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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 우슬추출물을 이용한 연고제제와 수중운동을 통하여 족 부종체적변화와 관절염지수평가 및 혈액학적인 분석과 병리조직학적 변화를 관찰 및 분석하여 임상적 효율성을 위한 자료를 제공하고자 실시하였다.
- 본 연구는 류마티스 관절염 흰쥐 모델을 대상으로 수중운동과 우슬추출물을 이용한 연고제제를 28일 동안 적용한 후 족부의 체적변화, 관절염지수, 관절염의 배측굴곡 및 저측굴곡 통증 지수 그리고 조직학적인 검사(Sa&anin O-fast green)와 ELISA를 이용하여 PGEz의 농도 변화를 측정하여 염증 및 통증반응에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 모든 실험결과는 치료적 중재를 실시한 후측 정한 결과를 토대로 하였으며, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 본 연구에서는 류마티스 관절염 흰쥐에 우슬 추출물을 이용한 연고와 수중운동을 적용하여 관절염 지수, 족부종율, 관절염 배 측 및 저측굴곡 통증 지수와 병리조직학적 분석 및 혈청에서의 PGE2의 변화를 관찰하여 통증 및 염증반응에 대한 기초자료를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- 물의 온도는 류마티스 관절염에 효과가 있는 온도를 설정하기 위해 35 ± 1 ℃로 하였으며17), 물의 깊이는 50 cm 높이로 하여 흰쥐가 임의로 멈추어 있거나 풀에서 탈출하는 것을 방지하였다. Contarteze 등23)의 선행연구를 기초로 체중의 5.5% 부하를 주어 운동에 대한 스트레스 틀 받지 않는 범위에서 운동효과를 높여 주었으며, 주 3회 25분씩, 총 3주간 실시하였다. 수중운동 후 급격한 체온 저하를 방지하기 위해 수건으로 젖은 몸을 닦아주고 온풍기틀 이용하여 체온을 유지하도록 하였다.
- Hughes 등25)의 연구방법을 수정한 것으로 관절염의 중증도를 정량적으로 평가하고자 흰쥐의 각 지절에서 관절 주위부의 염증이나 발적 및 부종과 같은 임상적 관절염의 증상을 육안으로관찰한 후 흰쥐의 후족부를 0점에서 4점으로 점수를 배점하였고, 다시 사지의 점수를 합산하여 각각의 개체에 최대 16점으로 채점하여 관절염 지수(Arthritic index)를 구하였다(Table 2).
- 1% acetic acid solution에 10 조간 반응시킨 후 0, 1% safranin O solution에 5 분간 염색하였다. Safranin O-fast green 으로 염색된 슬라이드는 5~10분 정도 충분히 세척하여 핵이 청명한 색이 되도록 하고, 탈수 및 투명과정율 거친 후 뽕입하였다’ 그 후 광학현미경 (Olympus BX50, Olympus Optical Co. Japan) 에 디지털 CCD 카메라(FmuIus* IEEE 1394z Germany)를 장착하여 각 군의 조직들을 촬영하였다. 이를 Beehelr 등27)의 방법을 응용하여 세포침윤, 활액막의 과다증시, 판누스 형성, 연골의 파괴 정도를 조직학적 지수(H0ohgkE index)로 구분하여 Oeormal), changes)z 2(moderate changes), 3(segt changes)으로 점수화하여 평가 하였다.
- 이와 같이 얻은 경 피투 과제는 밀봉하여 사용할 때까지 냉장실(2~3℃)에 보관하였다. 각 실험군에 연고도포 방법은 우슬추출물을 이용한 연고 0.1 g을 최종 유발일로부터 28일 동안 고르게 펴서 도포하였다.
- 또한 족 부종의 체적측정은 유발 전, 유발 후 3, 7, 14, 21, 28일째에 각각 3회 반복 측정하여 평균을 내어 체적(㎖)을 산출하였다.
- 류마티스 관절염 유발 28일 후, 각 실험군에서 슬관절부위예 Safranin O-fast green 염색을 실시하여 세포침윤, 활액막 과다증식, 판누스 형성, 연골의 파괴정도를 측정하였으며, 실험군간 변화를 일표본 대응 T검정을 통해 비교한 결과는 다음과 같다. 실험군 I 과 비교하여 본 결과 세포침윤정도는 실험군 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ에서 호전된 차이가 유의하게 나타났으며(pV05), 활액막 과다증식 정도는 실험군 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ에서 호전된 차이가 유의하게 나타났고 (p<-05), 판누스 형성정도는 실험군 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ에서 호전된 차이가 유의하게 나타났으며(pv.
