본 연구는 소의 과립막세포 배양상층액에서 스테로이드 호르몬의 농도와 생쥐 배의 체외 발달에 미치는 효과를 검토하기 위하여 수행되었다. 소의 성숙난포(직경 6~15 mm)와 미성숙 난포(직경 2~5 mm)로부터 과립막세포를 각각 분리하여 15% FCS가 첨가된 Ham's F-10 배양약에서 16일간 배양하였다. 과립막세포들은 쉽게 단층배엽을 형성 하였으며, 배양과정 중 비슷한 성장패턴을 나타내었다. 또한 성숙 과립막세포와 미성숙 과립막세포 간에 형태적인 차이가 없었다. 과립막세포 배양 중 progesterone과 estradiol 생산이 활발하게 이루어졌으며, progesterone은 배양후기에, estradiol은 배양초기에 분비량이 높았다. 성숙 과립막세포와 미성숙 과립막세포에서 내분비 양상은 비슷하였다. 생쥐배가 상실배, 배반포 및 부화배반포 단계로 체외발달된 비율은 Ham'F-10배양액(86.7%, 41.7%, 13.3%)에 비하여 성숙 과립막세포 배양상층액(92.7%, 78.1%, 34.5%)과 미성숙 과립막세포 배양상층액(96.4%, 78.5%, 26.8%)에서 유의적으로 높았다(p<0.05). 그러나 배의 발달에 대하여 성숙 과립막세포배양상층액과 미성숙 과립막세포 배양상층액 간에는 차이가 없었다.
본 연구는 소의 과립막세포 배양상층액에서 스테로이드 호르몬의 농도와 생쥐 배의 체외 발달에 미치는 효과를 검토하기 위하여 수행되었다. 소의 성숙난포(직경 6~15 mm)와 미성숙 난포(직경 2~5 mm)로부터 과립막세포를 각각 분리하여 15% FCS가 첨가된 Ham's F-10 배양약에서 16일간 배양하였다. 과립막세포들은 쉽게 단층배엽을 형성 하였으며, 배양과정 중 비슷한 성장패턴을 나타내었다. 또한 성숙 과립막세포와 미성숙 과립막세포 간에 형태적인 차이가 없었다. 과립막세포 배양 중 progesterone과 estradiol 생산이 활발하게 이루어졌으며, progesterone은 배양후기에, estradiol은 배양초기에 분비량이 높았다. 성숙 과립막세포와 미성숙 과립막세포에서 내분비 양상은 비슷하였다. 생쥐배가 상실배, 배반포 및 부화배반포 단계로 체외발달된 비율은 Ham'F-10배양액(86.7%, 41.7%, 13.3%)에 비하여 성숙 과립막세포 배양상층액(92.7%, 78.1%, 34.5%)과 미성숙 과립막세포 배양상층액(96.4%, 78.5%, 26.8%)에서 유의적으로 높았다(p<0.05). 그러나 배의 발달에 대하여 성숙 과립막세포배양상층액과 미성숙 과립막세포 배양상층액 간에는 차이가 없었다.
This study was carried out to examine a concentration of steroid hormones and in vitro development of mouse embryos in culture supernatant of bovine granulosa cells (GC). To obtain the culture supernatant, granulosa cells were retrieved from mature follicles (6~15 mm diameter) and immature follicles...
This study was carried out to examine a concentration of steroid hormones and in vitro development of mouse embryos in culture supernatant of bovine granulosa cells (GC). To obtain the culture supernatant, granulosa cells were retrieved from mature follicles (6~15 mm diameter) and immature follicles (2~5 mm diameter) of bovine ovary and were cultured, respectively, in media of Ham's F-10 with 15% FCS for 16 days. Mature and immature granulosa cells formed their monolayers easily and showed similar growth patterns in culturing. There was no morphological difference between mature and immature granulosa cells. High levels of both progesterone and estradiol were detected in the culture supernatant of mature granulosa cells and immature granulsa cells, and the endocrine profiles of the two types of cells were similar. Progesterone secretion of granulosa cells was high in the late stage of culturing and estradiol secretion was high in the early stage of culturing. In vitro development rates of mouse embryos to morula, blastocyst and hatched blastocyst were significantly (p<0.05) higher in culture supernatant of mature granulosa cells (92.7%, 78.1% and 34.5%) and in culture supernatant of immature granulosa cells (96.4%, 78.5% and 26.8%) than in Ham's F-10 (86.7%, 41,7% and 13.3%). However, there was no difference between the culture supernatant of mature granulosa cells and the culture supernatant of immature granulosa cells in the development of embryos.
