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문제 정의
- 본 연구에서 분리 배양한 세포가 줄기세포의 특징을 가지고 있는지에 대해 알아보았다. 첫 번째로 세포 표면 표시자들의 발현을 살펴본 결과, 중간엽줄기세포에서 발현되는 CD29, CD73, CD90, CD105(Cellerix Patent US20060073124)와 상피세포에서 발현되는 CD9와 CD49f가 발현되었으며, 조혈모줄기세포 표시자인 CD31, CD34, CD45, CD133가 발현되지 않음을 확인하였다.
- 하지만 분만 직후에 얻어진 양막과 달리 본 연구에 사용된 냉장보관된 양막에서는 트립신만을 사용한 결과, 양막에 점액질이 많아 양막상피세포의 수득율이 현저히 낮았다. 이러한 문제점을 해결하고자 본 연구에서 디티오트레이톨을 사용하여 점액질을 효과적으로 제거하여 초기배양에서 양막상피세포의 수득율을 높이고 생존율을 높였다.
- 따라서, 임상 적용 가능한 수준의 양막상피세포를 얻으려면 초기 양막으로부터 상피세포를 많이 얻은 디티오트레이톨 처리 방법과 함께 양막상피세포를 미분화 상태로 유지하며 세포의 노화를 방지하고 세포 사멸 과정으로 진행하는 것을 막아 세포를 증식시킬 수 있는 배양 방법이 필요할 것이다. 이에 양막상피세포를 세포 사멸을 억제하면서 대량으로 증식 배양할 수 있는 방법을 찾고자 하였다. 2007년 Kiichi Watanabe 등은 ROCK 저해제가 단일세포로 분리된 사람유래 배아줄기세포의 세포사멸을 억제하고 세포의 생존율을 높여주며 분화진행으로부터 보호한다고 보고하였다.
제안 방법
- 1차 항체는 Oct-4, SSEA 4, Tra-1-60, Tra-1-81 및 Cytokeratin(Pan-CK)(Invitrogen, USA; BD Pharmingen, USA; R&D system, USA)을 사용하여 줄기세포 표시자 및 상피세포 표시자를 확인하였다.
- 4-well chamber slide(Nunc, Denmark)에서 배양한 양막상피세포의 배지를 제거하고, DPBS로 1회당 3분간 3회 세척하였다. 4% paraformaldehyde가 들어간 DPBS를 넣어주고 4℃에서 60분간 고정하였다.
- 4% paraformaldehyde가 들어간 DPBS를 넣어주고 4℃에서 60분간 고정하였다. DPBS로 1회당 3분씩 3회 세척한 후 0.1% Triton-X100을 함유한 DPBS로 실온에서 10분간 반응하며 permeabilization시켰다. DPBS로 동일한 세척과정을 거치고 5% serum을 함유한 DPBS로 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
- Fig. 3에서 보는 바와 같이 11가지의 항체를 이용하여 양막상피세포의 표면 양성, 음성 표시자를 확인하였다. CD9, CD29, CD49f, CD73, CD90, CD105에서 양성반응을 보였으며, CD31, CD34, CD45, CD133, HLA-DR에서 음성반응을 보였다.
- ROCK 저해제의 농도에 따른 양막상피세포의 증식능을 확인하기 위하여 디티오트레이톨과 trypsin-EDTA를 이용하여 조직에서 얻어진 양막상피세포의 배양에 있어서 동일한 기본 배지에 ROCK 저해제 농도를 100 μM, 10 μM, 1 μM, 100 nM 또는 10 nM로 첨가하여 배양하며 관찰하였다.
- 이후에 1차 걸러진 용액을 다시 100 ㎛ cell strainer(BD Falcon, USA)를 이용하여 남은 조직과 찌꺼기를 제거하였다. 걸러진 용액을 원심분리하여 세포를 얻은 다음 Hemocytometer를 이용하여 Trypan Blue Dye법으로 현미경상에서 육안으로 관찰되는 살아있는 세포들을 계수하였다.