- 5% 부하를 주어 운동에 대한 스트레스 틀 받지 않는 범위에서 운동효과를 높여 주었으며, 주 3회 25분씩, 총 3주간 실시하였다. 수중운동 후 급격한 체온 저하를 방지하기 위해 수건으로 젖은 몸을 닦아주고 온풍기틀 이용하여 체온을 유지하도록 하였다.
- 수중운동은 온도 조절이 되는 스테인리스 재질의 원통형 수조(직경: 160 cm, 깊이: 60 an)에서 실시하였다. 물의 온도는 류마티스 관절염에 효과가 있는 온도를 설정하기 위해 35 ± 1 ℃로 하였으며17), 물의 깊이는 50 cm 높이로 하여 흰쥐가 임의로 멈추어 있거나 풀에서 탈출하는 것을 방지하였다.
- Japan) 에 디지털 CCD 카메라(FmuIus* IEEE 1394z Germany)를 장착하여 각 군의 조직들을 촬영하였다. 이를 Beehelr 등27)의 방법을 응용하여 세포침윤, 활액막의 과다증시, 판누스 형성, 연골의 파괴 정도를 조직학적 지수(H0ohgkE index)로 구분하여 Oeormal), changes)z 2(moderate changes), 3(segt changes)으로 점수화하여 평가 하였다.
- 간격으로 5번씩 부드럽게 굴곡시킨다. 이와 같은 방법을 적용할 때 쪽관절에 가하는 힘은 혈액순환의 차단을 관찰하기 위해 엄지발가락의 색깔 변화를 관찰하면서 적용하였다. 각각의 개체에 대하여 총 발회피 점수는 0~5점 사이에서 얻을 수 있으며, 정상 측과 비교하여 빠르지 않은 발회피 반응을 보이면 0점, 정상 측과 비교하여 활발한 발회피반음을 보일 경우를 1점으로 주었다.
- USA)를 사용하여 측정하였다. 측정방법은 류마티스 관절염 유발 전, 유발 후 28일째에 각 군으로부터 심장 채혈하여 혈청을 분리하였다. 먼저 Calibrator Diluent RD5-39를 비특이적 결합(nonspecific binding, NSB)을 한 well에 150 ㎕ 첨가하고, Calibrator Diluent(RD5-3950)를 100 ㎕ 첨가하여 zero standard weH을 만들었다< 다음으로 microplate weH에 sample과 100 ㎕의 standard 용액을 첨가하였다* 또한 blank와 NSB well을 제외한 나머지 sample well에 50 ㎕의 PGE? primary antibody solution 을 첨가하고, blank를 제외한 나머지 well에 50 ㎕의 Conjugate> 첨가하였다.
- 혈청에서 PGE2의 측정은 PGE2 assay kit(R & D System Incv Minneopolis, USA)를 사용하여 측정하였다. 측정방법은 류마티스 관절염 유발 전, 유발 후 28일째에 각 군으로부터 심장 채혈하여 혈청을 분리하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 생후 7주령의 체중 약 250 ± 25 g 내외의 Sprague-Dawley계 흰쥐 (Hawin Co, Korea) 를 각 군당 27마리를 할당하여 총 108마리를 사용하였다. 흰쥐를 항온항습 장치가 부착된 사육장에서 고형사료(Samyang Co, Korea)와 물을 충분히 자유 급식하면서 실험실 환경(실내온도 25 ± It, 습도 55 ± 10%, 12시간 명암주기)에 1주일간 적응시킨 후 사용하였다.
- 총 108마리를 사용하였다. 흰쥐를 항온항습 장치가 부착된 사육장에서 고형사료(Samyang Co, Korea)와 물을 충분히 자유 급식하면서 실험실 환경(실내온도 25 ± It, 습도 55 ± 10%, 12시간 명암주기)에 1주일간 적응시킨 후 사용하였다.
데이터처리
- Signecantly different as compared wrth pre and expenmental group I by paired P<-001). Significantiy different as compared with exoenmental grojp I by paired t-test(**: p<, 01).
- Values are showed mean±SD. Tested by One*way ANOVA(##: Values with different alphabet within the column are significantly different by Duncan's muitiple range test(p<.05). Significantly different as compared with 3rd days by paired Hest(**: p<.
