[논문]Lipopolysaccharide로 활성화된 마우스 대식세포에서 애엽(艾葉) 물추출물의 면역활성 연구

박완수

doi:10.6116/kjh.2009.24.1.151

[국내논문] Lipopolysaccharide로 활성화된 마우스 대식세포에서 애엽(艾葉) 물추출물의 면역활성 연구
Effect of Water Extract from Artemisiae Argi Folium on Mouse Macrophage Stimulated by LPS 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.24 no.1, 2009년, pp.151 - 157

박완수 (경원대학교 한의과대학 병리학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : The purpose of this study is to investigate the effect of Water Extract from Artemisiae Argi Folium (WAAF) on mouse macrophage Raw 264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide (LPS). Methods : Cell viabilities were measured by MTT assay. And the intracellular productions of hydrogen peroxide (H2O2) were measured by dihydrorhodamine 123 assay. TNF-$\alpha$ and IL-6 production from Raw 264.7 were measured by ELISA method. Results : The results of the experiment are as follows. 1. WAAF significantly increased the cell viability compared to the control group (treated with LPS only) at the concentrations of 10, 50, 100, 200, 400 ug/mL. 2. WAAF significantly increased the intracellular production of H2O2 compared to the control group at the concentrations of 50, 100, 200 ug/mL. 3. WAAF significantly decreased the production of TNF-$\alpha$ compared to the control group at the concentrations of 100, 200 ug/mL. 4. WAAF significantly decreased the production of IL-6 compared to the control group at the concentrations of 50, 100, 200 ug/mL. Conclusions : WAAF could be supposed to have the immune-modulating activity related with the macrophage's immunoactivity.

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AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

본 연구에서는 온경지혈약(溫經止血藥)으로 분류되면서, 소복냉통(少腹冷痛), 월경부조, 궁랭불잉(宮冷不孕), 토혈(吐血), 뉵혈(衄血), 붕루경다(崩漏經多) 등을 치료하는 데 사용되는 애엽(Artemisiae Argi Folium; dry leaf of Artemisia argyi Levl. et Vant.)^9,10)의 물추출물이 Lipopolysaccharide(LPS)로 활성화된 마우스 대식세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 in vitro 실험을 수행하고 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
LPS로 활성화된 Raw 264.7 cells의 TNF-α와 IL-6 생성과 관련된 시료의 영향을 알아보기 위해 다음과 같이 실험을 시행한다.
그러므로 여러 가지 산화적 반응을 일으키는 물질들로 인해 mouse의 대식세포내에서 대량으로 발생 하는 hydrogen peroxide의 수준을 dihydrorhodamine 123 assay을 이용하여 측정할 수 있다. 본 실험에서는 LPS에 의해 유발하는 세포내 H₂O₂ 생성감소에 대한 시료의 영향을 측정하였다. 96 well plate에 1×104 cells/well의 농도로 분주되도록 1×105 cells/mL의 cell을 100 uL씩 넣고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간동안 배양한 후, 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 씻어주었다.
본 연구에서는 인체 면역체계에 있어 중요한 역할을 담당하는 대식세포의 면역활성과 관련하여 LPS로 마우스 대식세포의 생존율 감소, 세포 내 hydrogen peroxide 생성 억제, 염증유발 cytokine인 TNF-α와 IL-6 생성 증가를 유발하고, 이에 대한 艾葉 물추출물(WAAF)의 영향을 알아보기 위해 실험을 수행하였다.
본 연구에서 LPS로 유발되는 마우스 대식세포의 생존율감소, hydrogen peroxide 생성억제, TNF-α와 IL-6의 생성증가에 대한 애엽(艾葉) 물추출물 WAAF 가 미치는 영향을 알아보기 위한 실험을 수행한 결과 다음을 알 수 있었다.

제안 방법

96 well plate에 1×104 cells/well의 농도로 분주되도록 1×105 cells/mL의 cell을 100 uL씩 넣고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간동안 배양한 후, 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 씻어주었다. LPS(2 ug/mL) 단독 혹은 배지에 녹인 시료(10, 50, 100, 200, 400 ug/mL)와 함께 각 well에 처리하고 3시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 뒤 배양액을 제거하고 배지에 녹인 1 mg/mL MTT (Sigma, MO, USA)를 100 uL씩 각 well에 처리한 후 알루미늄호일로 차광시킨 후 2시간 동안 같은 조건에서 배양하였다.
세포내 hydrogen peroxide (H₂O₂) 생성은 Roesler 등^15-19)의 방법을 응용, dihydrorhodamine 123 (DHR) assay를 실시하여 측정하였다. DHR은 비형광이지만 세포 내에서 세포 내 H₂O₂에 의하여 산화되어 녹색의 형광을 발현하는 물질인 rhodamine 123 (R123)로 바뀌게 된다.
배양 후 상층액을 채취하여 ELISA 법을 이용, 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 TNF-α와 IL-6 생성에 대한 시료의 영향을 비교하였다.
LPS(2 ug/mL)와 함께 WAAF(10, 50, 100, 200, 400 ug/mL)가 포함된 배지에 Raw 264.7 cells을 3시간 동안 배양한 결과 LPS로 인한 세포생존율 감소를 10 ug/mL 이상의 농도에서 각각 122.83, 141.86, 181.83, 228.46, 325.53%로 유의(p < 0.05)하게 증가시켰다(Fig. 1).

