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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 Ilarvirus 그룹에 속하는 바이러스 중에 우리나라 복숭아 과원에서 검출된 PNRSV isolate의 특성을 조사하고자 초본 및 목본 지표식물을 이용한 생물검정과 세포 내 바이러스입자 존재양식을 관찰하였으며, 특이 프라이머를 디자인하여 RT-PCR에 의해 증폭된 국내 분리주 외피단백질 유전자 특성을 확인하여 기 보고된 분리주와의 유전적 상동성을 비교함으로써 국내 분리주를 동정하였다.
제안 방법
- 충북 음성지역 등 복숭아 주산단지의 과수원에 재식되어 있는 ‘유명’ 등 다양한 품종의 성목을 대상으로 스위스 BIOREBA 사의 항혈청을 이용하여 ELISA 진단법으로 바이러스 감염여부를 스크리닝 하여 PNRSV 감염주를 선발하였다. PNRSV 단독 검출주로부터 잎과 가지 부위를 채취하여 초본 지표식물 및 목본 지표식물을 이용한 생물검정에 활용하였다. 초본 지표 식물 검정에서는 Ilarvirus의 분리기주로 많이 활용되는 C.
- RT-PCR 및 염기서열 분석. 병징을 나타내는 C.
- RT-PCR 증폭조건은 45℃ 45분(1cycle)→94℃ 2분(1 cycle) 처리 후 94℃ 30초→60℃ 1분→68℃ 2분간 40 cycle 처리하였으며 최종적으로 68℃에서 7분 1 cycle 처리한 후 1% Agarose gel 상에서 전기영동하여 ethidium bromide로 염색하여 특이밴드를 확인하였다.
- 국내의 복숭아 과수원 중에 충북 음성지역의 유명 품종에서 약한 모자이크증상 잎으로부터 Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV)를 분리 동정하였다. 지표식물을 이용한 생물검정에서 Cucumis sativus의 접종 자엽에 원형모양의 반점이 관찰되었으며 상엽으로 전이되어 모자이크와 잎기형 증상을 나타내다가 고사하는 것으로 나타났다.
- sativus의 자엽조직에 즙액 접종한 후 접종엽과 상엽의 병징 발현여부를 관찰하였다. 목본 지표식물 검정은 핵과류 바이러스에 대해 감수성 품종으로 보고되어 있는 P. persica GF305 품종의 종자를 이용하여 Fig. 1과 같이 실생묘를 양성한 다음 PNRSV 감염주로부터 채취한 녹색 가지의 눈 부위를 메스로 잘라 접목하였으며 접종 후 2~3개월 동안 지표식물 잎의 병징 발현여부를 조사하였다. 병징 발현이 관찰된 잎은 dip 검경과 ELISA 검정을 통해 PNRSV 감염여부를 확인하였다.
- 1과 같이 실생묘를 양성한 다음 PNRSV 감염주로부터 채취한 녹색 가지의 눈 부위를 메스로 잘라 접목하였으며 접종 후 2~3개월 동안 지표식물 잎의 병징 발현여부를 조사하였다. 병징 발현이 관찰된 잎은 dip 검경과 ELISA 검정을 통해 PNRSV 감염여부를 확인하였다.
- RT-PCR 및 염기서열 분석. 병징을 나타내는 C. sativus 상엽을 절취하여 Qiagen RNeasy Plant kit를 이용, total RNA를 추출하여 PCR 진단에 사용하였다. GenBank database에 공개되어 있는 염기서열정보와 RT-PCR기술 (Spiegel 등, 1996, Hammond 등, 1998)을 참고하여 PNRSV 외피단백질 유전자부분을 기준으로 특이 프라이 머를 Table 1과 같이 디자인하여 RT-PCR에 이용하였다.