- Values are showed mean±SD. Tested by One-way ANOVA(##: Values with different alphabet w;thin the column are significantly different oy Duncan's multiple range test(p<, 05). Significantly different as comoared with 3rd days by paired p(.
- Values are showed mean+SD. Tested by One-way ANOVA(##: Values with different alphabet wfthin the column are significantly different by Duncan's multiple range test(p<.05). Sigmficantiy different as compared with 3rd days by paired t-test(*: p<.
- 0을 이용하여 평균과 표준편차를 산출하였다. 류마티스 관절염 유발 후 수중운동과 우슬추출물의 연고도포를 각 실험군 간의 시기별 통계학적 유의성을 검증하기 위하여 일요인분산분석(On욘-way ANOVA)을 실시하였으며, 사후검정은 Duncan's multiple range test로 실시하였다, 그리고 각 실험군의 측정시기에 따른 차이를 검정하기 위하여 일표본대응 T검정(paired Rest)을 실시하였다 실험의 분석 시 유의수준은 pV)5로 설정하여 검정하였다.
- 본 연구에서는 윈도우용 SPSS 12.0을 이용하여 평균과 표준편차를 산출하였다. 류마티스 관절염 유발 후 수중운동과 우슬추출물의 연고도포를 각 실험군 간의 시기별 통계학적 유의성을 검증하기 위하여 일요인분산분석(On욘-way ANOVA)을 실시하였으며, 사후검정은 Duncan's multiple range test로 실시하였다, 그리고 각 실험군의 측정시기에 따른 차이를 검정하기 위하여 일표본대응 T검정(paired Rest)을 실시하였다 실험의 분석 시 유의수준은 pV)5로 설정하여 검정하였다.
이론/모형
- 우슬을 이용한 경피투과제의 제조는 이한섭22)의 연구를 기초로 하였다. 경 피 투과제 제조시 용매에 우슬의 20-hydroxy- ecdysone 성분의 양을 일정하게 취하여 각각 용해시켰다.
성능/효과
- 01). Duncan의 다중범위검정으로 사후검정을 실시한 결과, 28일째에 실험군 I 과 실험군 Ⅱ, HL IV 사이에는 유의한 차이를 보였다(p<, 05)(Fig. 3). 실험군별 측정시기에 따른 변화를 일표본 대응 T검정으로 실시한 후 류마티스 관절염 유발 3일째와 비교하여 보면, I 군은 시기별로 호전된 차이가 유의하지 않았으나(p>.
- Safranin O-fast green 염색을 통하여 슬관절의 조직화 학적소견을 관찰한 결과 실험전에서는 대퇴(fomur)와 슬개골(patella) 의 관절연골, 연골하 골조직, 활액막, 관절강 및 관절낭 등에서 정상적인 조직소견을 볼 수 있었다(Fig. 5A). 류마티스 관절염 실험종료 후, 실험군 I 은 슬관절의 활액막의 과다증식으로 인하여 염증 세포침윤과 과도한 섬유성 판누스(fibrous pannus)를 형성하고 있었다.
- 05). Sigmficantiy different as compared with 3rd days by paired t-test(*: p<;.O5, **: p(.
- 각 실험군의 시기별 관절염 배측굴곡 통증 지수의 변화를 일요인 분산분석으로 유의성검정을 실시한 결과, 실험적 중재 이후 28일째 실험군들 간에 유의한 차이를 보였다(pv.01). Duncan의 다중범위검정으로 사후검정을 실시한 결과, 28일째에 실험군 I 과 실험군 Ⅱ, HL IV 사이에는 유의한 차이를 보였다(p<, 05)(Fig.
- 각 실험군의 시기별 관절염 저측굴곡 통증 지수의 변화를 일요인 분산분석으로 유의성검정을 실시한 결과, 실험적 중재 이후 28일째에는 실험군들 간에 유의한 차이를 보였다(pv.01). Duncan 의 다중범위검정으로 사후검정을 실시한 결과, 28일째에 실험군 I과 실험군 Ⅱ, Ⅲ, IV 사이에는 유의한 차이를 보였다 (p<.
- 각 실험군의 시기별 관절염 지수의 임상적인 평가의 변화를 일요인 분산분석으로 유의성검정을 실시한 결과, 실험적 중재 이후 28일째 실험군들 간에 유의한 차이를 보였다(p<, 01). Duncan 의 다중범위검정으로 사후검정을 실시한 결과, 28일째에는 실험군 I과 실험군 Ⅱ, 5, IV 사이에는 유의한 차이를 보였다 (p<.