- 4A). 그리고 배아줄기세포의 전능성 표시자로 알려진 Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA 4 등의 발현도 확인하였다. 배아줄기세포 표시자와 함께 양막상피세포는 상피세포임을 확인할 수 있는 Cytokeratin(Pan-CK; CAM5.
- 지방세포분화는 3주간의 분화유도 후에 Oil red O 염색법을, 골형성유도는 2주간의 분화유도 후에 Alizarin red S 염색법을 이용하여 각각 분화여부를 확인하였다. 근육세포분화는 3주간의 유도, 신경세포분화는 2주간의 분화유도 후에 면역염색법을 이용하여 각각에 맞는 항체를 선택하여 분화 여부를 확인하였다.
- 디티오트레이톨과 trypsin-EDTA로 처리하여 얻어진 양막상피세포의 배양에 있어서 ROCK inhibitor의 농도에 따른 양막상피세포의 증식능을 확인하기 위하여 동일한 기본배지에 ROCK inhibitor 농도를 100 μM, 10 μM, 1 μM, 100 nM 또는 10 nM로 첨가하여 배양하며 관찰하였다.
- 디티오트레이톨과 trypsin-EDTA를 이용하여 조직으로부터 분리해 낸 양막상피세포를 4×106개 세포씩 두 개의 T75-flask에 넣고 10μM ROCK 저해제를 첨가한 배지와 첨가하지 않은 배지를 각각 넣어 배양하였다.
- 디티오트레이톨과 trypsin-EDTA를 처리하여 얻어진 세포는 우태아 혈청을 함유한 RAEM(RNL BIO, Korea) 배지를 이용하여 T75-플라스크에서 배양을 시작하였고, 다음날 세포가 붙은 정도를 현미경으로 확인 후, DPBS(Welgene, Korea)를 이용하여 부착되지 않은 세포와 찌꺼기를 제거하고 RAEM을 새로 공급하였다. 세포가 배양 플라스크(Nunc, Denmark)에 100% 자랄 때까지 매일 배지를 교환하였다.
- 디티오트레이톨과 trypsin-EDTA를 처리하여 얻어진 양막상피세포를 T75-flask에 4×106 세포수로 넣고 ROCK 저해제를 첨가한 배지와 첨가하지 않은 배지로 배양을 하면서 세포의 배양상태를 관찰하였다.
- , 1998)에서 사용한 것처럼 일반적인 사용 농도인 10 mM을 사용하여 세포의 사멸을 방지하고, 수득율을 높일 수 있었다. 또한 디티오트레이톨 및 트립신을 이용한 화학적인 절차뿐만 아니라, 추가로 vortex mixer를 이용하여 물리적인 힘을 더하여 줌으로써 기저막으로부터 화학적인 반응에 의해 미쳐 떨어져 나오지 못한 상피세포들이 떨어질 수 있도록 하였다. 기존의 보고에 따르면, 양막 전체를 사용하여 평균 약 1억 개의 세포를 초기에 분리해 낼 수 있다고 하였는데(Miki et al.
- , 1998). 반응이 끝난 양막 조직을 다시 HBSS를 이용하여 수 차례 세척하고 양막에 붙은 점액질이 충분히 제거되었는지 육안으로 확인하였다.
- 배양한 양막상피세포를 TrypLE-ExpressTM(Gibco, USA)을 이용하여 수거하여 FACS 분석을 위한 프로토콜에 따라 세포를 5% serum(2.5% NGS, 2.5% NHS, 각 Vector, USA)과 1% paraformaldehyde(Junsei, Japan)가 들어간 DPBS에 넣어 4℃에서 90분간 blocking 및 고정하였다. 세포를 분석하고자 하는 항체 개수만큼 일정하게 나누고 각각에 형광물질이 붙은 1차 항체인 CD9, CD29, CD49f, CD73, CD90, CD105, CD31, CD34, CD45, CD133 또는 HLA-DR 항체(BD Pharmingen, USA)를 넣어주고 4℃에서 60분간 반응하였다.
