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문제 정의
- 효소전환을 통해 글루코사이드(glycosides)를 aglycones로 전환하여 생물활성을 증가시키는 방법에 대해 보고된 예들이 있다[12, 16, 17], 따라서 본 연구에서는 펙틴네 이즈 효소뿐 만 아니라 0ucosidase를 다량 함유하고 FD/로부터 식품용으로 안전성을 인정받아 오렌지쥬스 청징화등 식품용으로 널리 사용중인 효소인 Novozyme사의 Pectinex를 사용하여 대횡뿌리 (rhubarb root)로 부터 추출한 rhapontin을 가수분해한 후 생성된 물질의 분자량 및 구조를 분석하여 rhapontigenin임을 확인하였다. 제조된 rhapontigenin과 rhapontin에 대한 tyrosinase 저해활성 측정 및 tyrosinase 저해 활성 기작에 대하여 검토하였다.
제안 방법
- 확인하였다. 제조된 rhapontigenin과 rhapontin에 대한 tyrosinase 저해활성 측정 및 tyrosinase 저해 활성 기작에 대하여 검토하였다. 또한 Streptomyces bikiniensis KCTC 9172를 이용한 멜라닌 생성 억제효과를 비교하였다.
- 제조된 rhapontigenin과 rhapontin에 대한 tyrosinase 저해활성 측정 및 tyrosinase 저해 활성 기작에 대하여 검토하였다. 또한 Streptomyces bikiniensis KCTC 9172를 이용한 멜라닌 생성 억제효과를 비교하였다.
- 반응완료 후 증류수 1500 mL을 첨가하여 냉장실에서 하룻밤 방치하였다. 방치된 반응물을 여과지 (Qualitative filter papers, 110 mm 0, Whatman)를 이용하여 여과한 후 츙수로 침전물을 충분히 세척하였다. 획득된 침전물을 모아 50℃에서 30시간 진공 건조시켜 건조중량 11.
- 대황뿌리로부터 제조된 rhapontin과 이를 효소 가수분해하여 제조한 rhapontigenin의 정량분석은 HPLQLCQ Ad vantage MAX, Thermo Electron, USA)로 수행되었다(Fig. 1). HPLC 분석조건은 다음과 같다: 검출기 PDA detector, 검 출파장 325 nm, 분석 칼럼 Luna-Pak C-18(5 |im, 4.
- Rhapontin으로부터 효소 가수분해에 의해 제조된 rhapon- tigenin의 분자량은 서울대학교 농생명과학 공동기기원의 MALDI-Mass(Vbyager-DE STR Biospectrometry Worksta^ tion, Applied Biosystems Inc., US A)를 사용하여 확인하였다. 분자구조의 확인은 한양대학교의 !H NMR(Varian 400- MR, 500 MHz, Varian Inc.
- 주출물의 tyrosinase 저해활성은 Tomita[l이 등을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 반응액은 0.
- Companion, Korea)에서 10분간 반응시켰다. 반응 후 얼음상에서 효소반응을 정지시킨 후 UV-Vis spectrophoto- meter(CE 9020, Cecil Instrument, ENGLAND)를' 이용하여 470nm에서 홉광도를 측정하였다. 추출물은 DMSO, 비교 물질안 hydroquinone, kojic acid 및 ascorbic acid는 증류수로 각각 62.
- 5~l, 000|ig/m의 농도범위로 단계적으로 희석하여 사용하였다. 추출물 대신에 DMSO 0.1 mL을 가하여 control 로 하였고, 비교물질 대신에 증류수 0.1 m을 가하여 비교 물질의 control로 하였다. 또한 tyrosinase 대신 0.
- 동일한 조건 하에서 수행되었다. 단, L-tyrosine 의 농도는 각각 0.25, 0.5, 1, 1.5 mM로 변화시켜 각각의 추출물에 적용하였고, 추출물의 농도도 각각 0, 0.05, 0.1, 0.4 mM로 변화시켜 적용하였다. 1.
- 이때 시료의 농도는 20L내에 125〜 1, 000g이 되도록 하였고, control은 DMSO로 하였다. 배양 후 나타나는 inhibition zone의 크기는 vernier calipers(Digimatic caliper 500482, Mitutoyo Corporation, JAPAN)를 사용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 대황뿌리 (rhubarb root)는 경상북도에서 재배된 것을 수집하여 건조한 건화약품 제품을 사용하였다. Rhapontin로부터 rhapontigenin으로의 효소 전환반응에는 Pectinex(Novozymes, DENMARK)를 사용하였으며, tyro sinase 저해 활성 측정에 사용된 L-tyrosine, mushroom tyro sinase, hydroquinone, kojic acid 및 ascorbic acid는 Sigma (St.
- 사용하였다. Rhapontin로부터 rhapontigenin으로의 효소 전환반응에는 Pectinex(Novozymes, DENMARK)를 사용하였으며, tyro sinase 저해 활성 측정에 사용된 L-tyrosine, mushroom tyro sinase, hydroquinone, kojic acid 및 ascorbic acid는 Sigma (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.