- 각 실험군의 시기별 족 부종의 체적변화를 일요인 분산분석으로 유의성검정을 실시한 결과, 실험적 중재 이후 28일째 실험군들 간에 유의한 차이를 보였다(p<, 01). Duncan의 다중범위검정으로 사후검정을 실시한 결과, 28일째에는 실험군 I 과 실험군 n, m, iv 사이에는 유의한 차이를 보였다(p<.
- 두 번째로 실험종료 후 Safranin O-fast green 염색 후 조직학적인 지수로 정량화하여 분석한 결과, 실험군 I 은 슬관절 부위의 활액막의 과다증식으로 인하여 염증 세포침윤과 과도한 섬유성 판누스(fibrous pannus)를 형성하고 있었으며, 이로 인하여 관절연골(articular cartilage), 연골하 골조직(subchondral bony tissue)이 심하게 파괴되었음을 관찰할 수 있었다. 반면, 실험군 H, E, IV에서는 만성 염증성 세포침윤과 활액막의 과다증식은 거의 보이지 않았으며, 섬유성 판누스의 형성, 관절연골의 파괴는 현저하게 감소함을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 001). 또한, m군은 유발 7일째, 28일째 (p<-01), 14일째, 21일째(pv.001)에서 호전된 차이가 유의하게 나타났으며, IV군에서는 유발 7일째, 14일째, 21일째, 28일째 (pv.001)에서 호전된 차이가 각각 유의하게 나타났다(Fig. 2).
- 01). 또한, 皿 군은 유발 14일째, 21일째(pv.01), 유발 28일째(pv.001)에서 각각 호전된 차이가 유의하게 나타났으며, IV군에서는 유발 21일째(pv.05) 와 유발 28일째(p<.01)에서는 호전된 차이가 각각 유의하게 나타났다(Fig. 3).
- 수 있었다(pVOl). 류마티스 관절염의 실험종료 후 슬관절부위의 Safranin O-fast green 염색결과를 관찰하여 조직 학적 인지 수로 표현한 결과, 실험군 I 보다 실험군 n, m, IV에서 염증세포 침윤과 활액막의 과증식(pv.05), 과도한 섬유성 판누스 (fibrous pannus) 형성과 연골파괴 지수가 통계적으로 유의한 감소를 보였다(pv.Ol). PGE2의 발현량을 측정한 결과 실험군 1 에서는 PGE2의 분비는 증가한 반면에 실험군 n, m, IV에서는 발현 억제의 효능이 일부 관찰 되었다(pv.
- 5B). 반면, 실험군 H, DI, IV에서는 만성 염증성 세포침윤과 활액막의 과다증식은 거의 보이지 않았으며, 섬유성판누스의 형성, 관절연골의 파괴는 현저하게 감소함을 관찰할 수 있었다. 특히 골간단(metaphysis)부위에서는 골외막의 증식성 변화와 신생골조직의 증식이 관찰되었다(Fig.
- 심하게 파괴되었음을 관찰할 수 있었다. 반면, 실험군 H, E, IV에서는 만성 염증성 세포침윤과 활액막의 과다증식은 거의 보이지 않았으며, 섬유성 판누스의 형성, 관절연골의 파괴는 현저하게 감소함을 관찰할 수 있었다(Fig. 5, 6).
- 관절염의 염증 반응에 가장 중요한 PG 중 하나이다40). 본 연구에서 혈청에서의 PGE2 농도를 측정한 검사 결과, 실험군 I 의 농도를 유발 전과 비교하여 볼 때 통계적으로 유의히게 증가하는 것을 볼 수 있는 반면(pWOl), 실험군 Ⅱ, Ⅲ, IV의 농도는 통계학적으로 유의하게 감소함을 볼 수 있었다(p<an)(Fig. 7). 이러한 PGE2의 효과적인 억제는 곧 만성적 염증 및 통증반응을 효과적으로 감소시켰다고 볼 수 있다.
- 실험군 I 과 비교하여 본 결과 세포침윤정도는 실험군 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ에서 호전된 차이가 유의하게 나타났으며(pV05), 활액막 과다증식 정도는 실험군 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ에서 호전된 차이가 유의하게 나타났고 (p<-05), 판누스 형성정도는 실험군 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ에서 호전된 차이가 유의하게 나타났으며(pv.oi), 또한 연골의 파괴정도는 실험군 U, m, IV예서 호전된 차이가 유의하게 나타났다(p<01)(Fig. 6).