- PNRSV 단독 검출주로부터 잎과 가지 부위를 채취하여 초본 지표식물 및 목본 지표식물을 이용한 생물검정에 활용하였다. 초본 지표 식물 검정에서는 Ilarvirus의 분리기주로 많이 활용되는 C. sativus를 포함하여 5종의 지표식물을 이용하였으며 모자이크증상을 보이는 어린 복숭아 잎을 C. sativus의 자엽조직에 즙액 접종한 후 접종엽과 상엽의 병징 발현여부를 관찰하였다. 목본 지표식물 검정은 핵과류 바이러스에 대해 감수성 품종으로 보고되어 있는 P.
대상 데이터
- quinoa에서 systemic mottle 증상 이 나타나는 것으로 보고되어 있어(Fulton, 1970, 1983), 본 연구에서 얻은 결과와 유사하였다. 보통 PNRSV의 유지 증식 기주로서 C. sativus를 사용하는 것으로 보고되 어 있으며(ICTV DB 00.010.0.02.015) 본 연구에서도 시험용 바이러스원을 C. sativus 접종주를 활용하였다.
- 인위접종한 Cucumis sativus 잎조직의 세포 검경에서 parenchyma cells과 plasmodesmata 내에 존재하는 구형 바이러스 입자가 관찰되었다.
- 충북 음성지역 등 복숭아 주산단지의 과수원에 재식되어 있는 ‘유명’ 등 다양한 품종의 성목을 대상으로 스위스 BIOREBA 사의 항혈청을 이용하여 ELISA 진단법으로 바이러스 감염여부를 스크리닝 하여 PNRSV 감염주를 선발하였다.
데이터처리
- RT-PCR 증폭조건은 45℃ 45분(1cycle)→94℃ 2분(1 cycle) 처리 후 94℃ 30초→60℃ 1분→68℃ 2분간 40 cycle 처리하였으며 최종적으로 68℃에서 7분 1 cycle 처리한 후 1% Agarose gel 상에서 전기영동하여 ethidium bromide로 염색하여 특이밴드를 확인하였다. 증폭된 유전자의 염기서열 분석은 ABI Prism 377 Genetic Analyzer를 이용, Bioneer사에 의뢰하여 결과를 획득하였으며 분석된 염기 서열 결과는 DNASTR 프로그램을 이용하여 Genbank에 기 보고된 분리주와의 상동성을 비교하였다.
이론/모형
- sativus 상엽을 절취하여 Qiagen RNeasy Plant kit를 이용, total RNA를 추출하여 PCR 진단에 사용하였다. GenBank database에 공개되어 있는 염기서열정보와 RT-PCR기술 (Spiegel 등, 1996, Hammond 등, 1998)을 참고하여 PNRSV 외피단백질 유전자부분을 기준으로 특이 프라이 머를 Table 1과 같이 디자인하여 RT-PCR에 이용하였다. RT-PCR 증폭조건은 45℃ 45분(1cycle)→94℃ 2분(1 cycle) 처리 후 94℃ 30초→60℃ 1분→68℃ 2분간 40 cycle 처리하였으며 최종적으로 68℃에서 7분 1 cycle 처리한 후 1% Agarose gel 상에서 전기영동하여 ethidium bromide로 염색하여 특이밴드를 확인하였다.
성능/효과
- C. sativus 이병 세포에 대한 TEM 검경에서 엽육 조직 세포내에 구형의 바이러스 입자가 존재하는 것을 관찰할 수 있었으며 Plasmodesmata 내 바이러스 입자가 존재하는 형태도 확인할 수 있었다(Fig. 3). 이는 바이러스 입자 형태가 구형인 바이러스 종인 Nepovirus, Comovirus, Fabavirus, Ilarvirus 등이 공통적으로 가지는 세포병리학적 특성으로 보고되어 있다(Martelli, 1980).
