The antitumor activity of the roots extract of Pueraria thunbergiana was investigated on the basis of cytotoxicity upon the cultured human tumor cell lines, in vitro. The purification of methylene chloride (MC) soluble part and ethylacetate (EA) soluble part of extract by column chromatography furni...
The antitumor activity of the roots extract of Pueraria thunbergiana was investigated on the basis of cytotoxicity upon the cultured human tumor cell lines, in vitro. The purification of methylene chloride (MC) soluble part and ethylacetate (EA) soluble part of extract by column chromatography furnished seven isoflavonoids, two triterpenoids, one but-2-enolide. The structures of them were established by chemical and spectroscopic means to be lupeol (1), $\beta$-sitosterol (2), biochanin A (3), (-)-tuberosin (4), calycosin (5), daidzein (6), puerarin (7), daidzin (8), (+)-puerol-B 2-O-$\beta$-glucopyranoside (9), formononetin-7-O-$\beta$-glucopyranoside (10). Each isolates ($1{\sim}10$) were evaluated for inhibitory activities on the proliferation of cultured human tumor cell lines such as A549, SK-OV-3, HCT-15 and SK-MEL-2, respectively.
The antitumor activity of the roots extract of Pueraria thunbergiana was investigated on the basis of cytotoxicity upon the cultured human tumor cell lines, in vitro. The purification of methylene chloride (MC) soluble part and ethylacetate (EA) soluble part of extract by column chromatography furnished seven isoflavonoids, two triterpenoids, one but-2-enolide. The structures of them were established by chemical and spectroscopic means to be lupeol (1), $\beta$-sitosterol (2), biochanin A (3), (-)-tuberosin (4), calycosin (5), daidzein (6), puerarin (7), daidzin (8), (+)-puerol-B 2-O-$\beta$-glucopyranoside (9), formononetin-7-O-$\beta$-glucopyranoside (10). Each isolates ($1{\sim}10$) were evaluated for inhibitory activities on the proliferation of cultured human tumor cell lines such as A549, SK-OV-3, HCT-15 and SK-MEL-2, respectively.
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문제 정의
따라서 갈근의 MeOH 추출물을 상법에 따라 용매분획을 실시하여 얻은 각 분획을 각종 chromatography를 통하여 정제한 결과 최종적으로 10종의 성분들을 분리하였다. 본 보에서는 이들 10종의 성분들의 이화학적 성상 및 기기분석 자료를 통한 화학구조의 규명 및 각 화합물들의 인체유래 암세포주에 대한 세포증식저해효과를 보고하고자 한다.
제안 방법
0 g을 얻었다. MC 분획 77.0 g 을 silica gel column chromatography (MC : MeOH = 100 : 1, 20 : 1, 5 : 1, 1 : 1)를 실시하여 4개의 분획 (Fr.1~Fr.4)으로 나누었으며, 이 중 Fr.2 (32.9 g)를 재차 silica gel column chromatography (n-hexane : EA = 15 : 1, 7 :1, 3 : 1)를 이용하여 8개의 분획 (Fr.21~Fr.28)으로 나누었다. 이들 중 Fr.
분리된 화합물들은 각각 물리화학적 성상과 기기 분석 (1H-NMR, 13C-NMR) data로 lupeol (1), β-sitosterol (2), biochanin A (3), (-)-tuberosin (4), calycosin (5), daidzein (6), puerarin (7), daidzin (8), (+)-puerol-B 2-O-β-glucopyranoside (9), formononetin-7-O-β-glucopyranoside (10)로 확인 동정하였다.
생약재 갈근(葛根, Pueraria thunbergiana Benth)의 MeOH 추출물을 극성에 따라 용매분획 후 chromatography를 이용하여 7종의 isoflavonoid 화합물, 2종의 triterpenoid 화합물, 1종의 but-2-enolide 화합물을 분리 정제하였다. 분리된 화합물들은 각각 물리화학적 성상과 기기 분석 (1H-NMR, 13C-NMR) data로 lupeol (1), β-sitosterol (2), biochanin A (3), (-)-tuberosin (4), calycosin (5), daidzein (6), puerarin (7), daidzin (8), (+)-puerol-B 2-O-β-glucopyranoside (9), formononetin-7-O-β-glucopyranoside (10)로 확인 동정하였다.
