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문제 정의
- 따라서 최근 토양재배 토마토에서 작은뿌리파리에 의한 피해가 급속히 증가하는 원인이 작은뿌리파리와 토양 전염성 병원균인 F. oxysporum의 복합 피해에서 기인된 것인지를 구명하고자, 작은뿌리파리의 유충, 번데기, 성충에 의한 F. oxysporum의 전반 유무를 밝혀 복합 피해의 기초자료를 제공하고자 본 연구를 수행하게 되었다.
제안 방법
- impatiens의 유충을 오이의 뿌리 주변에서 분리한 잘록병을 일으키는 Pythium spp.(P. aphanidermatum, P. acanthicum 및 P. oligandrum)가 자라고 있던 V8 배지에 넣고 1-14일 동안 균사체를 먹인 후 본 실험에서와 같이 염색 과정을 거쳐 입체현미경으로 유충의 체내에 존재하는 분생포자의 사진을 촬영하여 유충에 의한 전반을 증명하였다. 이와같이 뿌리파리류의 유충은 토양 중에 서식할 때 토양 전염성 병원균을 체내로 섭식하고, 뿌리조직을 뚫고 뿌리 속으로 침입하여 조직을 갉아먹는 과정에서 소화관내의 토양 전염성 병원균이 뿌리조직으로 방출되면서 피해를 더욱 가중시키는 것으로 보고되어 있다(Gardiner 등, 1990).
- oxysporum 전반 유무 조사. F. oxysoporum 균주를 PDA 배지상에 24℃에서 7일간 배양시킨 후 작은뿌리파리의 유충, 번데기, 성충을 각각 다른 PDA 배지상에 접종하였다. 그리고 2일 동안 먹거나 접촉하게 한 후 유충과 번데기는 꺼집어내어 0.
- REMI 형질전환은 Yun 등(1998)의 방법을 이용하였다. REMI를 수행하기 위하여 Fusarium oxysporum의 균사로부터 적당량의 원형질체를 얻은 후, 원형질체의 삼투압조절제로는 1 M NH4Cl 용액, 세포벽분해효소로는 driselase, 재생배지로는 1M sucrose 가 첨가된 완전배지를 사용하였다. 여기에 분자량 3,350의 PEG(Polyethyleneglycol)를 첨가한 후 곰팡이 재생배지에 옮겨 1일간 30℃에서 키워 원형질체의 재생을 유도하였다.
- oxysoporum 균주를 PDA 배지상에 24℃에서 7일간 배양시킨 후 작은뿌리파리의 유충, 번데기, 성충을 각각 다른 PDA 배지상에 접종하였다. 그리고 2일 동안 먹거나 접촉하게 한 후 유충과 번데기는 꺼집어내어 0.6% sodium hypochlorite와 0.1% Triton-X 100의 혼합액에서 1분 동안 표면 살균을 하였다. 살균한 유충과 번데기는 마쇄하여 현탁액을 만들어 깨끗한 PDA 배지에 치상하였으며, 3일 후 생성된 colony 수를 조사하였다.
- 1% Triton-X 100의 혼합액에서 1분 동안 표면 살균을 하였다. 살균한 유충과 번데기는 마쇄하여 현탁액을 만들어 깨끗한 PDA 배지에 치상하였으며, 3일 후 생성된 colony 수를 조사하였다. 성충은 살아있는 개체를 개끗한 PDA 배지에 옮긴 후 3일 동안 생성되는 colony 수를 조사하였다.
- 살균한 유충과 번데기는 마쇄하여 현탁액을 만들어 깨끗한 PDA 배지에 치상하였으며, 3일 후 생성된 colony 수를 조사하였다. 성충은 살아있는 개체를 개끗한 PDA 배지에 옮긴 후 3일 동안 생성되는 colony 수를 조사하였다. 실험은 작은뿌리파리의 령기별로 각각 10마리씩을 1반복으로 처리하여 3반복으로 수행하였다.
- 성충은 살아있는 개체를 개끗한 PDA 배지에 옮긴 후 3일 동안 생성되는 colony 수를 조사하였다. 실험은 작은뿌리파리의 령기별로 각각 10마리씩을 1반복으로 처리하여 3반복으로 수행하였다.