This study was carried out to examine a concentration of steroid hormones and in vitro development of mouse embryos in culture supernatant of bovine granulosa cells (GC). To obtain the culture supernatant, granulosa cells were retrieved from mature follicles (6~15 mm diameter) and immature follicles (2~5 mm diameter) of bovine ovary and were cultured, respectively, in media of Ham's F-10 with 15% FCS for 16 days. Mature and immature granulosa cells formed their monolayers easily and showed similar growth patterns in culturing. There was no morphological difference between mature and immature granulosa cells. High levels of both progesterone and estradiol were detected in the culture supernatant of mature granulosa cells and immature granulsa cells, and the endocrine profiles of the two types of cells were similar. Progesterone secretion of granulosa cells was high in the late stage of culturing and estradiol secretion was high in the early stage of culturing. In vitro development rates of mouse embryos to morula, blastocyst and hatched blastocyst were significantly (p<0.05) higher in culture supernatant of mature granulosa cells (92.7%, 78.1% and 34.5%) and in culture supernatant of immature granulosa cells (96.4%, 78.5% and 26.8%) than in Ham's F-10 (86.7%, 41,7% and 13.3%). However, there was no difference between the culture supernatant of mature granulosa cells and the culture supernatant of immature granulosa cells in the development of embryos.
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문제 정의
변화를 나타내는 특이한 세포들이다. 따라서 본 연구는 소의 난포에서 유래된 과립막세포를 배양 하면서 단층 배엽 형성과정 중의 형태적 특성과 내분비 기능을 조사하는 한편, 세포배양과정에서 얻어진 배양 상층액을 이용하여 생쥐배의 체외발달에 대한 효과를 검토코자 하였다.
본 연구는 소의 과립막세포 배양상층액에서 스테로이드 호르몬의 농도와 생쥐 배의 체외 발달에 미치는 효과를 검토하기 위하여 수행되었다. 소의 성숙난포(직경 6~15 mm)와 미성숙 난포(직경 2~5 mm)로부터 과립막세포를 각각 분리하여 15% FCS가 첨가된 Ham's F-10 배양약에서 16일간 배양하였다.
가설 설정
1: A non-dense culture of granulosa cells retrieved from immature follicles (2-5 mm diameter). 2: A non-dense culture of granulosa cells retrieved from mature follicles (6-15 mm diameter). 3: A dense granulosa cell culture from immature follicular cells.
2: A non-dense culture of granulosa cells retrieved from mature follicles (6-15 mm diameter). 3: A dense granulosa cell culture from immature follicular cells. 4: A dense granulosa cell culture from mature follicular cells.
3: A dense granulosa cell culture from immature follicular cells. 4: A dense granulosa cell culture from mature follicular cells. 5: Cumulus oophorus cells at low density.
4: A dense granulosa cell culture from mature follicular cells. 5: Cumulus oophorus cells at low density. 6: Cumulus oophorus cells at high density.
5: Cumulus oophorus cells at low density. 6: Cumulus oophorus cells at high density.
제안 방법
먼저 암컷 생쥐에 PMSG (sigma, USA) 5 IU를 복강주사하고 48시간 후에 HCG (Sigma, USA) 5 IU를 복강 주사하여 과배란을 유도하였다. HCG주사 후 암컷과 수컷을 1:1로 합사시켜 자연교미를 유도하고 48시간 후 암컷을 도살하여 수정 란을 회수하였다. Ham's F-10 용액으로 난관을 관류시켜 2세포의 배를 회수하여 세척하고 정상적인 배 만을 골라서 실험에 사용하였다.
과립 막세포를 15% FCS가 포함된 Ham's F-10 배 양액에서배양하고 2일마다 교체되는 배양액들을 모아서 -40℃에 냉동보관 하였다가 해동하여 0.2 μm millipore filter로 제균한 다음 배양액으로 사용하였다.
10~12주령의 수컷을 사용하였다. 먼저 암컷 생쥐에 PMSG (sigma, USA) 5 IU를 복강주사하고 48시간 후에 HCG (Sigma, USA) 5 IU를 복강 주사하여 과배란을 유도하였다. HCG주사 후 암컷과 수컷을 1:1로 합사시켜 자연교미를 유도하고 48시간 후 암컷을 도살하여 수정 란을 회수하였다.
배양과정 중 과립막세포들의 배양액 내로 분비한 호르몬의 정량을 위하여 progesterone과 estradiol에 대하여 측정하였다. 과립막세포에서 분비 된 progesterone 수준은 Fig.
배양과정 중 과립막세포들이 배양액 내로 분비한 progester- one과 estradiol의 분비 량은 RIA (radioimmunoassay)법 에 의하여 조사하였다. 배양액 중의 이 호르몬들 농도는 시판되는RIA-kits (Bieranas, Bad, Nauheim, Germany)를 이용하여 crystal scintillation counter (LKB, Sweden) 에서 측정하였다.
분리 하였다. 직경이 2~5 mm인 미성숙 난포(immature follicle)와 6—15 mm인 성숙 난포(mature follicle)에서 미성숙과립 막세 포 (immature granullosa cell) 와 성숙 과립 막세 포 (mature granulosa cell)들을 각각 따로 분리하여 배양하였다. 먼저 18 gage 주사침으로 난포액을 흡입하여 시험관에 모은 다음 175x g에서 5분간 원심 분리하여 과립막세포를 분리하였다.