C-NMR spectra는 Brucker 의 AM-300과 AMX 500로 측정하였다. 세포독성 실험은 sulforhodamine B (SRB) bioassay 방법을 응용하여 수행하였다.17) 실험에 사용한 암세포주들은 A549 (non small cell lung carcinoma), SK-OV-3 (ademoncarcinoma, ovary malignant ascites), SK-MEL-2 (malignant melanoma, metastasis to skin of thigh) 및 HCT-15 (colon adenocarcinoma)이며 모두 human origin tumor cell line들로써, 미국국립암연구소 (NCI)로부터 분양받아 한국화학연구원에서 계대배양 중인 것을 사용하였다.
0 kg을 MeOH에 7일간 2회 상온냉침하였다. 추출액을 모아 감압, 농축하여 MeOH 추출물 2.0 kg을 얻었으며, 이를 증류수에 현탁시킨 후 methylene chloride (MC)와 ethylacetate (EA), n-butanol (BuOH)로 단계적으로 용매 분획하여 MC 분획 93.0 g과 EA 분획 66.0 g, BuOH 분획 723.0 g을 얻었다. MC 분획 77.
대상 데이터
세포독성 실험은 sulforhodamine B (SRB) bioassay 방법을 응용하여 수행하였다.17) 실험에 사용한 암세포주들은 A549 (non small cell lung carcinoma), SK-OV-3 (ademoncarcinoma, ovary malignant ascites), SK-MEL-2 (malignant melanoma, metastasis to skin of thigh) 및 HCT-15 (colon adenocarcinoma)이며 모두 human origin tumor cell line들로써, 미국국립암연구소 (NCI)로부터 분양받아 한국화학연구원에서 계대배양 중인 것을 사용하였다.
시약 및 기기 −1H 및 13C-NMR spectra는 Brucker 의 AM-300과 AMX 500로 측정하였다.
실험재료 − 본 실험에 사용된 생약재 갈근은 2006년 10월 시중 건재상에서 구입하여 국민대학교 김영균 교수의 감정 후 사용하였으며 표품은 한국화학연구원 (KR0035-2006)에 보관되어 있다.
암세포 증식 저해활성(in vitro cytotoxicity)의 측정 − 실험에 사용한 암세포주들은 A-549 (non small cell lungcarcinoma), SK-OV-3 (adenocarcinoma, ovary malignant ascites), SK-MEL-2 (malignant melanoma, metastasis to skin of thigh), HCT 15 (colon adenocarcinoma) 이며 암세포들은 모두 human origin tumor cell line들로써, 미국의 국립암연구소 (NCI)로부터 분양받아 한국화학연구원에서 계대배양 중인 것을 사용하였으며 암세포 증식저해활성은 NCI protocol에 따라 측정하였다.
성능/효과
10) 화합물 2는 무색 무정형결정으로 1H-NMR 등 분광학적 data를 문헌11)과 비교한 결과 β-sitosterol로 확인되었다.
화합물 8은 흰색분말로서 1H-NMR과 13C-NMR data를 표품과 비교하여 본 결과 daidzein (화합물 6)의 7번 hydroxy 기에 glucose가 결합된 daidzin으로 확인하였다.13) 화합물 9는 1H-NMR spectrum에서 isoflavonoid의 1H-NMR spectrum과 비슷한 양상을 보였으나, isoflavonoid 의 1H-NMR spectrum에서 특징적으로 관찰되는 2번 proton signal (8.32 ppm)이 보이지 않았다. 반면에 13C-NMR data를 면밀히 조사하여본 결과 두 개의 aromatic ring과 한 개의 furan ring, 한 개의 glucoside가 결합된 부분구조를 추측할 수 있었으며, 최종적으로 문헌17)과 비교하여 화합물 9는 (+)-puerol-B 2-O-β-glucopyranoside로 확인하였다.