- 세포를 분석하고자 하는 항체 개수만큼 일정하게 나누고 각각에 형광물질이 붙은 1차 항체인 CD9, CD29, CD49f, CD73, CD90, CD105, CD31, CD34, CD45, CD133 또는 HLA-DR 항체(BD Pharmingen, USA)를 넣어주고 4℃에서 60분간 반응하였다. 비특이적 항체 반응을 방지하고 잔존할 항체를 제거하기 위해 DPBS를 이용하여 3회 세척과정을 거친 후 유세포 분석기인 FACSCaliburTM(BD, USA)와 CellQuestTM 분석 프로그램을 이용하여 각 항체들에 대한 세포분석을 실시하였다.
- 5% NHS, 각 Vector, USA)과 1% paraformaldehyde(Junsei, Japan)가 들어간 DPBS에 넣어 4℃에서 90분간 blocking 및 고정하였다. 세포를 분석하고자 하는 항체 개수만큼 일정하게 나누고 각각에 형광물질이 붙은 1차 항체인 CD9, CD29, CD49f, CD73, CD90, CD105, CD31, CD34, CD45, CD133 또는 HLA-DR 항체(BD Pharmingen, USA)를 넣어주고 4℃에서 60분간 반응하였다. 비특이적 항체 반응을 방지하고 잔존할 항체를 제거하기 위해 DPBS를 이용하여 3회 세척과정을 거친 후 유세포 분석기인 FACSCaliburTM(BD, USA)와 CellQuestTM 분석 프로그램을 이용하여 각 항체들에 대한 세포분석을 실시하였다.
- 2007년 Kiichi Watanabe 등은 ROCK 저해제가 단일세포로 분리된 사람유래 배아줄기세포의 세포사멸을 억제하고 세포의 생존율을 높여주며 분화진행으로부터 보호한다고 보고하였다. 양막상피세포 역시 배아줄기세포에 견줄 수 있는 줄기세포로서의 특성을 갖고 있으며, 단일세포로 분리 후에는 세포 사멸 과정이 급격히 진행되는 특성을 갖고 있기 때문에, 본 연구자들은 양막상피세포의 증식 및 미분화상태의 유지를 위해 배아줄기세포 배양에 이용된 ROCK 저해제를 디티오트레이톨을 처리하여 분리된 양막상피세포의 증식 배양 연구에 적용하였다. ROCK 저해제는 세포 사멸을 억제하는 기능을 하는 물질로서, 신경돌기의 재생, 미오신 인산화 및 평활근 수축에 있어 작용-유도성 Ca2+ 증감(agonist-induced Ca2+ sensitization)의 억제 등의 기능을 하고(Sward et al.
- 양막상피세포를 지방세포, 골세포, 근육세포, 신경세포로 분화하기 위해 각각의 분화용 배지를 사용하여 분화를 유도하고, 각 분화결과에 대한 확인과 분석은 지방세포분화의 경우, 3주간의 분화유도 후에 Oil red O 염색법을, 골형성유도는 2주간의 분화유도 후에 Alizarin red S 염색법을, 근육세포분화는 3주간의 유도, 신경세포분화는 2주간의 분화유도 후에 면역염색법을 이용하여 실시하였다. 중배엽 유래의 골세포 및 지방세포, 근육세포로의 분화능을 확인하였고, 외배엽유래의 신경세포로의 분화능 역시 확인하였다.
- 양막상피세포를 지방세포분화유도배지(AipoDiffTM, Miltenyi, Germany), 골형성유도배지(OsteoDiffTM, Miltenyi, Germany), 근육세포분화배지(Skeletal Muscle cell medium, LONZA, USA), 신경세포분화유도배지(Neural Progenitor media systems, LONZA, USA)를 사용하여 각각의 회사에서 제공하는 프로토콜에 따라 분화를 유도하였다. 지방세포분화는 3주간의 분화유도 후에 Oil red O 염색법을, 골형성유도는 2주간의 분화유도 후에 Alizarin red S 염색법을 이용하여 각각 분화여부를 확인하였다.
