[논문]βig-h3포함 키토산 상처 도포제의 섬유아세포 증식 및 상처치유 개선 능 평가

조애리; 최희선

doi:10.4333/kps.2009.39.1.051

[국내논문] βig-h3포함 키토산 상처 도포제의 섬유아세포 증식 및 상처치유 개선 능 평가
Effects of βig-h3/Chitosan Dressing on Dermal Fibroblast and Wound Healing 원문보기

藥劑學會誌 = Journal of Korean pharmaceutical sciences, v.39 no.1, 2009년, pp.51 - 54

Abstract ▼ AI-Helper

${\beta}ig$-h3, is a TGF-${\beta}$-induced gene product, extracellular matrix protein with 68 kDa MW(683 amino acids) and has been known for its possible roles in cell adhesion, spreading, migration and proliferation. To minimize a proteolytic degradation of ${\beta}ig$-h3, ${\beta}ig$-h3 incorporated chitosan sponge was prepared and its effects on fibroblast adhesion and migration were investigated. And its wound healing efficacy was evaluated in deep 2nd degree burn rabbit ear wound model. ${\beta}ig$-h3 enhanced fibroblast adhesion and proliferation. In histological observation, a significant over-proliferation of epidermal regeneration was observed in ${\beta}ig$-h3/chitosan dressing applied wound while epidermal regeneration was not proceeded yet in chitosan only treated wound. ${\beta}ig$-h3/sponge dressing could enhance epidermal regeneration.

Keyword

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

5) 이러한 특성을 이용하여 βig-h3을 안정화하고 담체로 가공된 형태(Figure 1)의 상처도포제가 국내의 리젠바이오텍에 의해서 개발되고 있으며, 본 실험실에서는 창상치유개선 능에 대한 연구를 수행하여 그에 대한 결과를 보고하고자 한다.
이에 본 논문에서는 βig-h3함유 키토산 드레싱 제제의 창상 치유평가를 위한 창상모델의 정립 및 창상치유에 대한 조직학적 소견을 통하여 βig-h3함유 키토산 드레싱 제제의 창상치유 개선효과에 대한 결과를 발표하고자 한다.

