ITS 부위의PCR-RFLP 및 STS 마커를 이용한 차가버섯의 종 및 계통간 유연관계 분석 Identification and Phylogenetic Relationships of Inonotus obliquus Strains by PCR-RFLP of ITS sequences and STS markers원문보기
최근들어 수입량이 급증되고 있는 차가버섯의 분류체계를 확립하고, 이들 종 및 계통간의 유연관계 확립과 품종 구분을 위해 계통학적 정보를 지닌 ITS 영역의 염기서열, PCR-RFLP 및 STS프라이머를 사용하여 종 특이적인 마커를 개발하였다. 시베리아 캄차카 반도에서 수집된 74008 균주의 염기서열을 이용하여 Inonotus spp.의 유연관계를 분석한 결과 2개의 그룹으로 나뉘어 졌고, I. obliquus DSM 856P균주와 약 98%의 가장 높은 유사성을 나타내어 차가버섯임이 확인되었다. 또한 ITS 증폭산물을 제한효소로 처리하여 밴드 패턴을 비교하였을 때 종 및 계통에 따라 밴드가 다르게 나타났으며, STS primer를 이용하여 증폭산물을 비교하였을 때 종간에는 밴드패턴이 다르나 계통내에서는 동일한 밴드패턴을 보였다. 따라서 차가버섯의 품종 구분을 위해서는 STS 마커와 PCR-RFLP를 동시에 사용함으로서 품종 구분이 좀 더 명확하리라 사료된다.
최근들어 수입량이 급증되고 있는 차가버섯의 분류체계를 확립하고, 이들 종 및 계통간의 유연관계 확립과 품종 구분을 위해 계통학적 정보를 지닌 ITS 영역의 염기서열, PCR-RFLP 및 STS 프라이머를 사용하여 종 특이적인 마커를 개발하였다. 시베리아 캄차카 반도에서 수집된 74008 균주의 염기서열을 이용하여 Inonotus spp.의 유연관계를 분석한 결과 2개의 그룹으로 나뉘어 졌고, I. obliquus DSM 856P균주와 약 98%의 가장 높은 유사성을 나타내어 차가버섯임이 확인되었다. 또한 ITS 증폭산물을 제한효소로 처리하여 밴드 패턴을 비교하였을 때 종 및 계통에 따라 밴드가 다르게 나타났으며, STS primer를 이용하여 증폭산물을 비교하였을 때 종간에는 밴드패턴이 다르나 계통내에서는 동일한 밴드패턴을 보였다. 따라서 차가버섯의 품종 구분을 위해서는 STS 마커와 PCR-RFLP를 동시에 사용함으로서 품종 구분이 좀 더 명확하리라 사료된다.
Because the import of Inonotus obliquus have been rapidly increased in Korea, we developed the Inonotus species-specific marker by using various sequences including ITS sequences, PCR-RFLP and STS primers and used this marker to determine both genetic relatedness and strains discrimination of Inonot...
Because the import of Inonotus obliquus have been rapidly increased in Korea, we developed the Inonotus species-specific marker by using various sequences including ITS sequences, PCR-RFLP and STS primers and used this marker to determine both genetic relatedness and strains discrimination of Inonotus spp. Total 17 different Inonotus spp. were examined by using ITS sequences and classified into 2 different groups. One strain, ASI74008 isolated from Kamchaka island of Siberia, showed the high sequence identity (98%) at the nucleotide level to the other I. obliquus DSM strain, indicating the ASI74008 belong to I. obliquus species. Comparison of banding patterns after restriction enzyme digestions with PCR amplicons of ITS region revealed some variations depending on the species and strains. However, PCR products amplified with STS primer showed species specific patterns.Therefore, use of both STS primers and PCR-RFLP could help for better strain identification.
Because the import of Inonotus obliquus have been rapidly increased in Korea, we developed the Inonotus species-specific marker by using various sequences including ITS sequences, PCR-RFLP and STS primers and used this marker to determine both genetic relatedness and strains discrimination of Inonotus spp. Total 17 different Inonotus spp. were examined by using ITS sequences and classified into 2 different groups. One strain, ASI74008 isolated from Kamchaka island of Siberia, showed the high sequence identity (98%) at the nucleotide level to the other I. obliquus DSM strain, indicating the ASI74008 belong to I. obliquus species. Comparison of banding patterns after restriction enzyme digestions with PCR amplicons of ITS region revealed some variations depending on the species and strains. However, PCR products amplified with STS primer showed species specific patterns.Therefore, use of both STS primers and PCR-RFLP could help for better strain identification.