- 반응이 끝난 양막 조직을 다시 HBSS를 이용하여 수 차례 세척하고 양막 조직을 수술용 가위를 이용하여 잘게 잘라내었다. 잘게 잘라진 양막 조직을 새로운 0.05% trypsin-EDTA를 함유한 DMEM(Gibco, USA) 배지를 이용하여 37℃ 인큐베이터에서 40～60분간 교반하며 반응시켰다. 화학적으로 분해된 조직을 1분간 vortexing한 후 1 ㎜ mesh에 1차로 걸러주어 남은 조직을 제거하였다.
- 점액질이 제거된 양막조직을 수술용 가위를 이용하여 잘게 잘라내고 0.05% trypsin-EDTA를 함유한 DMEM(Gibco, USA) 배지를 이용하여 37℃ 인큐베이터에서 40～60분간 교반하며 반응시켰다. 화학적으로 분해된 조직을 1분간 vortexing한 후 1 ㎜ mesh에 1차로 걸러주어 남은 조직을 제거하였다.
- 양막상피세포를 지방세포, 골세포, 근육세포, 신경세포로 분화하기 위해 각각의 분화용 배지를 사용하여 분화를 유도하고, 각 분화결과에 대한 확인과 분석은 지방세포분화의 경우, 3주간의 분화유도 후에 Oil red O 염색법을, 골형성유도는 2주간의 분화유도 후에 Alizarin red S 염색법을, 근육세포분화는 3주간의 유도, 신경세포분화는 2주간의 분화유도 후에 면역염색법을 이용하여 실시하였다. 중배엽 유래의 골세포 및 지방세포, 근육세포로의 분화능을 확인하였고, 외배엽유래의 신경세포로의 분화능 역시 확인하였다.
- , Miltenyi, Germany), 근육세포분화배지(Skeletal Muscle cell medium, LONZA, USA), 신경세포분화유도배지(Neural Progenitor media systems, LONZA, USA)를 사용하여 각각의 회사에서 제공하는 프로토콜에 따라 분화를 유도하였다. 지방세포분화는 3주간의 분화유도 후에 Oil red O 염색법을, 골형성유도는 2주간의 분화유도 후에 Alizarin red S 염색법을 이용하여 각각 분화여부를 확인하였다. 근육세포분화는 3주간의 유도, 신경세포분화는 2주간의 분화유도 후에 면역염색법을 이용하여 각각에 맞는 항체를 선택하여 분화 여부를 확인하였다.
- 태반으로부터 분리해낸 양막조직 5 g을 정량하여 세척 후 디티오트레이톨 처리군과 처리하지 않는 군으로 나누어 각각 세포를 분리하였다. 10 mM 디티오트레이톨을 30분간 상온에서 처리한 후 조직을 잘게 자르고 0.
- 태반을 연구실로 옮겨온 후 태반으로부터 양막을 벗겨 내고, HBSS(Gibco, USA)에 넣어 수 차례 세척하여 혈액을 제거하였다. 양막조직을 5 g 정량하여 잘라내고 10 mM 디티오트레이톨(Gibco, USA)을 첨가한 HBSS에 넣어 30분간 상온에서 반응시켰다(Grossmann et al.
대상 데이터
- 사람 태반은 고려대학교 임상실험윤리위원회의 지침서에 따라 고려대학교 부속 구로병원에서 정상분만과 제왕절개를 통한 분만 후에 얻어진 태반을 수집하여 실험에 사용하였다. 실험에 필요한 양막조직은 태반으로부터 벗겨내어 분리하였으며(Miki et al.
이론/모형
- The cultured cells were trypsinized, fixed and incubated with antibodies of cell surface markers. The expression of surface protein was analyzed by FACS assay. FACS histogram for surface markers demonstrated that CD9, CD29, CD49f, CD73, CD90, or CD105 were positively expressed, and CD31, CD34, CD45, CD133, or HLA-DR were negatively expressed.
- 양막상피세포를 임상적으로 사용 가능한 수로 증식 배양하는 방법을 찾고자 본 연구자들은 기존에 보고된 장관상피세포의 사멸을 억제하는 방법(Grossmann et al., 1998)을 본 실험에 적용하였다. 통상적으로 태반에서 분리된 양막은 혈액과 점액질 등으로 표면이 둘러싸이게 된다.