1,2)갈근의 flavonoid 성분은 관상동맥 확장, 심장 근육의 산소 소모량 감소, 혈소판의 응집 억제에 대해 보고되어 있다.3)갈근의 또 다른 약리활성에 대한 연구로는 helicobacter pylori균의 저해활성,4) 장내세균의 활성화 효과,5) 항산화 효과,6)알콜성 간 손상 보호 효과,7) allelopathy 작용,8)해독작용, 면역력 증강 등의 효능을 보이는 것으로 알려졌다.
저자 등은 A549 (인체유래 비소세포폐암주) 등 4종의 인체유래 암세포주를 대상으로 하여 시험관 내 (in vitro) 세포증식저해효과를 지표로 300 여종의 생약재 추출물들의 항암효능을 검색하여 본 결과 갈근(Pueraria thunbergiana)의 methanol (MeOH) 추출물이 농도 의존적으로 양호한 항암효과를 보여주고 있음을 알 수 있었다. 따라서 갈근의 MeOH 추출물을 상법에 따라 용매분획을 실시하여 얻은 각 분획을 각종 chromatography를 통하여 정제한 결과 최종적으로 10종의 성분들을 분리하였다. 본 보에서는 이들 10종의 성분들의 이화학적 성상 및 기기분석 자료를 통한 화학구조의 규명 및 각 화합물들의 인체유래 암세포주에 대한 세포증식저해효과를 보고하고자 한다.
반면에 13C-NMR data를 면밀히 조사하여본 결과 두 개의 aromatic ring과 한 개의 furan ring, 한 개의 glucoside가 결합된 부분구조를 추측할 수 있었으며, 최종적으로 문헌17)과 비교하여 화합물 9는 (+)-puerol-B 2-O-β-glucopyranoside로 확인하였다.
한편, 분리 정제된 각 화합물 (1~10)을 각각 SRB (Sulfrhodamine B) bioassay에 준하여 A549 (비소세포폐암주), SK-OV-3 (난소암주), SK-MEL-2 (피부종양주) 및 HCT-15 (직장종양주) 등 4종의 human tumor cells에 대한 시험관내 암세포 증식저해 효과를 검색하여 본 결과 이 중 화합물 1, 3~6 등이 각각의 암세포주에 대하여 IC50 (50%세포증식저해 효과를 나타내는 농도)치는 대조약물 doxorubicin에 비하여 현저하게 낮지만 농도 의존적으로 우수한 세포증식저해효과를 보여주었다 (Table I).
화합물 10는 1H-NMR과 13C-NMR data를 통해 daidzin (화합물 8)의 4’ 위치의 hydroxy 기가 methoxy 기로 치환된 구조라는 것을 알 수 있었고, 표품과 비교하여 formononetin-7-O-β-glucopyranoside으로 확인하였다.
화합물 1은 흰색분말로 1H-NMR spectrum 및 13C-NMR spectrum을 검토하고 표품과 비교한 결과 lupeol로 동정하였다.10) 화합물 2는 무색 무정형결정으로 1H-NMR 등 분광학적 data를 문헌11)과 비교한 결과 β-sitosterol로 확인되었다.
10) 화합물 2는 무색 무정형결정으로 1H-NMR 등 분광학적 data를 문헌11)과 비교한 결과 β-sitosterol로 확인되었다. 화합물 3은 미황색 분말로서 1H-NMR과 13C-NMR data를 문헌12)과 비교하여 본 결과 biochanin A 로 동정할 수 있었다. 화합물 4 역시 미황색 분말로서 1H-NMR spectrum 및 13C-NMR spectrum을 검토하고 표품과 비교한 결과 (-)-tuberosin 으로 동정하였다.
