치한 패치 채널(patch channel)에 세포가 지나갈 때, 패치 채널 반대쪽에서 흡입 압력을 주어 세포를 채널로 빨아들인 뒤, (3) 흡입 압력을 계속 가하여 세포가 변형되어 채널에 위치하도록 하는 것이다. 이 때, 더 강한 흡입 압력을 가하면 세포막이 터지면서 이온 채널이 외부와 통할 수 있는 상태가 된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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