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문제 정의
- 본 논문에서는 흰가루병균에 기생하는 Ampelomyces의 기주별 분포를 조사하고, 분리된 균주의 생리적 특성 조사와 Ampelomyces가 식물에 병을 일으키는지 여부를 조사하였다. 또한 실험에 사용한 대표 균주 BSLAH16의 rDNA ITS 영역의 PCR 증폭 및 염기서열을 분석하여 동정하였다.
제안 방법
- 식물에 대한 병원성. Ampelomyces가 분비하는 효소 또는 기타 물질에 대한 식물체의 이상을 조사하기 위해 흰가루병에 걸리지 않은 배롱나무와 으름덩굴, 쥬키니호박잎에 분리된 Ampelomyces를 분무 접종하여, 식물체의 반응 여부를 관찰하였다.
- 채집 후 습실 처리로 시료가 마르지 않게 하고, 병반을 해부현미경으로 관찰하였다. Ampelomyces의 병자각이 존재하는 부위를 광학 현미경으로 관찰하여 Ampelomyces의 유무를 확인하였다.
- 길항력 검정. JSG1-1, JSG4-1, JSG4-4, JSG6-1, JSG6-3, JSG8-4, Na2, Na7-1, BSLAH06, BSLAH16, BSLAH06-4, BSLAH31, BSLAH32 균주로 항균테스트를 하였다. 병원균으로 벼 이삭마름병균에서 분리한 균주 Fusarium.
- PCR 조건은 94℃에서 10분간 predenaturation한 후, 94℃에서 1분간 denaturation, 55℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분 30초간 polymerization 을 35회 반복하고, 72℃에서 7분간 유지하였다. PCR 증폭산물은 PCR purification kit(Core-oneTM, Korea)를 이용하여 정제한 후 염기서열 분석에 사용하였다. 염기서열분석은 BioDye Terminater Ver.
- rDNA ITS 영역의 염기서열 분석에 사용된 균주 BSLAH16은 MEA에서 3주 동안 배양하였으며, 배지위에 형성된 균총에서 genomic DNA를 분리하였다. gDNA는 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 이용하여 분리하였으며, ITS1, 4 primer(White 등, 1990)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 10분간 predenaturation한 후, 94℃에서 1분간 denaturation, 55℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분 30초간 polymerization 을 35회 반복하고, 72℃에서 7분간 유지하였다.
- rDNA ITS 영역 PCR 증폭 및 염기서열 분석. rDNA ITS 영역의 염기서열 분석에 사용된 균주 BSLAH16은 MEA에서 3주 동안 배양하였으며, 배지위에 형성된 균총에서 genomic DNA를 분리하였다.
- 또한 sequence distance는 Tamura-Nei parameter model로 계산하였으며, Bootstrap analysis는 1,000 반복으로 수행하였다(Hong 등, 2008). 균주 BSLAH16의 염기를 NCBI(National Center for Biotechnology Information) BLAST search를 통해 GenBank에서 유사한 염기서열을 비교하였다(Kim 등, 2008).
- 본 논문에서는 흰가루병균에 기생하는 Ampelomyces의 기주별 분포를 조사하고, 분리된 균주의 생리적 특성 조사와 Ampelomyces가 식물에 병을 일으키는지 여부를 조사하였다. 또한 실험에 사용한 대표 균주 BSLAH16의 rDNA ITS 영역의 PCR 증폭 및 염기서열을 분석하여 동정하였다.
- 삼투압과 포자발아. 물한천배지(WA)에 삼투압 조절 시료로서 NaCl과 Sucrose의 농도를 각각 0.05M, 0.15M, 0.30M, 0.45M로 조절하여 배지를 만들었다. 균주의 병자 각을 떼어내어 MEA배지 위에 치상 후, 유리봉으로 도말하여 28℃ 항온기에서 배양하며 6시간 간격으로 관찰하였다.
- 항생제(tetracycline)를 첨가한 Malt extract 평판배지에 병자각을 각각 1개씩 올려놓고 유리봉으로 도말하여 병 포자 유출을 유도하였다. 배양 24시간 후부터 광학현미경으로 관찰하여 포자가 발아하는 부위를 다른 배지위에 치상하여 단포자 분리 하였다.
- nicotianae(PNI02)를 사용하였다. 분리균주를 선접종하고 5일 후 병원균을 대치 배양한 처리구와 동시접종과의 항균효과를 비교하였다.
- 배지는 Potato dextrose agar (PDA), Oatmeal agar(OMA), M2 agar(M2A), A&H agar(AHA)(Mhaskar, 1974), Malt extract agar(MEA), Yeast extract agar(YEA), Barley extract agar(BEA), Race agar(RA), Wheat bran extract agar(WBA), Nutrient agar(NA) 등을 이용하였다. 분리된 Ampelomyces 균사 선단을 직경 4 mm cork-borer로 잘라내고 각 배지 위에 치상하여 28℃ 항온배양기 배양하면서 35일간 균사의 생육을 관찰하였다.
