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문제 정의
- 방선균은 항생물질, 효소, 저해제 등의 2차 대사산물을 생 산하는 미생물로 널리 이용되고 있으며, 2차 대사산물 생산은 그 배양조건 및 배지의 성분에 많은 영향을 받는다6). 본 연구는 광범위 항생물질을 생산하는 방선균 Y-88을 토양으로부터 분리, 선별하여 형태학적, 배양상 및 생리적 특성을 검토 하여 속을 동정하고, 이 균으로부터 항생물질의 생산성을 향상시키기 위하여 최적 배양 조건을 검토하였다.
제안 방법
- 100 mℓ 삼각 플라스크에 agar* 제외한 기본배지를 분주하고 살균(121℃, 15분)하여 순수 분리한 균주를 각각 1백금이 씩 접종한 후 30℃에서 5일간 배양한 후 그람 음성균인 E. coli ATCC 9637을 시험균으로 하여 paper disc법으로 항균력이 강한 21균주를 1차 선별하였다. 같은 방법으로 배양한 배양액을 얻은 후 E.
- 02%의 ant血ifoam을 첨가한 후 121 ℃에서 10분간 가압 멸균시킨 후 냉각시킨 배지에 24시간 배양한 Y-88의 배양액을 5% 되게 접종 하였다. 30℃에서 진탕속도 350 rpm, 1, 500 Ncc/nin의 공기주입으로 조절하여 4일간 배양하면서 10시간 간격으로 항생물질 생산 및 균체 증식을 조사하였다.
- 이%씩 첨가하여 같은 조건에서 배양한 후 항균활성 을 조사한 결과(data not shown)는 MgSQ - 7H2O, ZnSO4 . 7H2O 및 KzHPQ가 각각 무첨가구에 비해 158%, 152% 및 138%의 촉진 효과를 보였음으로 다음 실험에서는 이들을 0.01%로 첨가하여 사용하였다.
- Y-88의 배양학적 특성은 Shirling과 Gottlieb의 방법? Berges manual of determinative bacteriology8) 등에 명기된 방법에 따라 yeast extract-malt extract agar, oatmeal agar, inorganic salt- starch agar, glycerol asparagine agar, peptone-yeast extract iron agar 및 tyrosine agar 배지 상에서 3주간 배양하면서 포자의 색상과 표면새 가용성 색소 및 멜라닌 색소의 생성 유무를 조사하였다. 그 결과는 Table [과 같았다.
- 방선균을 동정할 때 균사의 모양, 포자형태의 연결(spore chain) 및 포자의 표면 모양(spore surface) 이 방선균의 분류에 중요한 기준이 된다. Y-88의 형태학적 특성을 조사하기 위해서 Y-88을 inorganic salt-starch agar와 oatmeal agar 평판배지에접종하여 30℃에서 14일간 배양한 후 광학현미경과 전자현미경으로 포자의 연결 상태와 표면상태를 관찰을 하였다饵ig.1). 관찰 결과, Y-88의 포자 연결 상태는 곧거나(straight) 구불 구불한(flexuous) 형태인 rect由exibilis이었고, 포자의 표면 상태는 smooth 형이었다.
- e. coli ATCC 9637을 시험균으로 하여 nutrient 배지가 깔린 plate에 시험균 20 ㎕를 현탁한 2 mi의 반유동 한천배지(45℃, 0.6%)를 중증하고 직경 8 mm, 두께 1 mm의 paper disc에 80 ㎕의 배 양액을 가한 후 건조시켜 배지 위에 올려놓고 4 ℃ chamber에서 2시간 동안 방치한 뒤 30℃에서 24시간 배양하여 형성되는 생육 저지대(clear zone) 의 직경을 측정하였다. 항생물질의 활성은 각 시험균마다 대조군을 정하여 상대 활성 (relative activity)으로 나타내었 다.
- coli ATCC 9637을 시험균으로 하여 paper disc법으로 항균력이 강한 21균주를 1차 선별하였다. 같은 방법으로 배양한 배양액을 얻은 후 E. coli ATCC 9637, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Aspergillus niger ATCC 1374, Candida albicans IFO 1594를 시험균으로 이용하여 paper disc법으로 항균활성 을 측정하였다. 이들 균주에 항균활성을 모두 나타내는 방선균 Y-88을 항생물질 생산균으로 최종 선별하였다.
- 0)을 기본배지로 하여 각종 탄소원 및 질소원의 영향을 조사하였으며, 항생물질 생산에 적합한 탄소원 및 질소원의 농도를 결정하였다. 결정된 탄소원 및 질소원 농도에 금속염 및 인산염 등이 항생물질 생산에 미치는 영향을 조사하였으며, 배양 최적 초기 pH, 온도 및 배양시간에 따른 생산의 최적 조건을 결정하였다.
- 본 균주로부터 항생물질 생산에 미치는 금속염 및 인산염의 영향을 검토하기 위해 탄소원으로 gluco%와 soluble starch 각각 1.6%, 유기질소원으로 beef extract 0.6%로 하고 여기에 금속염 및 인산염을 0.이%씩 첨가하여 같은 조건에서 배양한 후 항균활성 을 조사한 결과(data not shown)는 MgSQ - 7H2O, ZnSO4 . 7H2O 및 KzHPQ가 각각 무첨가구에 비해 158%, 152% 및 138%의 촉진 효과를 보였음으로 다음 실험에서는 이들을 0.