성능/효과
- 10 mM 디티오트레이톨을 30분간 상온에서 처리한 후 조직을 잘게 자르고 0.05% trypsin-EDTA DMEM 용액에서 교반하며 세포를 분리하고 Hemocytometer를 이용하여 Trypan Blue Dye 염색법으로 세포수를 계수한 결과 3.7×107개의 세포를 얻을 수 있었다.
- 3에서 보는 바와 같이 11가지의 항체를 이용하여 양막상피세포의 표면 양성, 음성 표시자를 확인하였다. CD9, CD29, CD49f, CD73, CD90, CD105에서 양성반응을 보였으며, CD31, CD34, CD45, CD133, HLA-DR에서 음성반응을 보였다.
- The expression of surface protein was analyzed by FACS assay. FACS histogram for surface markers demonstrated that CD9, CD29, CD49f, CD73, CD90, or CD105 were positively expressed, and CD31, CD34, CD45, CD133, or HLA-DR were negatively expressed.
- 배양 1일차, 2일차, 3일차 모두 현미경을 통하여 육안으로 세포의 상태를 확인하였다. Fig. 2A에서와 같이 ROCK 저해제를 넣어 배양한 양막상피세포는 세포의 노화와 사멸이 억제되면서 증식율이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었고, ROCK 저해제를 첨가하지 않은 군에서는 세포의 노화와 사멸과정이 진행되며, 세포의 증식이 상당히 억제되어 잘 자라지 않는 것을 확인할 수 있었다.
- Fig. 2B에서 보는 바와 같이 10 nM 농도 이하의 ROCK 저해제를 처리한 경우는 처리하지 않은 대조군과 차이가 거의 보이지 않았고, 100 μM 농도에서는 세포의 증식이 현저하게 향상되는 것은 확인되지만, 세포의 변형이 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
- 가장 세포의 상태를 좋게 유지시키면서 증식률이 유지되는 농도는 10 μM 임을 확인할 수 있었다.
- HLA-DR이 발현되지 않음이 확인되었는데, 이러한 점은 다른 줄기세포와 마찬가지로 양막상피세포도 면역거부 반응이 덜 일어날 수 있는 가능성을 말해주고 있다. 두 번째로, 줄기세포의 가장 특징적인 분화능력을 살펴본 결과, 본 연구에서 배양된 양막상피세포가 외배엽유래의 신경세포와 중배엽 유래의 근육세포, 지방세포 및 골세포로 분화되었다. 마지막으로 본 실험에서 얻어진 세포의 경우 상피세포의 표시자인 cytokeratin(Pan-CK)의 발현을 조사한 결과, 상피세포 특이 표시자가 발현됨을 확인되어 결론적으로 상피세포 유래 줄기세포의 특성을 가짐을 확증하였다.
- 디티오트레이톨을 처리함에 있어서 디티오트레이톨의 사용 농도는 5 mM 정도의 낮은 농도에서는 점액질의 분해가 잘 일어나지 않아 세포의 수득율이 향상되지 않았고, 50 mM 정도의 높은 농도에서는 조직이 오히려 단백질의 분해가 촉진되어 세포의 수득율이 떨어졌다. 본 연구자들은 장관상피세포에서의 세포 사멸을 연구한 논문(Grossmann et al.
- , 1998)을 처리하는 방법을 사용함으로써 양막상피세포를 초기에 대량으로 수득하며, 분리된 세포의 세포 사멸을 억제하여 대량으로 배양시킬 수 있도록 배양 배지에 ROCK 저해제(Rho-associated kinase inhibitor)를 첨가하여 배양함으로써 양막상피세포를 임상에 적용이 가능한 수준의 세포수까지 증식시킬 수 있음을 확인하였다. 또한 이렇게 분리배양된 양막상피세포에 대해 줄기세포 전능성 표시자와 상피세포 표시자의 발현을 확인함으로써 상피유래줄기세포임을 확인하였다.
