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문제 정의
- 따라서 암세포 특이적인 세포사멸을 유도하여 항암효과를 가지는 약물을 개발하기 위해서는 1 차로 자생식물과 같은 다양한 천연물로부터 다량의 후보물질을 이용하여 스크리닝 한 후 많은 종류의 후보 물질을 확보하여 진행하는 것이 바람직할 것이다. 이 논문에서 저자는 한국의 전통적인 약용식물로 알려진 다양한 자생식 물의 각 부위별 추출물을 이용하여 암세포 특이적인 세포 사멸 유도능이 있는 항암 후보 물질을 도출하기 위한 스크리닝 결과를 제시하였다.
제안 방법
- 35 종의 추출물을 0.00001 µg/µl~2 µg/µl의 농도로 세포에 처리하여 18 시간 후에 살아있는 세포의 양을 측정하였다.
- 5% NP-40, protease inhibitors)을 넣고 세포를 용해 하였다. 4℃의 원심분리기에서 12000 rpm 의 속도로 원심분리 한 후, 상층액에 있는 단백질들을 SDSPAGE 상에서 분리하였고, 분리된 단백질을 PVDF membrane으로 옮긴 후, 세포사멸과정의 표지 단백질 중 대표적인 단백질인 poly-(ADP-ribose)-polymerase에 대한 항체 (Roche Applied Science, Germany)와 caspase-3에 대한 항체 (Santa Cruz Biotechnology Inc., California, USA)를 이용하여 Western analysis를 진행 하였다.
- 특히 암세포에는 정상세포에서 발생하는 세포사멸 기전이 억제 되어 있는 경우가 빈번하므로,8-11) 세포사멸을 유도하는 기전을 항암제 스크리닝에 응용할 수 있다. 5 종의 추출물 (Table 1의 14, 15, 17, 18, 24번 - 순서대로 느릅나무 줄기 및 수피 추출물, 느티나무 줄기전체와 잔가지 부분, 그리고 뱀딸기의 지상부 추출물)을 이용하여 9 종의 암세포에서 세포사멸을 유도할 수 있는지 스크리닝 하였다. 세포사멸의 과정에서 활성이 일어나는 다양한 종류의 caspase들의 활성을 한꺼번에 분석할 수 있는 kit를 이용하여, 여러 종의 암세포에서의 caspases 활성을 그래프로 나타내었다 (Fig.
- 00001 µg/µl~2 µg/µl의 농도로 세포에 처리하여 18 시간 후에 살아있는 세포의 양을 측정하였다. 각 9종의 암세포에서 측정된 값을 평균하여 IC50값을 결정하였다 (Table 1). 35 종의 추출물 중 강활 (Ostericum koreanum)의 지상부 (Table 1의 4번 추출물), 까마중 (Aster tartaricus)의 열매 (Table 1의 11번 추출물), 뽕나무 (Morus alba.
- 느릅나무 수피 추출물과 느티나무의 잔가지 추출물이 세포사멸을 유도하는 것으로 보이므로 이를 생화학적으로 증명하기 위해 세포사멸 과정을 예측하는데 유용한 표지 단백질인 poly-(ADP-ribose)-polymerase와 caspase-3의 활성 분할을 단백질 수준에서 분석하였다. 구강세포 3종과 간암세포 3종, HeLa 세포에 두 추출물을 각각 처리하고 18시간 후에 세포를 모아 Western 분석을 하였다. 추출물을 처리하지 않은 세포에서는 두 단백질은 모두 활성 분할되지 않아 작은 크기의 단백질 조각 (그림 3의 세모 표시)이 관찰 되지 않았다 (그림 3, A).
- 1의 독성 결과에서 보는 바와 같이 세포 독성이 비슷한 수준으로 일어난다고 하여도 세포의 독성 정도가 세포사멸과 일치하지는 않는다는 것이다. 느릅나무 수피 추출물과 느티나무의 잔가지 추출물이 세포사멸을 유도하는 것으로 보이므로 이를 생화학적으로 증명하기 위해 세포사멸 과정을 예측하는데 유용한 표지 단백질인 poly-(ADP-ribose)-polymerase와 caspase-3의 활성 분할을 단백질 수준에서 분석하였다. 구강세포 3종과 간암세포 3종, HeLa 세포에 두 추출물을 각각 처리하고 18시간 후에 세포를 모아 Western 분석을 하였다.
- 자생식물 19종의 각 부위로부터 만들어진 35종의 메탄올 추출물을 암세포 및 정상세포에 적용하여 항암효과가 있는 물질을 스크리닝 하고자 하였다. 먼저 35종의 추출물을 정상 치은 조직으로부터 1차 배양된 치은섬유아세포와 암세포에 각각 처리한 후, 나타나는 세포 독성 정도를 측정하였다. 분석실험에 이용한 암세포의 종류는 구강암, 간암, 위암, 자궁암등 모두 9종이었으며, 이들의 doubling time은 18~20시간으로 분석 되었다 (재료 및 방법 참고).