- , US A)를 사용하여 확인하였다. 분자구조의 확인은 한양대학교의 !H NMR(Varian 400- MR, 500 MHz, Varian Inc., USA)을 이용하였다,
- 반응 후 얼음상에서 효소반응을 정지시킨 후 UV-Vis spectrophoto- meter(CE 9020, Cecil Instrument, ENGLAND)를' 이용하여 470nm에서 홉광도를 측정하였다. 추출물은 DMSO, 비교 물질안 hydroquinone, kojic acid 및 ascorbic acid는 증류수로 각각 62.5~l, 000|ig/m의 농도범위로 단계적으로 희석하여 사용하였다. 추출물 대신에 DMSO 0.
- 변형하여 다음과 같이 실험하였다. 멜라닌 생산균주인 Streptomyces bikiniensis KCTC 9172는 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, Daegu, Korea)로부터 확보하였다. 본 균주는 -7(TC에서 동결보관하고 그것을 ISP No.
데이터처리
- 5 mL microtube에 반응액을 첨가하여 25℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 얼음상에서 5 분간 효소반응을 정지시킨 후 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정결과는 Lineweaver-Burk plot을 이용하여 분석하였다.
성능/효과
- 대황으로부터 추출한 rhapontin을 산업용 효소로 가수분해하여 rhapontigenin^- 제조하고 kojic acid, hydroquinone 및 ascorbic acid를 비교물질로 한 tyrosinase 활성저해 실험과 S. bikiniensis를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 실험을 통해 미백효과에 대한 가능성을 확인하였다. Rhapontih과 rhapontigenin의 결과를 비교해 보면 rhapontigenin의 경우 tyrosinase 활성저해 및 멜라닌 생성 억제능이 증가하는 것으로 나타났다.
- Rhapontin으로부터 효소 가수분해에 의해 생성된 물질의 분자량 확인을 위하여 MALDLMass 분석을 한 결과, 분자량 258.]로 rhapontigenin^ 분자량과 일치하는 것으로 나타났다(Fig. 2). 또한 생성된 물질의 구조 확인을 위한 'H- NMR 분석결과, 비교물질인 rhapontin에 나타난 4.
- 2). 또한 생성된 물질의 구조 확인을 위한 'H- NMR 분석결과, 비교물질인 rhapontin에 나타난 4.5〜5.5분의 peak가 없어진 것으로 나타났다(Fig. 3). 이는 효소반응에 의해서 배당체를 형성하고 있던 rhapontin의 glucose가 가수분해 되어 aglycori형태의 rhapontigenin이 생성된 것을 알 수 있었다.
- 이는 효소반응에 의해서 배당체를 형성하고 있던 rhapontin의 glucose가 가수분해 되어 aglycori형태의 rhapontigenin이 생성된 것을 알 수 있었다. 생물전환에 의한 rhapontin(30 g)으로부터 rhapontigenin (11.8 g)로의 전환 회수율은 39.3%를 보였다.
- Tyrosinase 저 해 활성 측정 결과, 62.5 g/mL의 rhapontin 및 rhapontigeniii을 처리한 결과 각각 4.5% 및 31.4%의 활성 저해율을 보였고, 비교물질로 사용한 hydroquinone, kojic acid 및 ascorbic acid는 각각 76.4%, 93.3%, 73.7%의 활성저해율을 보였다. 또한 1, 000 Mg/mL에서 rhapontin은 47.
- 7%의 활성저해율을 보였다. 또한 1, 000 Mg/mL에서 rhapontin은 47.1%, rhapontigenin^ 89.0%의 활성 저해율을 보였고, 비교물질인 hydroquinone, kojic acid는 99.8%, ascorbic acid는 98.8% 의 활성 저해율을 보였다(Fig. 4). 초기 저해율이 높은 kojic acid의 경우 농도 중가에 따라 저해율 중가에 큰 변화를 보이지 않은 반면, rhapontigenin^] 경우는 200 |ig/mL 이하에서는 농도 증가에 따라 tyrosinase 활성 저해가 급격히 증가하는 농도 의존적인 저해 양상을 보였다.
- 초기 저해율이 높은 kojic acid의 경우 농도 중가에 따라 저해율 중가에 큰 변화를 보이지 않은 반면, rhapontigenin^] 경우는 200 |ig/mL 이하에서는 농도 증가에 따라 tyrosinase 활성 저해가 급격히 증가하는 농도 의존적인 저해 양상을 보였다. 효소의 활성을 50% 저해하는 농도를 나타내는 IC50 값을 측정한 결과, rhaponti- genin이 rhapontin에 비해 약 7배 높은 저해 활성을 나타내었다 (Table 1).
- Rhapontigeniri의경우 저해활성이 저농도에서는 tyrosinase inhibitor 알려진 kojic acid 및 hydroquinone과 비교중}면 큰 차이를 보였으나, 일정농도(500 gg/mL) 이상이면 저해활성의 차이가 크게 감소함을 알 수 있었다. 반면, rhapontin의 경우에는 농도증가에 의해 저해율이 서서히 증가하였으나 시험에 사용한 범위 내에서는 비교물질 및 rhapontigenin0!) 비해 저해율이 크게낮은 것을 알 수 있었다.