화합물 3은 미황색 분말로서 1H-NMR과 13C-NMR data를 문헌12)과 비교하여 본 결과 biochanin A 로 동정할 수 있었다. 화합물 4 역시 미황색 분말로서 1H-NMR spectrum 및 13C-NMR spectrum을 검토하고 표품과 비교한 결과 (-)-tuberosin 으로 동정하였다.13) 한편 화합물 5는 황갈색 분말로서 문헌14)과 비교하여 본 결과 calycosin과 일치함을 알 수 있었다.
12,15) 화합물 7의 spectral data를 문헌16)치와 정밀 비교분석하여 본 결과, daidzein (화합물 6)의 8번 carbon에 glucose가 결합된 C-배당체인 puerarin으로 확인할 수 있었다. 화합물 8은 흰색분말로서 1H-NMR과 13C-NMR data를 표품과 비교하여 본 결과 daidzein (화합물 6)의 7번 hydroxy 기에 glucose가 결합된 daidzin으로 확인하였다.13) 화합물 9는 1H-NMR spectrum에서 isoflavonoid의 1H-NMR spectrum과 비슷한 양상을 보였으나, isoflavonoid 의 1H-NMR spectrum에서 특징적으로 관찰되는 2번 proton signal (8.
13) 한편 화합물 5는 황갈색 분말로서 문헌14)과 비교하여 본 결과 calycosin과 일치함을 알 수 있었다. 흰색 분말인 화합물 6은 1H-NMR과 13C-NMR data를 표품과 비교한 결과 갈근의 주성분의 일종인 daidzein으로 확인할 수 있었다.12,15) 화합물 7의 spectral data를 문헌16)치와 정밀 비교분석하여 본 결과, daidzein (화합물 6)의 8번 carbon에 glucose가 결합된 C-배당체인 puerarin으로 확인할 수 있었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
갈근은 무엇인가?
갈근 (葛根, Pueraria thunbergiana Benth)은 콩과(Leguminosae)에 속하는 여러해살이 낙엽덩굴성 식물 칡의 뿌리로서 한방에서는 발한, 해열에 사용되어 왔다. 주요 성분으로는 isoflavonoid 계열의 daidzin, daidzein, puerarin, genistein, formononetin 등이 알려져 있으며 triterpenoid 계열의 soyasapogenol A 및 kudzusapogenol B, 그리고 polysaccharide, coumarin 계열의 물질들이 보고되고 있다.
갈근의 flavonoid 성분은 어떤 효능이 있는것으로 보고 되어 있는가?
주요 성분으로는 isoflavonoid 계열의 daidzin, daidzein, puerarin, genistein, formononetin 등이 알려져 있으며 triterpenoid 계열의 soyasapogenol A 및 kudzusapogenol B, 그리고 polysaccharide, coumarin 계열의 물질들이 보고되고 있다.1,2)갈근의 flavonoid 성분은 관상동맥 확장, 심장 근육의 산소 소모량 감소, 혈소판의 응집 억제에 대해 보고되어 있다.3)갈근의 또 다른 약리활성에 대한 연구로는 helicobacter pylori균의 저해활성,4) 장내세균의 활성화 효과,5) 항산화 효과,6)알콜성 간 손상 보호 효과,7) allelopathy 작용,8)해독작용, 면역력 증강 등의 효능을 보이는 것으로 알려졌다.
갈근의 주요성분은 무엇인가?
갈근 (葛根, Pueraria thunbergiana Benth)은 콩과(Leguminosae)에 속하는 여러해살이 낙엽덩굴성 식물 칡의 뿌리로서 한방에서는 발한, 해열에 사용되어 왔다. 주요 성분으로는 isoflavonoid 계열의 daidzin, daidzein, puerarin, genistein, formononetin 등이 알려져 있으며 triterpenoid 계열의 soyasapogenol A 및 kudzusapogenol B, 그리고 polysaccharide, coumarin 계열의 물질들이 보고되고 있다.1,2)갈근의 flavonoid 성분은 관상동맥 확장, 심장 근육의 산소 소모량 감소, 혈소판의 응집 억제에 대해 보고되어 있다.
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