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문제 정의
- 실정이다. 따라서 본 연구는 체외에서 성숙, 수정, 발달시킨 수정란을 발정동기화시킨 수란돈에 이식하고 산자를 생산하고자 수행하였다.
- 본 연구는 체외에서 생산된 돼지 2~4 세포기 단계의 초기 배 수정란과, 상실배 또는 배반포의 후기배 수정란을 이식하여 산자를 생산하고자 실시하였다. 발정동기화 시킨 수란 돈의 양측 난관에 100개씩 총 200개의 2~4 세포기 초기배 수정란을 이식한 다섯 마리의 수란돈 중 한 마리가 수정란 이식후 114일째 3마리의 자돈(수컷 2, 암컷 1)을 분만하였다.
제안 방법
- Micorsatellite(MS) marker 분석은 국제 동물유전학회 (International Society for Animal Genetics, ISAG)가 추천하는 국제표준 marker 11 종을 이용하여 PCR 증폭하였다. 증폭은 Gene-Amp PCR system 9700(ApliedBiosystems, USA)을 사용하여 수행하였는데, 94℃에서 5분간 전처리를 실시한 후, 94℃ 60 초간 denaturing, 각각의 marker에 적합한 온도에 맞추어 30초간 annealing, 72℃에서 60초간 extension, 72℃에서 7분간의 후처리를 실시하였으며, denaturing부터 extension까지의 반복 수는 30회 실시하였다.
- hCG 투여 후 2일째 2~4 cell 단계의 수정란 또는 5~6일째 상실배 및 배반포 수정란을 개복 수술에 의한 외과적인 방법으로 이식하였다. 수란돈은 수술 12시간 전부터 사료 급여와 급수를 중지시켰다.
- 산자를 생산하고자 실시하였다. 발정동기화 시킨 수란 돈의 양측 난관에 100개씩 총 200개의 2~4 세포기 초기배 수정란을 이식한 다섯 마리의 수란돈 중 한 마리가 수정란 이식후 114일째 3마리의 자돈(수컷 2, 암컷 1)을 분만하였다. 이들 중 수컷 1마리는 저체중으로 분만후 바로 폐사하였고, 2마리는 생존하였다.
- 절개하였다. 복막절개 후 자궁을 복강 밖으로 노출시킨다음, 각각의 난소에서 배란점을 확인하였다. 수정란의 이식은 수정란이 장착된 foley catheter를 난관채에서 자궁각 쪽으로 최대한 주입하여 2~4 cell 단계의 수정란은 난관에, 5~6 일째 상실배 및 배반포 수정란은 자궁각을 천자한 후 자궁각선단부에 이식하였다(Fig.
- 수란돈은 수술 12시간 전부터 사료 급여와 급수를 중지시켰다. 수술돼지는 체중 kg 당 atropine sulfate (Atropine®, 광명 약품, 대 한민국) 0.04 mg과 azaperone(Stressnil ®, Janssen, Swiss) 1 mg을 근육주사하여 진정(전마취)시키고, 15분 후 체중 kg 당 ketamine HCl(Ketamine 50®, 유한양행, 대한민국) 10 mg과 xylazine HCl(Rompun®, 바이 엘코리 아, 대한민국) 2 mg을 정맥주사하여 전신 마취를 유도하였다.
- 복막절개 후 자궁을 복강 밖으로 노출시킨다음, 각각의 난소에서 배란점을 확인하였다. 수정란의 이식은 수정란이 장착된 foley catheter를 난관채에서 자궁각 쪽으로 최대한 주입하여 2~4 cell 단계의 수정란은 난관에, 5~6 일째 상실배 및 배반포 수정란은 자궁각을 천자한 후 자궁각선단부에 이식하였다(Fig. 1).
- 돼지 도축 즉시 난소를 적출하여 100 units/ml의 penicillin G와 100 “g/ml의 streptomycin이 함유된 30℃ 내외의 생리식염수에 담아 1~2시간 내에 실험실로 운반하였다. 운반된 난소는 불필요한 조직을 잘라낸 후 항생제가 첨가된 생리식염수로 3~4회 세척한 후 18 gauge 주사 바늘이 부착된 10 ml 주사기를 이용하여 흡입법(aspiration)으로 난 포란을 채취하였다. 채취한 난포란은 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(D-PBS)에 0.
- 전신 마취된 돼지는 절개창 주변을 제모와 수세하고, 10% povidone iodide로 소독한 다음 15 cm의 피부를 절개하고, 피하지방을 절개창에 따라 좌우로 둔성분리한 다음 근육과 복막을 절개하였다. 복막절개 후 자궁을 복강 밖으로 노출시킨다음, 각각의 난소에서 배란점을 확인하였다.
- marker 11 종을 이용하여 PCR 증폭하였다. 증폭은 Gene-Amp PCR system 9700(ApliedBiosystems, USA)을 사용하여 수행하였는데, 94℃에서 5분간 전처리를 실시한 후, 94℃ 60 초간 denaturing, 각각의 marker에 적합한 온도에 맞추어 30초간 annealing, 72℃에서 60초간 extension, 72℃에서 7분간의 후처리를 실시하였으며, denaturing부터 extension까지의 반복 수는 30회 실시하였다. PCR 증폭산물은 1.
- 후 정소상체 미부의 정액으로부터 분리하였다. 채취된 정액은 0.1% BSA가 함유된 D-PBS 용액을 이용하여 1,500 rpm에서 5분간 2~3회 원심분리하여 정장 물질 및 오염물을 제거하였다. 세정 후 하단에 남은 정자 침전물에 modified Trisbuffered medium(mTBM) 배양액을 넣어 39 ℃ 의 5% C6 배양기에서 20분간 정치하여 수정능 획득을 유도하였다.