- 4). 실험군별 측정시기에 따른 변화를 일표본 대응 T 검정으로 실시한 후 류마티스 관절염 유발 3일째와 비교하여 보면, I 군, II군에서는 유발 28일째에 호전된 차이가 유의하게 나타났다(pv. 01). 또한, ID군에서는 유발 21일째(pv.
- 2). 실험군별 측정시기에 따른 변화를 일표본 대응 T 검정으로 실시한 후 류마티스 관절염 유발 3일째와 비교하여 보면, I군은 유발 14일째(p<.01), 유발 7일째, 21일째, 28일째 (pv.001)에서 호전된 차이가 각각 유의하게 나타났고, II군은 유발 21일째(p<, 01), 7일째, 14일째, 28일째에서 호전된 차이가 각각 유의하게 나타났다(pv.001). 또한, m군은 유발 7일째, 28일째 (p<-01), 14일째, 21일째(pv.
- 3). 실험군별 측정시기에 따른 변화를 일표본 대응 T검정으로 실시한 후 류마티스 관절염 유발 3일째와 비교하여 보면, I 군은 시기별로 호전된 차이가 유의하지 않았으나(p>.05), H군은 유발 28 일째에서 호전된 차이가 유의하게 나타났다(pv.01). 또한, 皿 군은 유발 14일째, 21일째(pv.
- 1). 실험군별 측정시기에 따른 변화를 일표본 대응 T검정으로 실시한 후 류마티스 관절염 유발 3일째와 비교하여 보면, I 군은 유발 14일째 (p<-05), 유발 21일째, 28일째(p<.001)에서 호전된 차이가 각각 유의하게 나타났고, II군은 유발 14일째(p<.05), 21일째(p<, 01), 28 일째(p<.001)에서 호전된 차이가 각각 유의하게 나타났다. 또한, 이군은 유발 21일째(p<.
- 족부의 체적 변화, 관절염 지수 검사, 관절염의 배 측 굴곡과 저 측 굴곡 통증지수에서 류마티스 관절염 유발 28일째에 실험군 I 에 비하여 실험군 Ⅱ, Ⅲ, IV에서 통계적으로 유의한 감소를 확인할 수 있었다(pVOl). 류마티스 관절염의 실험종료 후 슬관절부위의 Safranin O-fast green 염색결과를 관찰하여 조직 학적 인지 수로 표현한 결과, 실험군 I 보다 실험군 n, m, IV에서 염증세포 침윤과 활액막의 과증식(pv.
- 첫 번째로, 족 부종의 체적변화와 관절염 지수에서는 28일째어〕서 통계적으로 유의한 감소를 보였으며(p<01), 실험군 I 과 비교하여 볼 때 시간이 지남에 따라 실험군 Ⅱ, Ⅲ에서 통계적으로 유의한 족부의 염증반응 감소를 확인할 수 있었으며(p<.O5), 실험군 IV에서는 수치상으로 실험군 Ⅱ, Ⅲ보다 더 긍정적인 결과를 보이고 있다. 특히 이러한 염증반응 감소의 결과와 함께 관절염의 배측굴곡 및 저측굴곡 통증지수검사에서는 28일째에 실험군 I 에 비해 실험군 Ⅱ, Ⅲ, IV에서 통계적으로 유의한 통증 반응의 감소를 확인할 수 있었다(pv.
- O5), 실험군 IV에서는 수치상으로 실험군 Ⅱ, Ⅲ보다 더 긍정적인 결과를 보이고 있다. 특히 이러한 염증반응 감소의 결과와 함께 관절염의 배측굴곡 및 저측굴곡 통증지수검사에서는 28일째에 실험군 I 에 비해 실험군 Ⅱ, Ⅲ, IV에서 통계적으로 유의한 통증 반응의 감소를 확인할 수 있었다(pv.01).
후속연구
- 이처럼 수중운동과 우슬추출물이 류마티스 관절염 흰쥐의 염증과 통증반응의 감소에 지대한 영향을 주었고, 결과적으로는 운동 행동학적인 기능수준의 향상을 기대할 수 있으며, 류마티스관절염의 임상 활용에 타당성을 제공할 것으로 사료된다.
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