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문제 정의
- 본 실험에서는 광물성 미네랄의 알레르기성 세포 손상과 산화적 세포손상에 대한 억제효능을 분석하였다 광물성 미네랄이 알레르기성 세포손상에 미 . 치는 영향을 알아보기 위하여 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-4 방출에 미치는 효과를 측정한 결과, 본 실험조건에서 우수한 염증성 사이토카인 분비억제 효능을 보이는 것으로 나타났다.
- 본 연구에서는 Sericite (견운모) 등을 사용하여 제조한 광물성 미네랄이 다양한 세포손상에 미치는 회복 효과를 살펴보았다. 염증성 사이토카인 방출로 인한 세포손상과 활성억제를 측정 lipoxygenase 하였으며 산화 스트레스 및 광용혈 반응으로 세포에 손상을 준 후 광물성 미네랄이 세포손상에 미치는 회복효과를 살펴보았다.
- 본 연구에서는 광물성 미네랄이 알레르기성 세포 손상과 산화적 세포손상에 대해 회복효능을 보이는 지를 다양한 방법으로 살펴보았다. 선행연구에서 광물성 미네랄이 생쥐 기관지 세척액내의 IL-4와 TNF-α의 발현을 억제하였고, 생쥐 폐조직의 조직학적 실험에서 염증관련 세포가 감소되었다고 보고된 바 있다27) .
- cell을 깔아주고 37℃에서 하루 동안 배양하였다. 세포에 산화스트레스를 유발하기 위해서 . 다양한 농도의 H2O2를 처리하고 동시에 광물성 미네랄을 농도별로 처리하여 3 시간 동안 반응시켰다.
제안 방법
- 1 μg/ml DNP-BSA를 0.2 ml 넣고, 37℃ 에서 4 시간 동안 배양한 후 배양 상등액을 모아서 400 x g에서 5 분간 원심분리하고, 상등액을 50 μl 취해서 ELISA용 96 well plate에 넣어서 IL-4의 발현을 측정하였다.
- 12 μM rose bengal 500 μl을 넣고 parafilm으로 입구를 봉한 후 15 분간 광조사하였다.
- Pig kidney cell line인 LLC-PK1 세포에 200 μM의 H2O2를 처리한 후 광물성 미네랄을 처리하였을 때, 산화스트레스에 의한 세포 손상이 회복되는지 살펴보았다.
- 광물성 미네랄의 lipoxygenase 억제 활성을 측정 하기 위하여 0.1 M borate 완충액 (pH 9.0) 에 lipoxygenase (Sigma) 110 Units을 첨가하고 광물성 미네랄 조성물을 0.2%, 0.4%로 연속 희석한 후 100 μl 첨가하였다.
- 광조사시 암상자 안에서 20 W의 형광등과 5 cm 거리 에서 평행이 되게 하였다. 광조사가 끝나면 어두운 곳에 두고 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 알아보기 위하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 세포에 산화스트레스를 유발하기 위해서 . 다양한 농도의 H2O2를 처리하고 동시에 광물성 미네랄을 농도별로 처리하여 3 시간 동안 반응시켰다. 배지를 제거한 후 조제한 MTT 용액을 50 μl/well씩 첨가하여 37℃에서 2 시간 동안 반응시켜 살아있는 세포가 보라색의 불용성 formazan을 형성하게 되면 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 100 μl/well 씩 가하고 잘 교반하여 침전물을 완전히 용해하였다.
- 염증반응 모델 세포인 rat basophilic leukemia cell line인 RBL-2H3 세포에서 광물성 미네랄의 TNF-α 방출 억제 효능을 확인하였다(Fig. 2).
- 본 연구에서는 Sericite (견운모) 등을 사용하여 제조한 광물성 미네랄이 다양한 세포손상에 미치는 회복 효과를 살펴보았다. 염증성 사이토카인 방출로 인한 세포손상과 활성억제를 측정 lipoxygenase 하였으며 산화 스트레스 및 광용혈 반응으로 세포에 손상을 준 후 광물성 미네랄이 세포손상에 미치는 회복효과를 살펴보았다.
- 적혈구에 각각의 시료를 처리한 후 광증감제인 rose bengal (12 μM)을 처리하고 15 분간 광조사후, 용혈 정도를 암소에서의 반응 시간에 따라 투광도로 측정하여 나타내었다.
대상 데이터
- MTT (3-(4,5-dimethylthiozol-2-ly)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)용액은 1XPBS buffer에 5 mg/ml의 MTT를 용해 후 살균된 여과지로 여과하여 불용성 물질을 제거한 것을 사용하였다. 세포수를 3×106 cell/ml로 희석하여 96-well plate에 100 μl씩 분주한 뒤 5% CO2, 95% air가 공급되는 CO2 배양기에서 24시간 배양하였다.