- 반면, rhapontin의 경우에는 농도증가에 의해 저해율이 서서히 증가하였으나 시험에 사용한 범위 내에서는 비교물질 및 rhapontigenin0!) 비해 저해율이 크게낮은 것을 알 수 있었다. 따라서 rhapontin의 배당체를 효소가수분해에 의해 제거함으로써 tyrosinase 저해활성을 월등히 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.
- Tyrosinase inhibition mode에 대한 실험결과 rhapontin과 rhapontigenin 모두 농도가 중가할수록 Vmax 값과 Km 값이 감소하였다(Table 2). 따라서 rhapontin과 rhapontigenin은 모두 mixed-type inhibitiori(혼합형 억제)의 양상을 나타냄을 확인 할 수 있었다(Fig.
- 2). 따라서 rhapontin과 rhapontigenin은 모두 mixed-type inhibitiori(혼합형 억제)의 양상을 나타냄을 확인 할 수 있었다(Fig. 5). 즉, tyrosinase의 active site에 기질과 경쟁적으로 결합하여 멜라닌의 생성을 억제하는 competitive inhibition(경쟁 억제)과 tyrosina의 active site 에 기질이 결합한 후 생성되는 효소-기질 복합체에 결합하여 멜라닌의 생성을 억제하는 uncompetitive inhibition(무경쟁 억제 혼합되어 있는 형태이다.
- Inhibition constant (Ki) 는 경쟁 억제 일 때 Ki 값과 무경쟁 억제 일 때 Kif 값으로 나누어 나타내었다. 이 결과는 농도증가에 따라 저해율이 증가하다 일정농도 이상에서는 저해울이 더 이상 증가하지 않는 포화현상을 보인 rhapontigenin 농도증가에 따른 tyrosinase저해 활성 결과(Fig. 4)와 높은 상관성을 보였다. Streptomyces bikiniensi 이용한 melanin 생성 억제효과 Streptomyces bikiniensis KCTC 9172를 이용한 멜라닌 생성 억제효과를 검토한 결과, rhapontin^)- rhapontigenin 모두 inhibition zone0] 나타났다.
- 4)와 높은 상관성을 보였다. Streptomyces bikiniensi 이용한 melanin 생성 억제효과 Streptomyces bikiniensis KCTC 9172를 이용한 멜라닌 생성 억제효과를 검토한 결과, rhapontin^)- rhapontigenin 모두 inhibition zone0] 나타났다. Rhapontin과 rhapontigenin 을 용해시키는데 사용된 DMSO를 negative control로 이용한 경우에는 inhibition zone 이 나타나지 않았다.
- Rhapontin과 rhapontigenin 을 용해시키는데 사용된 DMSO를 negative control로 이용한 경우에는 inhibition zone 이 나타나지 않았다. Inhibition zone의 크기는 농도 의존적으로 증가 하였으며, rhaponti- genin의 멜라닌 생성 억제효과가 rhapontin보다 뛰어남을 알 수 있었다(Table 3). 이 결과를 tyrosinase inhibition 측정결과와 비교해 보면, 두 결과가 매우 유사하여 높은 상관성을 나타내었다.
- Inhibition zone의 크기는 농도 의존적으로 증가 하였으며, rhaponti- genin의 멜라닌 생성 억제효과가 rhapontin보다 뛰어남을 알 수 있었다(Table 3). 이 결과를 tyrosinase inhibition 측정결과와 비교해 보면, 두 결과가 매우 유사하여 높은 상관성을 나타내었다.
- bikiniensis를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 실험을 통해 미백효과에 대한 가능성을 확인하였다. Rhapontih과 rhapontigenin의 결과를 비교해 보면 rhapontigenin의 경우 tyrosinase 활성저해 및 멜라닌 생성 억제능이 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 rhapontin을 효소 가수분해하여 생성된 rhapontigenin은 미백능이 월등히 증가된 천연 미백 화장품소재로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.
- 위의 결과로 rhapontin과 rhapontigenin 모두 tyrosinase 저해활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. Rhapontigeniri의경우 저해활성이 저농도에서는 tyrosinase inhibitor 알려진 kojic acid 및 hydroquinone과 비교중}면 큰 차이를 보였으나, 일정농도(500 gg/mL) 이상이면 저해활성의 차이가 크게 감소함을 알 수 있었다.
후속연구
- Rhapontih과 rhapontigenin의 결과를 비교해 보면 rhapontigenin의 경우 tyrosinase 활성저해 및 멜라닌 생성 억제능이 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 rhapontin을 효소 가수분해하여 생성된 rhapontigenin은 미백능이 월등히 증가된 천연 미백 화장품소재로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.
- bikiniensis의 증식 또한 억제한다는 의미로 해석할 수 있다. 따라서 rhapontin과 rhapontigenin은 멜라닌 생성 억제효과 뿐만 아니라 항균제로써의 이용가능성도 있을 것으로 기대된다.
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