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제안 방법
ASI(Agricultural Science Institute)에 수집 등록된 Inonotus 13균주와 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있는 공시균주의 염기서열을 사용하여 유연관계를 분석하였다(표 1). 본 실험에서는 캄차카 반도에서 수집된 차가버섯 74008 균주의 게놈 DNA를 분리하여 ITS 영역를 Wagner and Fischer(2001)가 사용한 LROR과 LR7의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다.
ITS 부위 영역의 증폭된 DNA는 2% agarose gel에서 확인한 후 Geneclean Kit II(BIolab101)를 이용하여 추출하였고, 추출된 DNA를 제한효소AluI, HaeⅢ 등으로 처리하여 밴드의 변화를 관찰하였다. 균주간 염기서열 분석은 ClustalW 분석프로그램을 이용하여 유연관계를 분석하였다.
)를 이용하여 균사체로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 각각의 게놈 DNA로부터 rDNA의 ITS 영역을 증폭하기 위하여 Wagner and Fischer(2001)가 만든 LROR-5(ACC CGC TGA ACT TAA GC) 및 LR7-3(TAC TAC CAC CAA GAT CT)와 같이 primer를 디자인 하여 PCR 증폭을 수행하였다. PCR 반응은 Bioneer사의 Kit를 사용하였고, PCR 조건은 96℃에서 5분간 Pre-heating 시킨 다음, 96℃에서 1분간 denaturation, 52℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 1 cycle로 하여, 총 30 cycle을 반응시킨 다음 72℃에서 5분동안 post extention 하고 4℃로 유지하였다.
본 실험에 사용한 균주는 농업과학기술원 응용미생물과에서 보관하고 있는 균주 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있는 차가버섯 및 유사종의 염기서열을 유연관계 분석에 사용하였다. 공시균주는 PDA(Potato Dextrose Agar) 배지에 접종하여 15일마다 계대배양하면서 공시균주로 사용하였다(표 1).
균주간 염기서열 분석은 ClustalW 분석프로그램을 이용하여 유연관계를 분석하였다. 또한 STS(SubTelomere Sequences)부위 영역의 primer 합성은 인간 subtelomere부위의 염기서열 중에서 앞부분과 뒷부분으로 나누어 STS15(AGT TAC TCT GGG GTC CCC TC), STS13(CCC CTA TTA CAA CTT GGG CA) 및 STS25(CCT GCA GCA ATT TGT CAT TTT), STS23(ATT CAC CAT CAA TGA AGC CC) 두 종류의 primer를 디자인하여 PCR 증폭산물을 통해 종 및 계통간 차이점을 분석하였다.
보관된 13균주를 PDA 배지에서 배양한 후 DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN Co.)를 이용하여 균사체로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 각각의 게놈 DNA로부터 rDNA의 ITS 영역을 증폭하기 위하여 Wagner and Fischer(2001)가 만든 LROR-5(ACC CGC TGA ACT TAA GC) 및 LR7-3(TAC TAC CAC CAA GAT CT)와 같이 primer를 디자인 하여 PCR 증폭을 수행하였다.
ASI(Agricultural Science Institute)에 수집 등록된 Inonotus 13균주와 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있는 공시균주의 염기서열을 사용하여 유연관계를 분석하였다(표 1). 본 실험에서는 캄차카 반도에서 수집된 차가버섯 74008 균주의 게놈 DNA를 분리하여 ITS 영역를 Wagner and Fischer(2001)가 사용한 LROR과 LR7의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. 증폭결과 약 900bp를 얻어 염기서열을 분석한 후 NCBI에 등록하였다(GenBank Accession no.
우리나라는 김 등(2003, 2004, 2005) 및 이 등(2007)이 ITS(Internal Transcribed Spacers) 부위 DNA 염기서열 분석으로 종간의 유사성을 분석하였고, 또한 차가버섯만이 유전자증폭이 되는 종 특이적 마커를 개발하였으나 비교할 수 있는 다른품종에서는 유전자증폭 산물이 나타나지 않아 비교분석이 곤란하였다. 본 연구에서는 ITS(Internal Transcribed Spacers) 부위 DNA 염기서열 분석을 통하여 종간분류학적 유연관계를 확립하고, STS(SubTelomere Sequences) 부위를 이용하여 종간 밴드 크기의 차이를 나타내었고, ITS 부위의 PCR 증폭산물을 제한효소로 처리하는 방법인 PCR-RFLP를 이용하여 종간 뿐만아니라 계통간의 차이점을 분석하였다.