- RBL-2H3 세포와 RGC-5 세포는 10% heat inactivated fetal bovine serum (FBS) (Hyclone)과 1% antibiotics (penicillin-streptomycin) (Hyclone)이 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) (Hyclone)배지를 사용하고, LLC-PK1 세포는 3% heat inactivated fetal bovine serum (FBS) (Hyclone)과 1% antibiotics (penicillin-streptomycin) (Hyclone) 이 첨가된 M199 (Hyclone)배지를 사용하였으며, 5%, CO2, 95% air가 공급되는 37℃ 의 CO2 배양기에서 배양하였다.
- 돼지 신장세포주인 LLC-PK1 세포주와 쥐 망막신 경절 세포인 RGC-5 세포주를 각각 96 well plate wel에 l 1x104 cell을 깔아주고 37℃에서 하루 동안 배양하였다. 세포에 산화스트레스를 유발하기 위해서 .
- 본 연구에 사용한 rat basophilic leukemia cell line인 RBL-2H3세포와 pig kidney cell line LLC-PK1인 세포 및 retinal ganglion cell line인 RGC-5 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받아 실험에 사용하였다. RBL-2H3 세포와 RGC-5 세포는 10% heat inactivated fetal bovine serum (FBS) (Hyclone)과 1% antibiotics (penicillin-streptomycin) (Hyclone)이 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) (Hyclone)배지를 사용하고, LLC-PK1 세포는 3% heat inactivated fetal bovine serum (FBS) (Hyclone)과 1% antibiotics (penicillin-streptomycin) (Hyclone) 이 첨가된 M199 (Hyclone)배지를 사용하였으며, 5%, CO2, 95% air가 공급되는 37℃ 의 CO2 배양기에서 배양하였다.
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1. 실험재료
실험물질로 사용한 광물성 미네랄은 엔티앤비티 (주)에서 제공받아 사용하였고 광물성 미네랄 분말을 phosphate buffered saline (PBS) 용액에 녹여 분산 시켜 사용하였다
. - 결과는 대조군의 살아있는 세포를 100%로 하였을 때의 상대적인 비율로 나타내었다. 양성대조군으로는 항산화력이 우수한 것으로 알려진 astaxanthin을 사용하였다.
데이터처리
- 결과는 독립된 3번의 실험을 통해 Mean ± SEM 으로 나타내었으며, 통계는 SPSS for Windows 12.0프로그램을 이용하였다.
- 세 집단 이상의 유의성은 ANOVA를 사용하여 분석했으며 Duncan's multiple-range test에 따른 사후 검정을 실시하였다.
성능/효과
- 25% 처리에 의하여 동일조건에서 세포증식이 약 20%정도 증가하였다. 1.5 mM H2O2를 처리하여 세포증식이 약 50% 정도 억제되었을 때 광물성 미네랄을 처리한 경우에도 약 5-10% 정도 세포생존이 회복되었다.
- DNPBSA 자극에 의한 염증세포의 TNF-α 방출을 측정하였고 광물성 미네랄을 첨가하였을 때 TNF-α방출이 억제하는 것으로 나타났다.
- 용해된 formazan 산물이 들어있는 각 well의 흡광도는 ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 측정하였다. 결과는 대조군의 살아있는 세포를 100%로 하였을 때의 상대적인 비율로 나타내었다.
- 4는 광물성 미네랄의 농도의존적 lipoxygenase 활성 억제 양상을 보여준다. 광물성 미네랄 0.2%는 lipoxygenase 활성을 약 18% 감소시켰으며 0.4%일 때는 대조군에 비해 약 55%의 활성억제 양상을 보였다.
- 6에서는 망막 신경절 세포인 RGC-5 세포의 산화적 손상에 광물성 미네랄이 미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과 1 mM H2O2를 처리하였을 때 세포손상이 약 30% 정도 진행되었으나 0.25% 광물성 미네랄 처리에 의하여 약 5% 세포손상이 억제되었다. 항산화력이 우수한 것으로 알려진 양성대조군인 astaxanthin 0.
- 그 결과 200 μM H2O2는 대조군 대비 생존하고 있는 세포의 약 20% 정도에 손상을 유발하였으나, 0.25% 광물성 미네랄 처리에 의해 약 5%의 회복 효과를 나타냈다 (Fig. 5).
- 1에서는 rat basophilic leukemia cell line인 RBL-2H3 세포주에 다양한 농도로 희석한 광물성 미네랄을 처리한 후 세포생존율을 측정한 결과를 보여준다. 그 결과 광물성 미네랄 농도가 0.0156%과 0.25% 사이에서는 세포독성이 거의 나타나지 않았다.