- REMI를 수행하기 위하여 Fusarium oxysporum의 균사로부터 적당량의 원형질체를 얻은 후, 원형질체의 삼투압조절제로는 1 M NH4Cl 용액, 세포벽분해효소로는 driselase, 재생배지로는 1M sucrose 가 첨가된 완전배지를 사용하였다. 여기에 분자량 3,350의 PEG(Polyethyleneglycol)를 첨가한 후 곰팡이 재생배지에 옮겨 1일간 30℃에서 키워 원형질체의 재생을 유도하였다. 그 다음 재생배지 표면에 hygromycin B가 포함된 agar 용액을 부은 후 곰팡이 형질전환체가 형성될 때까지 24℃에서 키웠다.
- oxysporum 섭식 유무 조사. 작은뿌리파리 유충에 의한 토양 전염성 병원균 F. oxysporum 균의 섭식 유무를 관찰하기 위하여 형광발현 형질전환 곰팡이를 제작하였다. 토마토에서 분리한 Fusarium oxysporum 균주에 REMI 방법을 이용하여 형광 발현 유전자를 삽입 하였다.
- 그 다음 재생배지 표면에 hygromycin B가 포함된 agar 용액을 부은 후 곰팡이 형질전환체가 형성될 때까지 24℃에서 키웠다. 형성된 형질전환체에 벡터가 삽입되었는지를 확인하기 위해서 입체현미경(Universal Research Stereo-microscope, Carl Zeiss Discovery V12)을 이용하여 형질전환체의 GFP 유전자 발현 양상을 관찰한 후 형광을 띤 돌연변이체를 선발하고 사진을 촬영하였다.
대상 데이터
- 토마토에서 분리한 Fusarium oxysporum 균주에 REMI 방법을 이용하여 형광 발현 유전자를 삽입 하였다. GFP 유전자가 포함된 벡터 pIGPAPA는 서울대학교 농생명공학부로부터 분양받아 사용하였다. pIGPAPA 는 Neurospora crass의 isocitrate lyase(ICL) 유전자의 promoter에 의해 조절되는 GFP 유전자와 Aspergillus nidulans TrpC promoter에 융합된 hygromycin B 저항성 유전자(hygB)를 포함하고 있다.
- 공시균주. 국내의 토마토 재배지에서 분리한 시들음병균 Fusarium oxysporum을 이용하였다. 시들음병균은 서울대학교 농생명공학부로부터 분양받아 사용하였다.
- 국내의 토마토 재배지에서 분리한 시들음병균 Fusarium oxysporum을 이용하였다. 시들음병균은 서울대학교 농생명공학부로부터 분양받아 사용하였다. 분양받은 균주는 PDA 배지상에 24℃에서 7일간 배양시킨 후 이용하였다.
- 실험에 사용된 작은뿌리파리 유충과 성충은 Kim 등(2003)의 방법에 따라 potato dextrose agar(PDA) 배지에서 15~20일 동안 배양한 원형느타리버섯(Pleurotus ostreatus)이 들어 있는 87Φ×15 mm 페트리 디쉬에 30개체를 넣어 25±2℃ 항온기에 보관하면서 누대사육하였다.
- 페트리디쉬내의 작은뿌리파리 개체가 증가 하여 먹이가 부족할 경우 새로 배양된 배지로 유충과 성충을 옮겨가면서 개체수를 늘렸다. 실험에 사용된 작은뿌리파리 유충과 성충은 누대 사육한 2세대 이후의 개체를 이용하였다.
이론/모형
- pIGPAPA 는 Neurospora crass의 isocitrate lyase(ICL) 유전자의 promoter에 의해 조절되는 GFP 유전자와 Aspergillus nidulans TrpC promoter에 융합된 hygromycin B 저항성 유전자(hygB)를 포함하고 있다. REMI 형질전환은 Yun 등(1998)의 방법을 이용하였다. REMI를 수행하기 위하여 Fusarium oxysporum의 균사로부터 적당량의 원형질체를 얻은 후, 원형질체의 삼투압조절제로는 1 M NH4Cl 용액, 세포벽분해효소로는 driselase, 재생배지로는 1M sucrose 가 첨가된 완전배지를 사용하였다.