대상 데이터
HCG주사 후 암컷과 수컷을 1:1로 합사시켜 자연교미를 유도하고 48시간 후 암컷을 도살하여 수정 란을 회수하였다. Ham's F-10 용액으로 난관을 관류시켜 2세포의 배를 회수하여 세척하고 정상적인 배 만을 골라서 실험에 사용하였다.
본 연구에 사용된 배양액은 Ham's F-10 (Flow Laboratories, Berlin)에 25 mM의 NaHCo3/18 mM의 L(+) Lactate, 15% FCS, 50 lU/ml의 Penicilline을 추가하여 사용하였다.
수행되었다. 소의 성숙난포(직경 6~15 mm)와 미성숙 난포(직경 2~5 mm)로부터 과립막세포를 각각 분리하여 15% FCS가 첨가된 Ham's F-10 배양약에서 16일간 배양하였다.
실험동물로 CB6/F1 교잡종 생쥐(Chares River) 4~6주령의 암컷과 10~12주령의 수컷을 사용하였다. 먼저 암컷 생쥐에 PMSG (sigma, USA) 5 IU를 복강주사하고 48시간 후에 HCG (Sigma, USA) 5 IU를 복강 주사하여 과배란을 유도하였다.
데이터처리
본 연구에서 얻어진 성적들은 Duncan 다중검정으로 통계분석하고 결과들을 서로 비교하였다.
이론/모형
이용하였다. 배양과정 중 과립막세포들이 배양액 내로 분비한 progester- one과 estradiol의 분비 량은 RIA (radioimmunoassay)법 에 의하여 조사하였다. 배양액 중의 이 호르몬들 농도는 시판되는RIA-kits (Bieranas, Bad, Nauheim, Germany)를 이용하여 crystal scintillation counter (LKB, Sweden) 에서 측정하였다.
성능/효과
과립막세포 배양 중 progesterone과 estradiol 생산이 활발하게 이루어졌으며, progesteronee 배양후기에, estradiole 배양초기에 분비량이 높았다. 성숙 과립막세포와 미성숙 과립 막 세포에서 내분비 양상은 비슷하였다.
Estradiol을 분비하는 세포의 기능이 progesterone 에 의하여 억제된다는 것은 일반적인 사실이다. 또한 es- tradiol의 분비량은 미성숙 과립막세포보다 성숙 과립 막 세포에서 다소 높았다. 이에 대하여 선행의 연구결과를 접할 수 없어서 논의할 수 없으나 전체적인 분비양상은 서로 비슷하다고 본다.
사람의 과립 막 세포는 장기간 배양이 가능하고μ이, 14일 이후 호르몬 농도는 변함없이 일정한 수준을 유지하였다μ이는 보고와 유사한 결과였다. 또한 배양초기 progesterone 분비량은 미성숙 과립막세포에 비하여 성숙 과립막세포에서 높았다. 이와 같은 결과는 과립 막 세포가 배란 전에 progesterone 합성능력을 획득하고 배란 후 황체세포로 분화되어 progesterone을 활발하게 분비한다는 사실을 고려할 때 당연한 결과로 사료된다.
그러나 성숙 과립막세포와 미성숙 과립막세포 배양상층액 간에는 차이가 없었다. 또한 부화배반포까지 발달한 배의 비율은 Ham's F-10에서 13.3%인데 비하여 성숙 과립막세포 배양상층액에서 34.5% 미성숙 과립막세포 배양상층액에서는 26.8%로 과립 막 세포 배양상층액에서 우수하였다. 한편 성숙 과립 막 세포와 미성숙 과립세포 배양상층액 간에는 성숙과립세포 배양상층액에서 효과가 높게 나타났으나 유의차는 없었다.
결과를 나타낸 것이다. 먼저 상실배로 발달하지 못하고 퇴화한 비율이 Ham's F-10에서 13.3%인 반면 성숙 난구 세포와 미성숙 난구세포에서는 양쪽 모두 3.6%에 불과하였다.
상실배까지 도달한 비율은 Ham's F-10에서 86.7% 성숙 과립 막 세포 배양상층액에서 92.7% 미성숙 과립막세포 배양상층액에서 96.4%이었으며, 상실배에 도달한 비율은 Ham's F-10에서 41.7% 성숙 과립막세포 배양상층액에서 78.1% 미성숙 과립 막 세포 배양상층액에서는 78.5%로 Ham's F-10에 비하여 과립 막 세포 배양상층액에서 다소 우세한 경향을 보였다(p<0.05). 그러나 성숙 과립막세포와 미성숙 과립막세포 배양상층액 간에는 차이가 없었다.
생쥐배가 상실배, 배반포 및 부화배반포 단계로 체외발달된 비율은 HamFlO배양액(86.7%, 41.7%, 13.3%)에 비하여 성숙 과립막세포 배양상층액(92.7%, 78.1%, 34.5%)과 미성숙 과립 막 세포 배양상층액(96.4%, 78.5%, 26.8%)에서 유의적으로 높았다(pCO.05). 그러나 배의 발달에 대하여 성숙 과립 막 세포배양 상층 액과 미성숙 과립막세포 배양상층액 간에는 차이가 없었다.
참고문헌 (13)
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