- 운반된 난소는 불필요한 조직을 잘라낸 후 항생제가 첨가된 생리식염수로 3~4회 세척한 후 18 gauge 주사 바늘이 부착된 10 ml 주사기를 이용하여 흡입법(aspiration)으로 난 포란을 채취하였다. 채취한 난포란은 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(D-PBS)에 0.1% polyvinyl alcohol(PVA) 이 첨가된 배양액으로 2회 이상 세척 후 실체현미경하에서 회수하였다. 회수된 난포란은 0.
- 1% polyvinyl alcohol(PVA) 이 첨가된 배양액으로 2회 이상 세척 후 실체현미경하에서 회수하였다. 회수된 난포란은 0.1% PVA가 함유된 D-PBS로 3~4회 세척한 후 등급을 분류하였다. 등급의 분류는 난구세포의 부착 정도와 세포질의 충실도에 따라 Wiemer 등(1991)의 난포란 등급 분류 방법을 따랐다.
- 회수된 난포란은 North Carolina State University(NCSU)-23 기본 배양액에 10% 돼지 난포액(porcine follicular fluid, PFF), 0.5 /zg/ml porcine FSH, 0.5 /zg/ml equine LH, 1.0 “g/ml 17 B-estradiol(Ez) 및 10 ng/ml epidermal growth factor(EGF)를 첨가하여 체외배 양하였다. 난포란의 체 외성숙용 배 양액을 4-well dish(Nunc.
- Denmark)의 각 well당 500 “1씩 넣어 39 ℃ CO2 배양기에서 24시간 동안 전배양하였다. 회수한 난자는 TALF- HEPES 배양액으로 3회 세정하고, 체외성숙용 배양액으로 1회 세정하였다. 세정된 미성숙 난포란을 4-well dish 각 well당 50개씩 넣어 39℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
대상 데이터
- 본 시험에 사용된 돼지는 국립축산과학원 가축유전자원시험장에서 사육하고 있는 12개월령 이상의 미경산돈으로 발정 동기화를 위해 수란돈은 발정 주기와 관계없이 altrenogest(Re-gumate®, Intervet, France)를 1일 20 mg씩 14일간 사료에 혼합하여 급여하고, altrenogest 마지막 급여시 equine chorionic gonadotrophin(eCG)(Folligon®, Intervet, Netherland) 1,000 IU를 피하주사 하였으며, eCG 투여 후 80시간째 human chorionic gonadotrophin(hCG)(Chorulon®, Invervet, Netherland)500 IU를 근육주사하였다.
- 수정란 이식후 114일째에 2~4 세포기 단계의 체외수정란을 이식한 수란돈 1마리가 3마리의 산자를 생산하였다. 생산된 3마리의 자돈 중 1마리는 저체중(920 g, 수컷)으로 분만 직후 폐사하였고, 암컷 1마리(1, 150 g)와 수컷 1마리(1, 560 g) 는 생존하였다(Table 1, Fig.
이론/모형
- 1% PVA가 함유된 D-PBS로 3~4회 세척한 후 등급을 분류하였다. 등급의 분류는 난구세포의 부착 정도와 세포질의 충실도에 따라 Wiemer 등(1991)의 난포란 등급 분류 방법을 따랐다.
성능/효과
- 이들 중 수컷 1마리는 저체중으로 분만후 바로 폐사하였고, 2마리는 생존하였다. 그러나 상실배와 배반포의 후기배를 자궁각에 이식한 2마리의 수란돈은 새끼를 생산하지 못하였다, 생산된 자돈 2마리는 Microsatellite(MS) 분석으로 수란돈이 자돈의 친자가 아님을 확인하였다.
- 본 연구는 체외에서 성숙, 수정, 발달된 돼지 초기배 체외수정란을 이식하여 산자를 생산하는 것이 가능함을 확인하게 되었다.
- 수정란 이식후 114일째에 2~4 세포기 단계의 체외수정란을 이식한 수란돈 1마리가 3마리의 산자를 생산하였다. 생산된 3마리의 자돈 중 1마리는 저체중(920 g, 수컷)으로 분만 직후 폐사하였고, 암컷 1마리(1, 150 g)와 수컷 1마리(1, 560 g) 는 생존하였다(Table 1, Fig. 1-D).
- 2의 S0026 marker에서 보는 바와 같이 수란돈이 가지고 있는 대립 유전자 97이 자돈에서는 관찰되지 않고 공란돈 유, 래로 추정되는 91 및 93(수컷)과 93 및 99(암컷)의 대립 유전자가 관찰되었다. 이와 같은 결과는 자돈 수컷에서는 S0097, 자돈 암컷에서는 S0178, S0228 및 SW830 marker에서 관찰되어 수란돈의 유전적인 영향을 받지 않은 체외수정란에서 생산된 것으로 확인되었다(Table 2).
후속연구
- 특히 후기배 수정란을 이식해서는 산자 생산까지 도달하지 못하였는더】, 이는 수란돈의 공시두수가 2마리밖에 되지않으므로 이후 후기배 수정란을 이용한 이식을 반복하고, 이식 시 스트레스를 줄이기 위하여 비외과적 방법 등을 이용한다면 좋은 연구 결과가 있을 것으로 추측되며, 본 연구를 바탕으로 생명공학 연구의 근간이 되는 돼지 수정란 이식을 통한 산자 생산을 위해 좀더 지속적이고, 폭넓은 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
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