- PCR 증폭산물은 PCR purification kit(Core-oneTM, Korea)를 이용하여 정제한 후 염기서열 분석에 사용하였다. 염기서열분석은 BioDye Terminater Ver. 1.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 ABI 3130 autosequencer(Yun 등, 2007)에서 수행하였다.
- Ampelomyces가 흰가루 병균에 중복기생을 하고 있는지의 여부는 육안으로 판단하기가 불가능하여 이병개체를 채집하였다. 채집 후 습실 처리로 시료가 마르지 않게 하고, 병반을 해부현미경으로 관찰하였다. Ampelomyces의 병자각이 존재하는 부위를 광학 현미경으로 관찰하여 Ampelomyces의 유무를 확인하였다.
- 5~5)으로 관찰하면서 미침으로 Ampelomyces의 병자각을 하나씩 떼어내었다. 항생제(tetracycline)를 첨가한 Malt extract 평판배지에 병자각을 각각 1개씩 올려놓고 유리봉으로 도말하여 병 포자 유출을 유도하였다. 배양 24시간 후부터 광학현미경으로 관찰하여 포자가 발아하는 부위를 다른 배지위에 치상하여 단포자 분리 하였다.
- 해부현미경(10×0.5~5)으로 관찰하면서 미침으로 Ampelomyces의 병자각을 하나씩 떼어내었다.
대상 데이터
- 2005년 6월부터 2008년 5월까지 전북 장수, 전주 및 전남 장성 등에서 흰가루병에 걸린 44종의 기주식물을 채집하였으며, 12종의 식물에서 Ampelomyces의 중복기생이 확인되었다. Ampelomyces의 병자각의 형태는 대부분이 원형 또는 타원형이었으며, 같은 기주식물에서도 그 크기가 다양했고, 병자각의 색은 옅은 갈색에서 진한 갈색이었다.
- Ampelomyces의 분포 조사. 2005년 6월부터 2008년 5월까지 주로 전북 장수, 진안, 전주, 전남 장성 등에서 흰가루병 발생여부를 조사하였다. Ampelomyces가 흰가루 병균에 중복기생을 하고 있는지의 여부는 육안으로 판단하기가 불가능하여 이병개체를 채집하였다.
- 병원균으로 벼 이삭마름병균에서 분리한 균주 Fusarium. graminearum 6001(F.g.6001)과 F. graminearum 6002 (F.g.6002), 아이비 역병균 Phytophthora cinnamoni(PCI01)과 P. nicotianae(PNI02)를 사용하였다. 분리균주를 선접종하고 5일 후 병원균을 대치 배양한 처리구와 동시접종과의 항균효과를 비교하였다.
- rDNA ITS 영역 PCR 증폭 및 염기서열 분석. rDNA ITS 영역의 염기서열 분석에 사용된 균주 BSLAH16은 MEA에서 3주 동안 배양하였으며, 배지위에 형성된 균총에서 genomic DNA를 분리하였다. gDNA는 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 이용하여 분리하였으며, ITS1, 4 primer(White 등, 1990)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
- 배지는 Potato dextrose agar (PDA), Oatmeal agar(OMA), M2 agar(M2A), A&H agar(AHA)(Mhaskar, 1974), Malt extract agar(MEA), Yeast extract agar(YEA), Barley extract agar(BEA), Race agar(RA), Wheat bran extract agar(WBA), Nutrient agar(NA) 등을 이용하였다.
- Ampelomyces의 병자각의 형태는 대부분이 원형 또는 타원형이었으며, 같은 기주식물에서도 그 크기가 다양했고, 병자각의 색은 옅은 갈색에서 진한 갈색이었다. 봉선화, 고들빼기, 쥬키니호박, 삼잎국화 로부터 Ampelomyces 균을 분리하였고, 이 중 실험에 적합한 Ampelomyces 균주 12개를 최종 선발하였다. 선발된 12균주의 배양적 특성 및 영양요구를 조사한 결과 Malt extract agar에서 가장 생육이 좋았다.
- Ampelomyces의 분포 조사 및 분리. 전라북도 및 전라남도 일대에서 흰가루병에 걸린 총 44종의 식물을 채집하였으며, 이 중 Ampelomyces가 기생하고 있는 식물은 12종이었다(Table 1). Ampelomyces 병자각의 형태는 대부분이 구형이었다.