- 두 번째로, 줄기세포의 가장 특징적인 분화능력을 살펴본 결과, 본 연구에서 배양된 양막상피세포가 외배엽유래의 신경세포와 중배엽 유래의 근육세포, 지방세포 및 골세포로 분화되었다. 마지막으로 본 실험에서 얻어진 세포의 경우 상피세포의 표시자인 cytokeratin(Pan-CK)의 발현을 조사한 결과, 상피세포 특이 표시자가 발현됨을 확인되어 결론적으로 상피세포 유래 줄기세포의 특성을 가짐을 확증하였다.
- 면역형광염색을 통하여 세포 내에 발현하여 줄기세포를 미분화상태로 유지하며 자가증식능력에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 Oct-4의 발현을 확인할 수 있었다(Fig. 4A). 그리고 배아줄기세포의 전능성 표시자로 알려진 Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA 4 등의 발현도 확인하였다.
- 본 연구는 양막상피세포를 수득하는 과정에 있어서 트립신 처리 전에 디티오트레이톨(Grossmann et al., 1998)을 처리하는 방법을 사용함으로써 양막상피세포를 초기에 대량으로 수득하며, 분리된 세포의 세포 사멸을 억제하여 대량으로 배양시킬 수 있도록 배양 배지에 ROCK 저해제(Rho-associated kinase inhibitor)를 첨가하여 배양함으로써 양막상피세포를 임상에 적용이 가능한 수준의 세포수까지 증식시킬 수 있음을 확인하였다. 또한 이렇게 분리배양된 양막상피세포에 대해 줄기세포 전능성 표시자와 상피세포 표시자의 발현을 확인함으로써 상피유래줄기세포임을 확인하였다.
- , 2000). 본 연구에서도 세포 사멸을 억제하는 기능을 가진 ROCK 저해제를 양막상피세포 배양에 적용한 결과 양막상피세포가 ROCK 저해제가 존재하는 환경에서 배양했을 때와 그렇지 않았을 때의 세포배양 상태의 차이는 확연히 드러났다. 세포모양의 유지와 세포수의 증식에 있어서 계대배양을 진행하면서도 세포의 기본형태가 급격히 변형되는 현상이 현저하게 줄어드는 것을 볼 수 있었다.
- 디티오트레이톨을 처리함에 있어서 디티오트레이톨의 사용 농도는 5 mM 정도의 낮은 농도에서는 점액질의 분해가 잘 일어나지 않아 세포의 수득율이 향상되지 않았고, 50 mM 정도의 높은 농도에서는 조직이 오히려 단백질의 분해가 촉진되어 세포의 수득율이 떨어졌다. 본 연구자들은 장관상피세포에서의 세포 사멸을 연구한 논문(Grossmann et al., 1998)에서 사용한 것처럼 일반적인 사용 농도인 10 mM을 사용하여 세포의 사멸을 방지하고, 수득율을 높일 수 있었다. 또한 디티오트레이톨 및 트립신을 이용한 화학적인 절차뿐만 아니라, 추가로 vortex mixer를 이용하여 물리적인 힘을 더하여 줌으로써 기저막으로부터 화학적인 반응에 의해 미쳐 떨어져 나오지 못한 상피세포들이 떨어질 수 있도록 하였다.
- 통상적으로 태반에서 분리된 양막은 혈액과 점액질 등으로 표면이 둘러싸이게 된다. 본 연구자들이 90개 이상의 태반으로부터 실험한 결과에 따르면, 초기에 태반으로부터 분리해낸 양막으로부터 양막상피세포를 분리 및 배양할 때, 트립신에 의해 조직으로부터 상피세포가 분리되지 못하도록 방해하는 주된 물질이 점액질이라는 것을 알 수 있었다. 특히 냉장보관이 오래된 태반의 경우 이러한 점액질이 더 많이 존재해 양막상피세포를 분리배양하는데 어려움이 있었다.
- 본 연구에서도 세포 사멸을 억제하는 기능을 가진 ROCK 저해제를 양막상피세포 배양에 적용한 결과 양막상피세포가 ROCK 저해제가 존재하는 환경에서 배양했을 때와 그렇지 않았을 때의 세포배양 상태의 차이는 확연히 드러났다. 세포모양의 유지와 세포수의 증식에 있어서 계대배양을 진행하면서도 세포의 기본형태가 급격히 변형되는 현상이 현저하게 줄어드는 것을 볼 수 있었다. ROCK 저해제를 첨가하는 농도는 1 nM～100 μM 단위까지 살펴보았는데 1～100 nM에서는 ROCK 저해제의 효능이 잘 드러나지 않았으며, 100 μM에서는 Sagawa et al.