- 3에서는 RBL-2H3 세포에서 광물성 미네랄의 IL-4 방출 억제 효능을 확인하였다. 그 결과 광물성 미네랄이 DNP-BSA 자극에 의한 염증세포의 IL-4방출을 억제하는 효과를 나타내었다. 특히 0.
- 그리고 광물성 미네랄은 광증감제인 rose bengal을 처리하여 적혈구에 광용혈을 유도했을 때 현저한 용혈 억제작용을 하였다.
- 또한 염증반응 효소인 lipoxygenase 활성측정 실험에서도 광물성 미네랄이 lipoxygenase 활성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타나 광물성 미네랄이 염증과 관련된 다양한 인자들을 억제하는데 효과가 있는 것으로 보였다. 또한 산화스트레스에 의한 산화적 세포손상에 대하여 광물성 미네랄의 억제효과를 측정한 결과, H2O2로 손상된 LLC-PK1세포에 광물성 미네랄이 세포 생존율을 약 5%정도 증가시켰고, RGC-5세포에서는 세포 생존율이 약 10% 정도 증가하였다. 그리고 광물성 미네랄은 광증감제인 rose bengal을 처리하여 적혈구에 광용혈을 유도했을 때 현저한 용혈 억제작용을 하였다.
- 치는 영향을 알아보기 위하여 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-4 방출에 미치는 효과를 측정한 결과, 본 실험조건에서 우수한 염증성 사이토카인 분비억제 효능을 보이는 것으로 나타났다. 또한 염증반응 효소인 lipoxygenase 활성측정 실험에서도 광물성 미네랄이 lipoxygenase 활성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타나 광물성 미네랄이 염증과 관련된 다양한 인자들을 억제하는데 효과가 있는 것으로 보였다. 또한 산화스트레스에 의한 산화적 세포손상에 대하여 광물성 미네랄의 억제효과를 측정한 결과, H2O2로 손상된 LLC-PK1세포에 광물성 미네랄이 세포 생존율을 약 5%정도 증가시켰고, RGC-5세포에서는 세포 생존율이 약 10% 정도 증가하였다.
- 반면 광물성 미네랄 1% 전처리 후 rose bengal을 30 분간 반응시켰을 때 약 20%의 광용혈이 일어났으며, 적혈구 세포가 약 50% 용혈되는데 걸리는 시간은 90 분 정도로 나타났다 비타민 C 0.001% 처리 시에도 적혈구 세포가 약 50% 용혈되는데 걸리는 시간은 90 분 정도로 나타났다 이러한 결과는 광물성 미네랄이 광용혈 억제 효과를 가지고 있음을 의미한다.
- 그리고 광물성 미네랄은 광증감제인 rose bengal을 처리하여 적혈구에 광용혈을 유도했을 때 현저한 용혈 억제작용을 하였다. 이러한 결과는 광물성 미네랄이 in vitro 에서 다양한 동물세포에서 다양한 형태의 세포손상에 대한 억제효능을 가지고 있음을 보여준다. 향후 세포와 분자 및 동물 수준에서 광물성 미네랄의 세포보호효과가 체계적으로 보완된다면, 안전성 평가 후 광물성 미네랄의 세포손상 억제 효능이 식의약 소재 분야에서 응용될 수 있을 것으로 보인다.
- 과 rose bengal을 처리하지 않고 광조사만 한 경우 90 분까지 반응시켰을 때 약 5%의 용혈현상이 일어났다. 이에 비해 rose bengal 존재하에서 30 분간 반응시켰을 때 약 50%, 90분 반응시켰을 때 약 60%의 광용혈이 일어났으며 적혈구 세포가 50% 용혈되는데 걸리는 시간이 30 분으로 나타났다.
- 치는 영향을 알아보기 위하여 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-4 방출에 미치는 효과를 측정한 결과, 본 실험조건에서 우수한 염증성 사이토카인 분비억제 효능을 보이는 것으로 나타났다.
- 25% 광물성 미네랄 처리에 의하여 약 5% 세포손상이 억제되었다. 항산화력이 우수한 것으로 알려진 양성대조군인 astaxanthin 0.25% 처리에 의하여 동일조건에서 세포증식이 약 20%정도 증가하였다. 1.
후속연구
- 이러한 결과는 광물성 미네랄이 in vitro 에서 다양한 동물세포에서 다양한 형태의 세포손상에 대한 억제효능을 가지고 있음을 보여준다. 향후 세포와 분자 및 동물 수준에서 광물성 미네랄의 세포보호효과가 체계적으로 보완된다면, 안전성 평가 후 광물성 미네랄의 세포손상 억제 효능이 식의약 소재 분야에서 응용될 수 있을 것으로 보인다.
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