이론/모형
- rDNA ITS 영역에 대한 phylogenetic tree는 MEGA v4.0(Saitou and Nei, 1987; Tamura 등, 2007)에서 neighborjoining method로 얻은 data를 기초로 분석하였다. 또한 sequence distance는 Tamura-Nei parameter model로 계산하였으며, Bootstrap analysis는 1,000 반복으로 수행하였다(Hong 등, 2008).
- 0(Saitou and Nei, 1987; Tamura 등, 2007)에서 neighborjoining method로 얻은 data를 기초로 분석하였다. 또한 sequence distance는 Tamura-Nei parameter model로 계산하였으며, Bootstrap analysis는 1,000 반복으로 수행하였다(Hong 등, 2008). 균주 BSLAH16의 염기를 NCBI(National Center for Biotechnology Information) BLAST search를 통해 GenBank에서 유사한 염기서열을 비교하였다(Kim 등, 2008).
성능/효과
- 31%로 가장 높았고 포자의 크기 및 균사의 길이가 가장 길었다. 0.30M은 0.15M에 비해 발아율이 심하게 낮아져 대부분의 발아율이 20%미만이었지만, 48시간 이후에는 발아가 많이 되었다(Table 5, Fig. 2) 0.45M에서의 포자의 모양은 구형이었다가 수분이 줄어들어 길쭉해졌고 발아율은 10% 미만이었다. 이에 비해 발아율이 균주에 따라 28~99%로 높았던 0.
- 병자각의 형성은 적었으나 균사의 생장력이 좋은 RA나 BEA 등과 비교했을 때, 병자각 형성시 많은 수분이 필요하다라고 생각된다. 12종의 균주의 생장을 10종류의 배지별로 실험한 결과 MEA에서 Ampelomyces의 균사의 신장과 병자각의 형성량 등 두 가지 모두가 양호 하였다. Mhaskar(1974)는 Ampelomyces 6종의 균주를 여러 배지에서 배양한 결과 M2A에서 가장 생육이 좋았고, PDA에서도 생장이 좋다고 보고하였다.
- g. 6001의 균사가 특히 BSLAH16, Na2, JSGNa6-3, JSGNa8-4 등의 균주와 대치배양 시킨 배지에서 균사의 양이 점차 줄어들고 균의 색이 변하는 것이 육안으로 쉽게 관찰할 수 있었다.
- Ampelomyces 병자각으로 단포자 분리한 결과 봉선화에서 18개, 고들빼기에서 15개, 쥬키니호박에서 8개, 삼잎 국화에서 4개의 균주를 분리하였다(Table 2).
- 15M을 첨가한 배지에서 포자발아율이 가장 높았다. Ampelomyces 분리 균의 길항 효과를 실험한 결과 다른 식물 병원균에 대한 항균효과가 있었다. 분리한 균주는 식물체에 이상이 생기거나 병이 발생하지 않아서 Ampelomyces는 식물에 병원성을 가지고 있지 않다는 사실을 알 수 있었다.
- 2005년 6월부터 2008년 5월까지 전북 장수, 전주 및 전남 장성 등에서 흰가루병에 걸린 44종의 기주식물을 채집하였으며, 12종의 식물에서 Ampelomyces의 중복기생이 확인되었다. Ampelomyces의 병자각의 형태는 대부분이 원형 또는 타원형이었으며, 같은 기주식물에서도 그 크기가 다양했고, 병자각의 색은 옅은 갈색에서 진한 갈색이었다. 봉선화, 고들빼기, 쥬키니호박, 삼잎국화 로부터 Ampelomyces 균을 분리하였고, 이 중 실험에 적합한 Ampelomyces 균주 12개를 최종 선발하였다.
- Ampelomyces sp. BSLAH16 균주와 GenBank를 통해 기존에 등록된 sequence와 3종 17균주가 비교 분석되었다. Ampelomyces sp.
- Ampelomyces sp. BSLAH16 균주의 rDNA ITS를 ITS1, 4 primer로 증폭된 PCR 산물의 크기는 570 bp이었으며, DNASTAR program에 의해 정렬된 염기는 449개이었다. ITS 영역에 대한 염기서열의 상동성을 비교 분석한 결과 Ampelomyces sp.
- Ampelomyces 분리균주를 병원균보다 5일 먼저 접종한 배지는 배양 3일 후 저지원 현상이 미약하게 나타나기 시작했다. F. graminearum 균주들은 생장속도가 Ampelomyces에 비해 매우 빠른 편이었지만 중복기생 균주를 먼저 접종하면 F. graminearum 균주들의 생장 속도가 동시 접종에 비해 현저하게 낮아졌으며, 균주 Na2, BSLAH06, BSLAH16에서는 F. graminearum 균주 및 Phytopthora 균주의 생육을 억제하는 현상이 뚜렷하게 관찰되었다. 특히 PCI 01은 Ampelomyces 분리균주에 의해 생육이 저지되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig.