제안 방법

섬유아세포(primary human foreskin fibroblasts)를 6 well plate (4.5*105 cells/well)에 seeding 후, DMEM 배양액에 10% heat inactivated fetal bovine serum과 페니실린/스트렙토마이신(100 units/mL)과 βig-h3(0,1,10 µL)를 첨가하여 배양시킨 후 cell이 거의 confluent하면 yellow tip 끝으로 scratch한 후 각 시간마다(0, 1, 6, 9, 12, 24, 48 hr) 사진을 찍어 배양액 중에 첨가된 βig-h3의 농도에 따른 세포의 흡착, 이동 및 증식정도를 비교 평가하였다.
본연구실에서는 상피세포 성장인자의 2도 화상에서의 창상치유 효과를 마우스, 토끼의 등 및 귀 등의 창상모델을 통하여 연구한 결과 토끼의 귀가 다른 동물에 비하여 사람과 유사한 창상치유 과정을 나타내는 것을 알게 되었다. 이에 본 연구에서는 창상치유 효과의 평가기준을 창상 유도 후 96시간 경과 후 조직 검사를 통하여 창상부위의 상피화 진행정도, 창상부위의 진피층 내의 결합섬유(collagen fiber)의 배열(alignment), 성장도(maturity), 분포밀도(density) 등의 평가 및 드레싱 제제의 창상부위의 피부에 대한 염증세포 존재평가를 통한 키토산 및 키토산 치환제제의 피부세포 면역반응 유도의 평가를 하였다. 이에 본 논문에서는 βig-h3함유 키토산 드레싱 제제의 창상 치유평가를 위한 창상모델의 정립 및 창상치유에 대한 조직학적 소견을 통하여 βig-h3함유 키토산 드레싱 제제의 창상치유 개선효과에 대한 결과를 발표하고자 한다.
창상 후 얼음물에 담가두었던 Acrynol 용액 10 mL를 창상피부의 감염예방 및 진정작용을 위하여 30초간 적용시킨다. 창상 후 24시간에 멸균된 큐렛으로 죽은 상피 막(dead epidermis layer)을 제거하여 창상 모델을 준비하였다. 재현성 있는 창상모델을 정립하기 위하여 Thermostar System (polyscience Co.
창상 후 24시간에 멸균된 큐렛으로 죽은 상피 막(dead epidermis layer)을 제거하여 창상 모델을 준비하였다. 재현성 있는 창상모델을 정립하기 위하여 Thermostar System (polyscience Co., Illinois, USA)을 이용하여 적용hot water의 온도와 적용시간을 정확히 균일하게 유지하였으며, 창상부위의 조직을 조사하여 창상의 손상 정도가 균일한 지를 검사하였다.⁴⁾
창상유도 후 아무 처리도 하지 않고, 열린 상태로 둔 Open wound, Occlusion only (Duoderm dressing), chitosan sponge, chitosan과 βig-h3 protein을 coating한 sponge (Chitosan/βig-h3 sponge)를 각각 창상부위에 적용한다. 드레싱 적용 후 2, 3, 4일째에 조직을 상피의 재생정도를 관찰 하고 사진을 찍는다. 창상은 같은 조건에서 한 실험동물 당 4개씩(circular wound, diameter:1 cm)을 준비하여, 4개의 병변 모두에서 조직검사를 시행한다.
드레싱 적용 후 2, 3, 4일째에 조직을 상피의 재생정도를 관찰 하고 사진을 찍는다. 창상은 같은 조건에서 한 실험동물 당 4개씩(circular wound, diameter:1 cm)을 준비하여, 4개의 병변 모두에서 조직검사를 시행한다. 창상피부에 occlusive dressing을 도포하여 각 시료 적용 군 간의 상처부위로부터의 삼출물 등의 흡수, occlusion 정도 등을 잘 조절한다.
이에 βig-h3가 손상된 섬유아세포의 생장에 미치는 영향 등을 조사하기 위하여 in vitro wound model이 정립되었으며, βig-h3 protein에 의한 fibroblast cell의 injury 후, migration 변화, 증식속도 변화 등을 관찰하였다.
포매 된 시료는 5~6 mm 두께로 깎아 염색하여 검경하였다. 조직학적 소견은 Olympus Microscope(BX41) Image recording equipment (DP11, PM10SP)를 이용하여 관찰하고, 촬영하였다.
βig-h3의 창상치유 개선 능을 평가하기 위하여, 대조군으로 부분결손 창상 유도 후 아무 처리도 하지 않은 군(A: open wound), 창상부위에 occlusive dressing 만을 투여한 군(B: occlusion only), 키토산 드레싱 처리 군(C: chitosan dressing only)과 βig-h3함유 키토산 드레싱 제제(D: βig-h3/Chitosan dressing) 투여 군에서의 창상부위의 상피화 진행정도, 창상부위의 진피 층 내의 결합섬유(collagen fiber)의 배열(alignment), 성장도(maturity), 분포밀도(density) 등의 평가를 통하여 βig-h3의 창상치유 능을 평가하였다.
원형으로 1 cm2의 면적을 각각의 토끼에 4개씩 귀의 안쪽부위에 표시 후 피부에 85±0.1℃ hot water를 8~15초간 적용하여 1 cm2 크기의 부분결손 창상을 만들었다.
창상피부에 occlusive dressing을 도포하여 각 시료 적용 군 간의 상처부위로부터의 삼출물 등의 흡수, occlusion 정도 등을 잘 조절한다. 드레싱 적용 후 96시간 경과 후 적용 부위를 도려낸 후 포름 알데하이드에 고정시킨 후 Hematoxylin-Eosin 염색을 하여 조직검사를 하였다. 상피화 정도, 상처부위의 염증세포 존재유무, 진피 층의 콜라겐 matrix의 재생정도 및 배열의 규칙성 등을 조사하였다.
드레싱 적용 후 96시간 경과 후 적용 부위를 도려낸 후 포름 알데하이드에 고정시킨 후 Hematoxylin-Eosin 염색을 하여 조직검사를 하였다. 상피화 정도, 상처부위의 염증세포 존재유무, 진피 층의 콜라겐 matrix의 재생정도 및 배열의 규칙성 등을 조사하였다.

대상 데이터

실험동물은 (New Zealand White Rabbit) 4그룹(0, 24, 48, 96 hr)으로 나누어 졌다. 원형으로 1 cm²의 면적을 각각의 토끼에 4개씩 귀의 안쪽부위에 표시 후 피부에 85±0.