- 2). C. sativus의 접종엽에 나타난 국부 병반을 채취하여 재 접종한 다음 2차 병징이 발현된 잎의 혈청학적 반응을 조사하기 위해 잎을 절취하여 PNRSV, Prune dwarf virus (PDV) 및 Cherry leafroll virus (CLRV) 등 핵과류에 감염 가능한 구형 바이러스 3종(Alan 등, 1995)의 항혈청에 대해 ELISA 진단한 결과, C. sativus와 P. persica GF305품종 모두 PDV와 CLRV 항혈청에 대해 서는 반응이 나타나지 않은 반면 PNRSV에 대해서만 양성반응을 보여 PNRSV 감염에 의한 병징인 것으로 확인할 수 있었다.
- PNRSV 외피단백질 유전자를 특이적으로 증폭하도록 디자인한 Table 1의 프라이머를 이용하여 C. sativus 접종 엽을 RT-PCR한 결과 약 675bp 크기의 특이적인 증폭산 물을 얻을 수 있었다(Fig. 4).
- PNRSV의 외피단백질 유전자 분석을 위해 RT-PCR 진단 프라이머와 조건을 설정하고 분석한 결과 675bp 위치에서 특이적으로 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 또한 증 폭산물을 회수하여 염기서열 분석한 결과 기 보고된 4개의 PNRSV isolate와 93.
- 결론적으로 복숭아 과수원에서 분리한 바이러스주의 생물적 특성과 유전자 분석결과를 종합하여 Ilarvirus에 속하는 PNRSV인 것으로 최종 동정하였다.
- PNRSV의 외피단백질 유전자 분석을 위해 RT-PCR 진단 프라이머와 조건을 설정하고 분석한 결과 675bp 위치에서 특이적으로 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 또한 증 폭산물을 회수하여 염기서열 분석한 결과 기 보고된 4개의 PNRSV isolate와 93.9~94.7%의 유전적 상동성을 보였다.
- 충북 음성 등 복숭아 주요 재배과원의 성목을 대상으로 ELISA법으로 PNRSV 감염여부를 스크리닝 한 결과 음성지역 농가의 ‘유명’ 품종의 약한 모자이크증상의 잎에서 PNRSV 양성반응이 확인되었다. 모자이크 증상을 나타내는 잎을 Table 1에서와 같이 Chnopodium quinoa 등 5종의 초본 지표식물에 접종하여 반응을 조사한 결과, C. quinoa와 C. amaranticolor의 상엽에 mottle 병징이 각각 관찰되었으며 C. sativus의 접종 자엽에 ringspot와 상엽에 mosaic 병징이 나타나다가 잎이 기형화되고 선단부 의 생육이 불량해지면서 고사되는 것을 관찰할 수 있었다(Table 2). 이러한 지표식물의 반응은 Salem 등(2004)이 보고한 결과와 일치하였다.
- 증폭된 특이산물을 회수하여 염기서열 분석을 수행하고 NCBI에 공개된 외국의 기보고 분리주 4개와 유전적 상동성을 비교한 결과 약 93.9~94.7%의 상동성을 나타내는 것으로 확인되었고(자료 생략), 이에 대한 phylogenetic tree를 작성하였다(Fig. 5).
- 국내의 복숭아 과수원 중에 충북 음성지역의 유명 품종에서 약한 모자이크증상 잎으로부터 Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV)를 분리 동정하였다. 지표식물을 이용한 생물검정에서 Cucumis sativus의 접종 자엽에 원형모양의 반점이 관찰되었으며 상엽으로 전이되어 모자이크와 잎기형 증상을 나타내다가 고사하는 것으로 나타났다. 접종한 Chenopodium quinoa 접종엽과 상엽에도 모틀증상을 나타내었다.
- 충북 음성 등 복숭아 주요 재배과원의 성목을 대상으로 ELISA법으로 PNRSV 감염여부를 스크리닝 한 결과 음성지역 농가의 ‘유명’ 품종의 약한 모자이크증상의 잎에서 PNRSV 양성반응이 확인되었다.
후속연구
- 본 논문은 PNRSV에 대한 국내 첫 보고로서 생물검정 결과와 RT-PCR 진단 기술은 금후 전국적인 발생 모니터링과 피해구명에 관한 연구의 기반기술로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
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