- quisqualis 또는 Ampelomyces sp.로 동정된 DQ490748, DQ490749, DQ490750, DQ490751 균주와 100% 상동성을 보였다(Table 6). 따라서 rDNA ITS 영역에 대한 염기 서열 분석결과를 바탕으로 Ampelomyces sp.
- 실험균주 포자는 WA에 NaCl과 sucrose의 농도를 조절한 배지에서 배양 16시간 후부터 발아되기 시작하였다. 배양 24시간 후 발아율을 측정했을 때 0.15M에서 발아율이 평균 67.31%로 가장 높았고 포자의 크기 및 균사의 길이가 가장 길었다. 0.
- 배지의 종류에 따른 균의 생육. 배지의 종류에 따라 Ampelomyces의 균사생장과 병자각 형성이 다르게 나타났는데, PDA, NA, YEA에서 많은 병자각이 형성되었다(Table 3). YEA는 병자각 형성이 많고 균사의 생장이 좋았으나, 14일 후에 배지 표면이 갈라지기 시작했다.
- Ampelomyces 분리 균의 길항 효과를 실험한 결과 다른 식물 병원균에 대한 항균효과가 있었다. 분리한 균주는 식물체에 이상이 생기거나 병이 발생하지 않아서 Ampelomyces는 식물에 병원성을 가지고 있지 않다는 사실을 알 수 있었다. 본 실험에 주로 사용된 균주 BSLAH16의 rDNA ITS 영역에 대한 염기서열을 분석한 결과 A.
- 선발된 12균주의 배양적 특성 및 영양요구를 조사한 결과 Malt extract agar에서 가장 생육이 좋았다. 삼투압이 Ampelomyces의 포자발아에 미치는 영향에 대해 조사한 결과 Czapek dox agar에 질소원인 NaCl 0.15M을 첨가한 배지에서 포자발아율이 가장 높았다. Ampelomyces 분리 균의 길항 효과를 실험한 결과 다른 식물 병원균에 대한 항균효과가 있었다.
- 봉선화, 고들빼기, 쥬키니호박, 삼잎국화 로부터 Ampelomyces 균을 분리하였고, 이 중 실험에 적합한 Ampelomyces 균주 12개를 최종 선발하였다. 선발된 12균주의 배양적 특성 및 영양요구를 조사한 결과 Malt extract agar에서 가장 생육이 좋았다. 삼투압이 Ampelomyces의 포자발아에 미치는 영향에 대해 조사한 결과 Czapek dox agar에 질소원인 NaCl 0.
- 식물에 대한 병원성. 식물에 대한 병원성을 조사하기 위해 Ampelomyces를 건전한 식물 3종에 분무 접종한 결과 배롱나무와 으름덩굴, 쥬키니호박 잎에 이상이 생기거나 병이 발생하지 않았다. 따라서 분리된 Ampelomyces는 식물에 병원성을 가지고 있지 않기 때문에 생물방제제로서 가능성이 높다고 생각한다.
- 길항력 검정. 여러 식물 병원성 균류와 Ampelomyces 분리균주를 동시접종한 결과 배양 5일 후부터 PCI 01, PNI 02 균주와 대치 배양한 배지에서 약한 저지원 현상을 관찰할 수 있었다. 균주 F.
- 포자의 모양 변화는 농도가 높아짐에 따른 단수한 삼투현상에 기인한 것으로 생각된다. 이 결과로 보아 Ampelomyces의 최적 삼투압 농도 범위는 NaCl 1.2~3.7 기압이었다. Sasaki와 Kobayashi(1976)가 Monochaetia 포자로 실험한 결과 두 성분을 0.
- 45M에서의 포자의 모양은 구형이었다가 수분이 줄어들어 길쭉해졌고 발아율은 10% 미만이었다. 이에 비해 발아율이 균주에 따라 28~99%로 높았던 0.05M과 0.15M에서 포자 모양은 더 구형으로 변해 있었다. 포자의 모양 변화는 농도가 높아짐에 따른 단수한 삼투현상에 기인한 것으로 생각된다.
- graminearum 균주 및 Phytopthora 균주의 생육을 억제하는 현상이 뚜렷하게 관찰되었다. 특히 PCI 01은 Ampelomyces 분리균주에 의해 생육이 저지되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3).
후속연구
- 채집된 흰가루병 이병개체 중 기주가 보고되지 않은 식물은 긴산꼬리풀, 꽈리, 쥬키니호박, 중국단풍, 도둑놈의 갈고리, 세잎꿩의비름, 큰산꼬리풀, 모감주나무 등이 있다. 따라서 향후 이들 기주에 대한 흰가루병균의 동정이 요구된다.
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