최근들어 수입량이 급증되고 있는 차가버섯의 분류체계를 확립하고, 이들 종 및 계통간의 유연관계 확립과 품종 구분을 위해 계통학적 정보를 지닌 ITS 영역의 염기서열, PCR-RFLP 및 STS 프라이머를 사용하여 종 특이적인 마커를 개발하였다. 시베리아 캄차카 반도에서 수집된 74008 균주의 염기서열을 이용하여 Inonotus spp.
대상 데이터
본 실험에 사용한 균주는 농업과학기술원 응용미생물과에서 보관하고 있는 균주 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있는 차가버섯 및 유사종의 염기서열을 유연관계 분석에 사용하였다. 공시균주는 PDA(Potato Dextrose Agar) 배지에 접종하여 15일마다 계대배양하면서 공시균주로 사용하였다(표 1).
데이터처리
ITS 부위 영역의 증폭된 DNA는 2% agarose gel에서 확인한 후 Geneclean Kit II(BIolab101)를 이용하여 추출하였고, 추출된 DNA를 제한효소AluI, HaeⅢ 등으로 처리하여 밴드의 변화를 관찰하였다. 균주간 염기서열 분석은 ClustalW 분석프로그램을 이용하여 유연관계를 분석하였다. 또한 STS(SubTelomere Sequences)부위 영역의 primer 합성은 인간 subtelomere부위의 염기서열 중에서 앞부분과 뒷부분으로 나누어 STS15(AGT TAC TCT GGG GTC CCC TC), STS13(CCC CTA TTA CAA CTT GGG CA) 및 STS25(CCT GCA GCA ATT TGT CAT TTT), STS23(ATT CAC CAT CAA TGA AGC CC) 두 종류의 primer를 디자인하여 PCR 증폭산물을 통해 종 및 계통간 차이점을 분석하였다.
이론/모형
하지만 염기서열을 이용한 유사성의 분석은 종간의 유연 관계나 유사성을 분석하는 데에는 가장 좋은 방법이나 품종간의 차이를 비교분석하기는 어렵다. 따라서 종간, 계통간 차이를 구분하고자 증폭산물인 염기서열이 분석되지 않을 경우에 사용하는 방법으로 PCR 증폭산물을 특정제한효소로 절단하여 RFLP를 보는 방법, PCR-RFLP 일명 CAPS법으로 분석하였다. 수집된 공시균주 I.
분석된 염기서열과 NCBI에 등록되어 있는 염기서열간의 alignment를 수행한 결과를 그림 1에 나타내었다. 그림 1에 나타난 결과는 Inonotus를 크게 2그룹으로 나누어졌으며, A group에는 Inonotus obliquus ASI74010(DSM8659), Inonotus obliquus ASI74008, I. nidus-pici, I. hispidus, I. dryophillus, I. tamaricis, I. hastifer, I. nodulosus, I. subiculosus, I. dryadeus, I. chondromyelus이며, B group에는 I. glomeratus, I. radiatus, I. rheades, I. cuticularis, I. circinatus, I. tomentosus로 분류되었다(Phellinus pini; outgroup). 캄차카 반도에서 수집된 차가버섯 ASI74008 균주는 I.
obliquus ASI74010(DSM8659)이 다른 밴드패턴을 보여주었다. 따라서 제한효소 AluI, HaeIII를 처리하면 종간 뿐만 아니라 차가버섯 내의 밴드패턴도 달라 품종 구분에도 이용이 가능함을 확인하였다.
obliquus DSM 856P균주와 약 98%의 가장 높은 유사성을 나타내어 차가버섯임이 확인되었다. 또한 ITS 증폭산물을 제한효소로 처리하여 밴드 패턴을 비교하였을 때 종 및 계통에 따라 밴드가 다르게 나타났으며, STS primer를 이용하여 증폭산물을 비교하였을 때 종간에는 밴드패턴이 다르나 계통내에서는 동일한 밴드패턴을 보였다. 따라서 차가버섯의 품종 구분을 위해서는 STS 마커와 PCR-RFLP를 동시에 사용함으로서 품종 구분이 좀 더 명확하리라 사료된다.