대상 데이터

본 실험에 사용된 시약 중 Lipopolysaccharide (LPS), Tetrazolium salt 3,[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- 2,5-dyphenyl tetrazolium bromide(MTT)와 Dimethyl Sulfoxide (DMSO), dihydrorhodamine 123(DHR) 등은 Sigma사(ST. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, ELISA kit for TNF-α, IL-6는 Endogen제품을 사용하였다.
각시약의 품질은 분석용 등급 이상의 것으로 하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 기기는 rotary vacuum evaporator (Eyela, Tokyo, Japan), freeze dryer(Eyela, Tokyo, Japan), deep freezer(Revco, NC, USA), microplate reader(Bio-Rad, CA, USA) 등이다.
본 실험에 사용된 약재 애엽(Artemisiae Argi Folium)은 한국 서해안에서 채취하여 검정한 후 사용하였으며, 검정된 약재들은 경원대학교 한의과대학 병리학교실에 보관되었다.
한국의 서해안에서 뿌리만 제거된 상태로 채취된 황해쑥(Artemisia argyi Levl. et Vant.)을 그늘에서 건조한 후, 잎부분 50 g을 따로 수집하여 전기약탕기에 1차 증류수 1,000 mL와 함께 넣은 뒤 150분 동안 가열, 추출하였다. 추출액을 filter paper로 감압 여과한 뒤, 여과액을 rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축하였다.
추출액을 filter paper로 감압 여과한 뒤, 여과액을 rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축하였다. 이 농축액을 동결건조기를 이용, 건조 하여 6 g(수득률 12%)의 애엽 물추출물(Water Extract of Artemisiae Argi Folium ; WAAF)을 얻어 시료로 사용하였다.
실험에 사용된 대식세포는 mouse macrophage (Raw 264.7 cell line)이며, 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 구입하였다.

데이터처리

실험성적은 평균치 ± 표준편차(Mean ± S.D.)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균 차이는 Student t-test와 ANOVA test로 분석하여 p < 0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

이론/모형

준비된 시료가 LPS에 의해서 유발되는 세포 생존율 감소에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Mosmann 등^11-14)의 방법을 응용하여 MTT assay를 실시하였다. 96 well plate에 1×104 cells/well의 농도로 분주되도록 1×105 cells/mL의 cell을 100 uL씩 넣고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간동안 배양한 후, 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 씻어주었다.

성능/효과

LPS (2 ug/mL)와 함께 WAAF (50, 100, 200 ug/mL)가 포함된 배지에 Raw 264.7 cells을 3시간 동안 배양한 결과, LPS에 의해 유발된 세포 내 H2O2 생성감소를 각각 229.0, 245.5, 277.9%로 유의(p < 0.05)하게 증가시켰다(Fig. 2).
LPS(2 ug/mL)와 함께 WAAF(10, 50, 100, 200, 400 ug/mL)가 포함된 배지에 Raw 264.7 cells을 3시간 동안 배양한 결과, LPS로 인한 세포생존율 감소를 10 ug/mL 이상의 농도에서 각각 122.83, 141.86, 181.83, 228.46, 325.53%로 유의(p < 0.05)하게 증가시키는 것으로 나타났으며, 특히 50 ug/mL 이상의 농도에서는 normal군에 비해서도 더 증가하는 것으로 나타나 WAAF가 대식세포 자체의 생존율을 증가시키 것으로 해석될 수 있으며, 이러한 생존율 증가는 대식세포의 감소와 관련된 면역력 약화 증상에 애엽이 응용될 수 있음을 의미하는 것이라 할 수 있다(Fig. 1).
LPS(2 ug/mL)와 함께 WAAF(50, 100, 200 ug/mL) 가 포함된 배지에 Raw 264.7 cells을 3시간 동안 배양한 결과, LPS에 의해 유발된 세포내 H2O2 생성감소를 각각 229.0, 245.5, 277.9%로 유의(p < 0.05)하게증가시켰다(Fig. 2).
LPS (2 ug/mL)와 함께 WAAF (50, 100, 200 ug/mL) 가 포함된 배지에 Raw 264.7 cells을 3시간 동안 배양한 결과, LPS에 의해 유발된 세포의 IL-6의 생성증가를 50 ug/mL 이상의 농도에서 모두 유의(p < 0.05)하게 감소시켰다(Fig. 4).
LPS (2 ug/mL)와 함께 WAAF (50, 100, 200 ug/mL)가 포함된 배지에 Raw 264.7 cells을 3 h 동안 배양한 결과, LPS에 의해 유발된 세포의 TNF-α의 생성증가를 100, 200 ug/mL의 농도에서 유의(p <0.05)하게 감소시켰으며(Fig. 3), LPS(2 ug/mL)와 함께 WAAF (50, 100, 200 ug/mL)가 포함된 배지에 Raw 264.7 cells을 3 h 동안 배양한 결과에서는 LPS 에 의해 유발된 세포의 IL-6의 생성증가를 50 ug/mL 이상의 농도에서 모두 유의(p < 0.05)하게 감소시키는 것으로 나타났다(Fig. 4).
4. LPS (2 ug/mL)와 함께 WAAF (50, 100, 200 ug/mL)가 포함된 배지에 Raw 264.7 cells을 3 h 동안 배양한 결과에서는 LPS에 의해 유발된 세포의 IL-6의 생성증가를 50 ug/mL 이상의 농도에서 모두 유의(p < 0.05)하게 감소시키는 것으로 나타났다.
3. LPS (2 ug/mL)와 함께 WAAF (50, 100, 200 ug/mL)가 포함된 배지에 Raw 264.7 cells을 3 h 동안 배양한 결과, LPS에 의해 유발된 세포의 TNF-α의 생성증가를 100, 200 ug/mL의 농도에서 유의(p < 0.05)하게 감소시켰다.
2. WAAF는 LPS에 의해 유발된 세포내 H2O2 생성 감소을 3시간의 배양에서는 50, 100, 200 ug/mL의 농도에서 각각 229.0, 245.5, 277.9%로 유의(p <0.05)하게 증가시켰다
1. WAAF는 LPS에 의해 유발된 마우스 대식세포의 생존율감소를 50 ug/mL의 농도(3 h 배양)에서 모두 유의(p < 0.05)하게 증가시켰다
2). 이 결과는 WAAF가 대식세포의 hydrogen peroxide 생성감소와 연계되는 류마티스성 관절염 등의 자가면역질환 증상개선의 가능성이 있음을 의미한다. 더욱이 H₂O₂와 같은 radical은 대식세포가 병원체를 포식하는 작용에 있어서 필수적인 요소이므로, WAAF가 대식세포의 H₂O₂의 생성을 증가시킴으로써 식균작용을 강화시킨다고 할 수 있다.