- , 2003). 이러한 선행결과들은 결론적으로 본 연구를 통해 확립된 냉장보관된 태반으로부터 양막상피세포의 대량생산방법이 양막상피세포의 임상적용을 앞당길 수 있는 확실한 가능성을 뒷받침하고 있다. 앞으로 지속적인 동물실험 등을 통하여 더 많은 적응증들에 대한 효과를 확인하고, 세포치료제로서 생산기준 및 평가기준 등을 충족할 수 있도록 한다면, 양막상피줄기세포를 통한 재생의학의 진보가 앞당겨질 것이다.
- , 2005). 이번 실험에서 이러한 양막상피세포 줄기세포를 임상적용하기 위해 양막으로부터 상피세포를 분리한 후 배양하는데 성공하였고, 임상에 적용이 가능한 세포수를 얻기 위해 증식 배양법을 확립하였으며, 이러한 세포가 줄기세포의 특성과 상피세포의 특성을 가지고 있는 것을 확인하였다.
- 본 연구에서 분리 배양한 세포가 줄기세포의 특징을 가지고 있는지에 대해 알아보았다. 첫 번째로 세포 표면 표시자들의 발현을 살펴본 결과, 중간엽줄기세포에서 발현되는 CD29, CD73, CD90, CD105(Cellerix Patent US20060073124)와 상피세포에서 발현되는 CD9와 CD49f가 발현되었으며, 조혈모줄기세포 표시자인 CD31, CD34, CD45, CD133가 발현되지 않음을 확인하였다. HLA-DR이 발현되지 않음이 확인되었는데, 이러한 점은 다른 줄기세포와 마찬가지로 양막상피세포도 면역거부 반응이 덜 일어날 수 있는 가능성을 말해주고 있다.
- (2005)는 분만 직후에 얻어진 양막을 이용하여 트립신 처리를 여러 단계로 나누어서 실시함으로써 양막상피세포를 분리배양하였다. 하지만 분만 직후에 얻어진 양막과 달리 본 연구에 사용된 냉장보관된 양막에서는 트립신만을 사용한 결과, 양막에 점액질이 많아 양막상피세포의 수득율이 현저히 낮았다. 이러한 문제점을 해결하고자 본 연구에서 디티오트레이톨을 사용하여 점액질을 효과적으로 제거하여 초기배양에서 양막상피세포의 수득율을 높이고 생존율을 높였다.
후속연구
- , 1994; Hermiston & Gordon, 1995)에서와 같이 상피세포의 일종인 양막상피세포 역시 세포 사멸에 있어서 비슷한 메커니즘을 거칠 것이라는 예상을 할 수 있다. 따라서, 임상 적용 가능한 수준의 양막상피세포를 얻으려면 초기 양막으로부터 상피세포를 많이 얻은 디티오트레이톨 처리 방법과 함께 양막상피세포를 미분화 상태로 유지하며 세포의 노화를 방지하고 세포 사멸 과정으로 진행하는 것을 막아 세포를 증식시킬 수 있는 배양 방법이 필요할 것이다. 이에 양막상피세포를 세포 사멸을 억제하면서 대량으로 증식 배양할 수 있는 방법을 찾고자 하였다.
- 이러한 선행결과들은 결론적으로 본 연구를 통해 확립된 냉장보관된 태반으로부터 양막상피세포의 대량생산방법이 양막상피세포의 임상적용을 앞당길 수 있는 확실한 가능성을 뒷받침하고 있다. 앞으로 지속적인 동물실험 등을 통하여 더 많은 적응증들에 대한 효과를 확인하고, 세포치료제로서 생산기준 및 평가기준 등을 충족할 수 있도록 한다면, 양막상피줄기세포를 통한 재생의학의 진보가 앞당겨질 것이다.
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