성능/효과

⁷⁾ 이를 위하여 마우스, Rat 등의 창상모델이 실험에 이용되고 있으나, 쥐의 피부는 조직학적으로 다수의 모낭을 함유하고 있으며, 창상의 수축에 의한 상처 부위의 닫힘이 주요 치유과정으로, 상처부위의 상피화에 의한 치유과정이 주요인 사람에 비해 창상 치유속도가 현저히 빠르며, 흉터(scar)가 생성되지 않는 등 쥐에서의 실험결과를 사람에 적용하는 것이 바람직하지 않다는 많은 연구들이 보고되고 있으며,⁸⁾ 아직 이상적인 창상모델은 정립되지 못한 실정이었다. 본연구실에서는 상피세포 성장인자의 2도 화상에서의 창상치유 효과를 마우스, 토끼의 등 및 귀 등의 창상모델을 통하여 연구한 결과 토끼의 귀가 다른 동물에 비하여 사람과 유사한 창상치유 과정을 나타내는 것을 알게 되었다. 이에 본 연구에서는 창상치유 효과의 평가기준을 창상 유도 후 96시간 경과 후 조직 검사를 통하여 창상부위의 상피화 진행정도, 창상부위의 진피층 내의 결합섬유(collagen fiber)의 배열(alignment), 성장도(maturity), 분포밀도(density) 등의 평가 및 드레싱 제제의 창상부위의 피부에 대한 염증세포 존재평가를 통한 키토산 및 키토산 치환제제의 피부세포 면역반응 유도의 평가를 하였다.
Fibroblast injury 후, 아무 처리도 하지 않은 control, βig-h3 1 µL 첨가한 세포군과 βig-h3 10 µL 첨가한 세포군의 증식정도를 0 h, 6 hr, 24 h, 48 hr 확인한 결과, βig-h3 10 µL 첨가한 세포군에서는 control보다 migration이 빨리 되고, 세포의 증식속도가 증가된 것을 볼 수 있다.
진피층 부분결손 창상모델(deep 2nd degree burn rabbit ear anterior part wound model)이 정립되었으며, 키토산 스폰지에 βig-h3을 코팅한 드레싱 제제에서 창상피부의 상피증식속도의 개선이 관찰되었다.
Fibroblast injury 후, 아무 처리도 하지 않은 control, βig-h3 1 µL 첨가한 세포군과 βig-h3 10 µL 첨가한 세포군의 증식정도를 0 h, 6 hr, 24 h, 48 hr 확인한 결과, βig-h3 10 µL 첨가한 세포군에서는 control보다 migration이 빨리 되고, 세포의 증식속도가 증가된 것을 볼 수 있다. 창상 후 1시간부터 세포의 이동과 증식이 계속해서 이루어지며, 24시간이 되면 손상된 세포가 거의 다 증식하여 48시간(data not shown)에는 결손 된 세포의 재생이 거의 완전하게 이루어지는 것으로 관찰되었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	βig-h3의 단점은 무엇인가?	βig-h3는 단백질 제제로서 상처 혹은 배양기질에서 세포나 조직으로부터 분비되는 단백분해효소에 의해 가수분해 되어 활성이 감소하는 단점을 가지고 있다. 이와 같은 현상은 성장인자들이 가지는 공통적 특성으로 생체 내에서는 헤파린과 같은 다당류와 결합하여 안정화 되는 특징을 가지고 있다.
	βig-h3란 무엇인가?	βig-h3는 Transforming Growth Factore-β (TGF-β)에 의해서 유도되는 683개의 아미노산으로 구성된 단백질로, 세포 외 액 기질(extracellular matrix, ECM) 중에 존재하여 세포 간 흡착, 이동, 증식에 관여하는 것으로 보고되었다.1-4)
	창상의 정상적인 상처치유과정에서는 어떻게 상처부위의 치유가 일어나게 되는가?	6) 창상 치유의 각 과정에는 염증세포, 각질세포, 섬유 아 세포 등에서 분비되는 여러 종류의 성장인자 혹은 싸이토 카인이 함께 작용하여 창상 치유에 관여한다. 즉 정상적인 상처치유과정에서는 상처부위의 염증세포가 분비하는 매개체들의 신호에 의해서 대식세포들이 상처부위로 모여들고, cytokine 등을 분비하면, 상처부위에서 섬유 아 세포 등의 이동과 증식이 진행되면서 손상된 상처부위의 진피 층이 기질을 형성하면서 상처부위의 치유가 일어나게 된다. 상처치료제의 올바른 동물임상 평가를 위하여는 선택된 창상 모델이 해부학적 또는 기능적으로 사람과 얼마나 유사한지, 비용, 실험의 용이성 등을 고려하여 선택되어져야 한다.

참고문헌 (9)

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원문보기 상세보기
A. Cho Lee, H. Yong, A. Moon, J. Lee and K. Park, In vitro dermal fibroblast wound model to study mitogenic activity and cytokine levels, Proceedings of 8th World Biomaterials Congress, P-Sat-I-546, 2008.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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