- 5 종의 추출물 (Table 1의 14, 15, 17, 18, 24번 - 순서대로 느릅나무 줄기 및 수피 추출물, 느티나무 줄기전체와 잔가지 부분, 그리고 뱀딸기의 지상부 추출물)을 이용하여 9 종의 암세포에서 세포사멸을 유도할 수 있는지 스크리닝 하였다. 세포사멸의 과정에서 활성이 일어나는 다양한 종류의 caspase들의 활성을 한꺼번에 분석할 수 있는 kit를 이용하여, 여러 종의 암세포에서의 caspases 활성을 그래프로 나타내었다 (Fig. 2). 까마중 (Aster tartaricus)의 뿌리에서 추출한 시료 (10번 추출물)는 매우 독성이 강하여 0.
- 세포들을 96 well plate에 105 ~106 개/ml의 농도로 접종하고 37℃, 5% CO2 가 공급되는 항온 세포배양기에서 8시간 이상 전 배양한 후 각 추출물들을 적절한 농도로 처리하여 18시간 이상 배양하였다. 세포사멸이 일어난 세포 안에서 활성이 증가되어있는 caspases의 양을 측정하기 위해 kit에 제공된 caspase의 기질 단백질 (DEVD-R110)을 세포에 첨가하여 1 시간 동안 효소 반응 한 후 기질 단백질이 caspases에 의해 분해된 정도를 microplate reader기를 사용하여 560 nm에서의 흡광도로써 측정하였다.
- 1, 2, 10, 50, 200 mg씩 을 각각 처리한 후 18시간 동안 배양하였다. 세포의 독성은 Cell Counting Kit-8TM (CCK-8, Dojindo, Japan) 시약을 이용하여 분석하였다. 각 배양액에 CCK-8 용액 10 µl 씩 넣은 후 2~4 시간 반응하고, 수용액에 녹아있는 tetrazolium salt (WST-8, [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt])의 양을 microplate reader기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
- 자생식물 19종의 각 부위로부터 만들어진 35종의 메탄올 추출물을 암세포 및 정상세포에 적용하여 항암효과가 있는 물질을 스크리닝 하고자 하였다. 먼저 35종의 추출물을 정상 치은 조직으로부터 1차 배양된 치은섬유아세포와 암세포에 각각 처리한 후, 나타나는 세포 독성 정도를 측정하였다.
- 추출물을 세포배양액 100 µl에 0.001, 0.01, 0.1, 2, 10, 50, 200 mg씩 을 각각 처리한 후 18시간 동안 배양하였다.
- 17) 암 세포주들은 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)을 배지로 이용하여, 37℃, 5% CO2 가 공급되는 항온 세포배양기에서 배양하였다. 치은섬유아세포 (human gingival fibroblast, HGF)는 사랑니의 발치 후 환자의 동의를 얻어 발치 치아의 주변 조직으로부터 일차 배양되었고, 암세포 실험에 대한 대조군으로 이용하였다.
대상 데이터
- 1 µg/µl of doxorubicin; 3-10, methanol extracts. The used cancer cell lines were indicated as YD38, 739 (SNU739), 387 (SNU387), KB, SK-Hep1, 668 (SNU668), and HeLa cell. Each value of means +/- S.
- 먼저 35종의 추출물을 정상 치은 조직으로부터 1차 배양된 치은섬유아세포와 암세포에 각각 처리한 후, 나타나는 세포 독성 정도를 측정하였다. 분석실험에 이용한 암세포의 종류는 구강암, 간암, 위암, 자궁암등 모두 9종이었으며, 이들의 doubling time은 18~20시간으로 분석 되었다 (재료 및 방법 참고). 35 종의 추출물을 0.
- 세포 배양 − 3종의 구강암 세포주 (KB, YD15, YD38), 3종의 간암 세포주 (SNU387, SNU739, SK-Hep1), 위암 세포주인 SNU216 및 SNU668들은 모두 인간에서 유래된 세포들이며, 한국세포주은행 (Korea cell line bank, KCLB, http://cellbank.snu.ac.kr)로부터 분양 받아 본 실험에 이용하였다.
- 식물 재료 − 실험에 이용한 35종의 시료는 2001년부터 2005년까지 전국산야에서 자생하는 식물 또는 수원 농촌진흥청 약용작물시험포장에서 증식한 자생 식물 중 전통적으로 항암효과가 있다고 알려진 19종의 식물을 채취하여 지상부 및 뿌리 부위를 나누어 음건, 쇄절 후 메탄올로 환류 추출장치를 이용하거나 ASE (accelerated solvent extractor, DIONEX, USA)를 사용하여 얻은 물질을 감압 농축하여 사용 하였다.
이론/모형
- Caspases assay − 각 추출물들의 세포사멸 유발 효과를 다량으로 분석하기 위해 Homogeneous Caspases Assay KitTM (Roche Applied Science, Germany)을 이용하였다.