시베리아 캄차카 반도에서 수집된 74008 균주의 염기서열을 이용하여 Inonotus spp.의 유연관계를 분석한 결과 2개의 그룹으로 나뉘어 졌고, I. obliquus DSM 856P균주와 약 98%의 가장 높은 유사성을 나타내어 차가버섯임이 확인되었다. 또한 ITS 증폭산물을 제한효소로 처리하여 밴드 패턴을 비교하였을 때 종 및 계통에 따라 밴드가 다르게 나타났으며, STS primer를 이용하여 증폭산물을 비교하였을 때 종간에는 밴드패턴이 다르나 계통내에서는 동일한 밴드패턴을 보였다.
tomentosus로 분류되었다(Phellinus pini; outgroup). 캄차카 반도에서 수집된 차가버섯 ASI74008 균주는 I. obliquus ASI74010(DSM)의 공시균주와 유사성이 98%로 가장 높아 차가버섯으로 확인되었다.
후속연구
또한 ITS 증폭산물을 제한효소로 처리하여 밴드 패턴을 비교하였을 때 종 및 계통에 따라 밴드가 다르게 나타났으며, STS primer를 이용하여 증폭산물을 비교하였을 때 종간에는 밴드패턴이 다르나 계통내에서는 동일한 밴드패턴을 보였다. 따라서 차가버섯의 품종 구분을 위해서는 STS 마커와 PCR-RFLP를 동시에 사용함으로서 품종 구분이 좀 더 명확하리라 사료된다.
이상과 같이 차가버섯의 품종 구분을 위해서는 빠르면서 신속정확하게 구분하기 위한 방법으로 STS marker를 이용하여 일차적으로 종간 구분을 한 다음 PCR-RFLP법을 사용하여 종 및 계통간 품종구분이 가능하리라 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
차가버섯에는 어떤 효능이 있는가?
차가버섯(Inonotus obliquus)은 담자균문의 소나무비늘 버섯과(Hymenochaetaceae), 시루뻔버섯(Inonotus)속에 속하는 약용버섯으로 주로 북방한랭지역인 시베리아, 캐나다, 일본 홋카이도 및 시베리아 캄차크반도에서 자생하는 검은 자작나무에 기생하는 균핵덩어리 형태로 표면은 검고 내부는 황갈색을 띄며 항암(Kim et al., 2006), 항당뇨(양, 2005), 항산화(Cui et al., 2005), 항염증(Park et al., 2005), 면역 강화(Kim et al., 2005) 항혈전(Hyun, 2006) 효과 등으로 인해 기능성 식품으로 각광을 받고 있다(김, 2003; 유, 2004; Wangum et al., 2006).
차가버섯이란 무엇인가?
차가버섯(Inonotus obliquus)은 담자균문의 소나무비늘 버섯과(Hymenochaetaceae), 시루뻔버섯(Inonotus)속에 속하는 약용버섯으로 주로 북방한랭지역인 시베리아, 캐나다, 일본 홋카이도 및 시베리아 캄차크반도에서 자생하는 검은 자작나무에 기생하는 균핵덩어리 형태로 표면은 검고 내부는 황갈색을 띄며 항암(Kim et al., 2006), 항당뇨(양, 2005), 항산화(Cui et al.
차가버섯의 진위에 관련된 품종 구별 문제를 해결하기 위한 품종 구별 방법에는 어떤 것이 있는가?
차가버섯에 대한 사람들의 관심이 높아지면서 중국, 러시아, 북한 등을 통해 차가버섯 유사종 Inonotus mikadoi, Inonotus hispidus, Inonotus xeranticus 등이 미동정된 상태에서 차가버섯(Inonotus obliquus)으로 시판되거나 인공재배도 시도되고 있으며(이, 2005), 저가로 대량 유입되어 고가로 판매되면서 차가버섯의 진위에 관련된 품종 구별 문제를 발생시킬 우려가 있다. 이러한 품종 구별에 대한 방법으로 형태적 방법과 유전적 방법이 존재하는 데 형태적인 방법만으로는 판단하기가 어려운 실정이어서 유전적 판별방법이 병행되어야 할 것으로 본다. 유전적 방법으로 가장 널리 이용하고 있는 기술은 ITS 부위의 염기서열을 이용한 유사성 분석을 통해 분류체계를 확립하거나 종속간 유연관계를 해석하고 있다(Wagner and Fischer, 2001, 2002).
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