- oxysporum 균의 섭식 유무를 관찰하기 위하여 형광발현 형질전환 곰팡이를 제작하였다. 토마토에서 분리한 Fusarium oxysporum 균주에 REMI 방법을 이용하여 형광 발현 유전자를 삽입 하였다. GFP 유전자가 포함된 벡터 pIGPAPA는 서울대학교 농생명공학부로부터 분양받아 사용하였다.
성능/효과
- oxysporum 전반과 섭식 유무. PDA 배지상에서 작은뿌리파리 유충, 번데기 및 성충에 의한 F. oxysporum 균의 전반유무를 조사한 결과 유충에서는 18.0개, 성충에서는 6.7개의 colony가 형성되어 균을 섭식 혹은 몸체에 묻어 전반되는 것으로 밝혀졌다(Fig. 1). 그러나 번데기는 F.
- PDA 배지상에서 작은뿌리파리 유충과 성충은 토양 전염성 병원균인 Fusarium oxysporum을 전반하였으며, 성충에 비해 유충의 전반이 높았다. 작은뿌리파리 유충은 F.
- 그러나 2008년 8월 충주의 토마토 토양재배 온실에서 작은뿌리파리에 의해 50% 이상의 피해를 입은 민원이 제기되었다. 또한 전남 화순, 담양에서도 육안 및 작물체를 채취하여 조사한 결과 토마토 식물체의 대부분에서 작은뿌리파리 유충과 시들음병(Fusarium oxysporum)이 분리되었다.
- 이상의 결과들로 미루어보아 작은뿌리파리는 시설원예 작물 재배지에서 연중 발생하고 시기에 관계없이 령기가 다양하게 발생하기 때문에 토양중에 전염성 병원균이 분포하는 곳이면 유충과 성충에 의해 병원균이 전반됨과 동시에 직접적인 피해도 유발시켜 작물체의 피해를 점진적 혹은 급속히 증가시킬 수 있는 중요한 토양서식성 해충이다. 또한 작은뿌리파리가 속해 있는 검정날개버섯파리과의 대부분의 종들이 균식성임을 감안한다면 작물체의 뿌리 주위에 분포하는 토양 전염성 병원균의 섭식과 전반이 자연스럽게 이루어질 수 있을 것으로 생각된다.
- 작은뿌리파리 유충의 전반에 대한 명확한 원인을 구명하기 위하여 형광발현 형질전환 F. oxysporum 균을 제작 하여 유충에 먹이고 입체현미경으로 형질전환체의 GFP 유전자 발현 양상을 촬영한 결과 유충의 소화관을 따라 F. oxysporum 균이 분포하고 있음을 밝혀냈다(Fig. 2). Gardiner 등(1990)도 B.
후속연구
- 또한 작은뿌리파리가 속해 있는 검정날개버섯파리과의 대부분의 종들이 균식성임을 감안한다면 작물체의 뿌리 주위에 분포하는 토양 전염성 병원균의 섭식과 전반이 자연스럽게 이루어질 수 있을 것으로 생각된다. 따라서 국내의 연작 시설재배 토마토와 기타 과채류 재배지에서는 작은뿌리파리와 F. oxysporum에 의하여 작물의 생산성 손실이 우려되므로 작물재배 기간중 작은뿌리파리와 F. oxysporum의 발생유무에 관심을 기울여 피해의 예방 및 방제에 만전을 기해야 하겠다.
- 이상의 결과들로 미루어보아 작은뿌리파리는 시설원예 작물 재배지에서 연중 발생하고 시기에 관계없이 령기가 다양하게 발생하기 때문에 토양중에 전염성 병원균이 분포하는 곳이면 유충과 성충에 의해 병원균이 전반됨과 동시에 직접적인 피해도 유발시켜 작물체의 피해를 점진적 혹은 급속히 증가시킬 수 있는 중요한 토양서식성 해충이다. 또한 작은뿌리파리가 속해 있는 검정날개버섯파리과의 대부분의 종들이 균식성임을 감안한다면 작물체의 뿌리 주위에 분포하는 토양 전염성 병원균의 섭식과 전반이 자연스럽게 이루어질 수 있을 것으로 생각된다. 따라서 국내의 연작 시설재배 토마토와 기타 과채류 재배지에서는 작은뿌리파리와 F.
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