성능/효과
- 35 종의 추출물 중 강활 (Ostericum koreanum)의 지상부 (Table 1의 4번 추출물), 까마중 (Aster tartaricus)의 열매 (Table 1의 11번 추출물), 뽕나무 (Morus alba.)의 열매 (Table 1의 26번 추출물)로부터 얻은 추출물들은 치은섬유 아세포와 암세포 모두에 2 µg/µl 이상의 고농도를 처리하여도 세포에는 독성이 나타나지 않았다.
- 본 실험에서 5 종의 추출물이 이와 같은 특징을 보였다. 느릅나무 (Ulmus parvifolia)의 줄기 및 수피 추출물들 (Table 1의 14와 15번 추출물), 느티나무 (Zelkova serrata)의 나무 줄기의 전체 부분과 잔가지 부분 (Table 1의 17과 18번 추출물), 그리고 뱀딸기 (Duchesnea chrysanta)의 지상부 추출물 (Table 1의 24번 추출물)이 정상세포에는 독성이 약하지만 암세포 특이적인 독성을 보였다. 이들의 암세포에서의 IC50값은 0.
- 느릅나무 수피 추출물을 처리하였을 경우에는 구강암세포 2종과 간암세포인 SNU387, HeLa 세포에서 poly-(ADPribose)-polymerase와 caspase-3 모두 활성이 증가하는 것을 관찰 할 수 있었다 (그림 3, B의 lane 1, 3, 5 & 6).
- 1의 그래프 b에 나타내었다. 반면, 27 종의 추출물들은 정상 세포와 암세포 모두에서 비슷한 IC50값으로 독성을 가지고 있는 것으로 분석되었다. 이중 까마중 (Aster tartaricus)의뿌리에서 추출한 시료 (Table 1의 10번 추출물)는 매우 독성이 강하여 0.
- 2의 3 & 4번 막대들). 이 결과에서 까마중 뿌리에서 추출한 물질이 세포의 괴사는 유도하지만, 세포사멸을 유도하지는 않는다는 사실을 알 수 있다. Fig.
- 이중 까마중 (Aster tartaricus)의뿌리에서 추출한 시료 (Table 1의 10번 추출물)는 매우 독성이 강하여 0.01 µg/µl 이하의 IC50값을 가지며, 매우 저농도에서도 세포들을 죽이는 것으로 관찰 되었다 (Fig. 1, a).
후속연구
- 결론으로, 전통적으로 항암 활성이 있다고 알려진 약용식물인 느릅나무 (Ulmus parvifolia)의 수피와 느티나무 (Zelkova serrata)의 잔가지로부터 암세포 특이적인 세포 독성을 가질 뿐 만 아니라, 나아가 세포 사멸을 유도하는 좀 더 효과적인 항암 후보물질을 얻을 수 있었으며, 이 추출물 들을 암 조직 특이적인 항암제로써 응용할 수 있는 가능성도 제시하였다. 이후 위의 두가지 추출물을 화학적으로 분석, 분리 정제하여 각 순수 화합물의 세포사멸능을 검증하게 될 것이며, 세포사멸 과정 중에 두 약물의 표적이 되는 인자를 연구하게 될 것이다.
- 15-16) 최근 세포 사멸 유도를 위한 다양한 약물의 스크리닝 실험들이 진행 되고 있지만, 대부분의 후보 약물들이 낮은 항암 효율과 약물에 대한 저항성 유발 때문에 전 임상 단계에서 개발이 제한되고 있다. 따라서 암세포 특이적인 세포사멸을 유도하여 항암효과를 가지는 약물을 개발하기 위해서는 1 차로 자생식물과 같은 다양한 천연물로부터 다량의 후보물질을 이용하여 스크리닝 한 후 많은 종류의 후보 물질을 확보하여 진행하는 것이 바람직할 것이다. 이 논문에서 저자는 한국의 전통적인 약용식물로 알려진 다양한 자생식 물의 각 부위별 추출물을 이용하여 암세포 특이적인 세포 사멸 유도능이 있는 항암 후보 물질을 도출하기 위한 스크리닝 결과를 제시하였다.
- 결론으로, 전통적으로 항암 활성이 있다고 알려진 약용식물인 느릅나무 (Ulmus parvifolia)의 수피와 느티나무 (Zelkova serrata)의 잔가지로부터 암세포 특이적인 세포 독성을 가질 뿐 만 아니라, 나아가 세포 사멸을 유도하는 좀 더 효과적인 항암 후보물질을 얻을 수 있었으며, 이 추출물 들을 암 조직 특이적인 항암제로써 응용할 수 있는 가능성도 제시하였다. 이후 위의 두가지 추출물을 화학적으로 분석, 분리 정제하여 각 순수 화합물의 세포사멸능을 검증하게 될 것이며, 세포사멸 과정 중에 두 약물의 표적이 되는 인자를 연구하게 될 것이다.
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