후속연구

이상과 같은 실험결과로 WAAF가 대식세포의 활성산소종 감소로 인한 류마티스성 관절염 증상악화를 완화함과 염증매개단백질 생성억제를 통한 염증억제의 효능이 있음을 알 수 있었으며, 면역질환치료제로서의 개발을 위해 앞으로 보다 정밀한 연구가 필요한 것으로 사료된다.
이상의 실험결과는 WAAF가 대식세포와 관련된 자가면역질환, 과잉염증질환의 증상개선제로서의 응용가능성이 있음을 나타내는 것이며, 앞으로 면역질환치료제로서의 개발을 위하여 보다 심도 깊은 연구가 필요한 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	자가면역질환은 무엇이며, 그 원인은 어떠한가?	자가면역질환(自家免疫疾患; autoimmune disease) 이란 인체 내의 면역체계가 정상적이면서 건강한 자신의 조직, 기관, 세포 등을 공격하는 질환을 의미하는 것으로, 아직까지 그 원인이나 자세한 기전에 대해서는 완전히 밝혀지지 않았으며 유전적 요소, 환경의 영향, 호르몬 분비이상 등이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다1,2). 자가면역질환은 전신성 질환과 기관국한성질환으로 나뉘는데, 전신성 질환이란 자가면역반응의 대상이 되는 항원이 전신의 기관에 존재 하는 것이며, 기관국한성 질환이란 체내에 있는 기관중 어느 하나의 기관에 있는 항원에만 작용하는 면역질환이다.
	자가면역질환 중 전신성 질환과 기관국한성 질환에는 어떤 것들이 있는가?	자가면역질환은 전신성 질환과 기관국한성질환으로 나뉘는데, 전신성 질환이란 자가면역반응의 대상이 되는 항원이 전신의 기관에 존재 하는 것이며, 기관국한성 질환이란 체내에 있는 기관중 어느 하나의 기관에 있는 항원에만 작용하는 면역질환이다. 전신성 자가면역질환에는 전신성 홍반성 낭창, 류마티스성 관절염, 다발성 근염, 피부경화증 등이 있으며, 기관국한성 자가면역질환에는 중증근무력증(myasthenia gravis), 아디손병(addisons disease;부신피질기능부전병) 등이 있다3,4). 이러한 질환들은 면역체계이상의 원인을 완전히 알 수 없기 때문에 치료는 주로 염증반응의 억제에 중점을 두고 있다.
	류마티스성 관절염으로 인한 초기 증상은 어떠한가?	류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis; 만성염증성 관절염)은 대표적인 자가면역질환의 하나로서 신체의 결합조직, 특히 관절부위에 염증이 나타나는 질환이지만 전신질환이므로 신체 어느 곳에나 증세가 나타날 수 있고 여러 가지 전신 증상을 동반한다. 초기에는 주로 다발성 관절통, 즉 무릎, 발목, 발가락, 팔꿈치, 손목, 손가락 등의 관절부위에 통증이 나타나며 손가락 마디가 방추형으로 부으면서 통증이 생길 수도 있다. 이러한 증세들은 만성적으로 진행되어 차츰 관절의 변형, 종창, 근육위축 그리고 관절파괴 등을 일으키게 된다5,6).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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