- 본 균주로부터 항생물질 생산에 미치는 초기 온도의 영향을 조사하기 위하여 탄소원으로 glucose 와 soluble starch 각각1.6%, 유기질소원으로 beef extract 0.6%와 그리고 무기질인, K2HPO4, MgSO4 . 7H2O 및 ZnSO4 .
- Sorbitol, dextrin에서는 항균활성은 전혀 나타나지 않았으나, 균의 생육은 각각 151 mg으로 잘 자랐으며, galactose 131 mg, soluble starch 130 mg 및 glucose는 67 mg 순으로 나타났다(data not shown). 본 실험에서는 탄소원으로 glucose와 soluble starch를혼용하여 사용하였다.
- 항생물질 대량 생산을 위해 2 ℓ Jar ffermentor에 working volume이 50%가 되게 항생물질 생산배지를 넣고 0.02%의 ant血ifoam을 첨가한 후 121 ℃에서 10분간 가압 멸균시킨 후 냉각시킨 배지에 24시간 배양한 Y-88의 배양액을 5% 되게 접종 하였다. 30℃에서 진탕속도 350 rpm, 1, 500 Ncc/nin의 공기주입으로 조절하여 4일간 배양하면서 10시간 간격으로 항생물질 생산 및 균체 증식을 조사하였다.
- 항생물질 생산에 미치는 질소원의 영향을 조사하기 위해서 탄소원으로 glucose와 soluble starch가 각각 1.6%로 하는 기본 배지에 peptone 대신 각종 질소원을 1% 첨가하였다. 그 후 100 me 삼각플라스크에 20 rnC씩 분주하여 pH 7.
- 항생물질의 생산조건을 검토하기 위하여 100 ㎖ 삼각플라스크에 soluble starch 2%, peptone 1%, MgSQ - 7H2O 0.01%, KjHPQ 0.01%(pH 7.0)을 기본배지로 하여 각종 탄소원 및 질소원의 영향을 조사하였으며, 항생물질 생산에 적합한 탄소원 및 질소원의 농도를 결정하였다. 결정된 탄소원 및 질소원 농도에 금속염 및 인산염 등이 항생물질 생산에 미치는 영향을 조사하였으며, 배양 최적 초기 pH, 온도 및 배양시간에 따른 생산의 최적 조건을 결정하였다.
대상 데이터
- 현재까지 미생물에 의해 생산되는 10, 000여 종의 항생물질 가운데 약 2/3에 해당하는 64% 정도가 방선균으로부터 발견 되었다. 따라서 토양 중에 널리 분포하고 있는 방선균을 분리 하여 광범위 항생물질 생산능이 가강 우수한 Y-88을 최종 선정하였다. 이 균을 형태학적, 생리상 및 배양학적으로 동정한결과 Streptomyces 속으로 밝혀져 Streptomyces sp.
- 6% soluble starch를 같이 첨가했을 때는 그 활성이 43% 증가하였다. 따라서, 본 실험에서는 glucose와 soluble starch를 각각 1.6%로 혼합 사용하였다.
- coli ATCC 9637, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Aspergillus niger ATCC 1374, Candida albicans IFO 1594를 시험균으로 이용하여 paper disc법으로 항균활성 을 측정하였다. 이들 균주에 항균활성을 모두 나타내는 방선균 Y-88을 항생물질 생산균으로 최종 선별하였다.
- 전국 각지의 식물 뿌리, 야산 등에서 토양을 채취하여 방선 균의 분리에 이용하였다. 즉, 토양 시료는 80℃ 건조기에서 1시간 건조시켜 soluble starch 2%, peptone 1%, MgSQ .
이론/모형
- Glucose와 soluble starch를 농도별로 조합하여 30 ℃ 에서 4 일간 진탕배양한 후 paper disc법으로 항균력을 측정하였다. 그 결과, Table 5에서와 같이 glucose와 soluble starch가 각각1.
- Y-88에 의해 생산된 항생물질의 항균력은 paper disc법을 이용하여 측정하였다. e.
- 형태학적, 배양상 및 생리적 특징은 Shirling과 Gottlieb의 방법71, Bergey's manual of determinative bacteriology%]] 수록되어 있는 일반적인 방선균 동정법에 따라 행하였다.
성능/효과
- 0%를 첨가했을 때 항균 활성이 높게 나타났다. 1.6% soluble starch만 첨가시보다 1.6% glucose를 같이 첨가했을 때의 활성이 19% 증가하였으며,1.6% glucose 만 첨가시보다 1.6% soluble starch를 같이 첨가했을 때는 그 활성이 43% 증가하였다. 따라서, 본 실험에서는 glucose와 soluble starch를 각각 1.
- 7H2O 및 ZnSO4 . 7H2O를 각각 0.01%로 첨가한 기본배지(pH 4.0)로 온도를 15〜45℃까지 조절하여 4일간 배양한 결과, Fig. 4와 같이 25 ℃ 에서 항균활성과 생육이 가장 우수하였다.
- 6%, K2HPO4, MgSQi - 7H2O 및 ZnSO4 . 7H2O를 각각 0.01%로 첨가한 기본배지로 pH를 3~11까지 조절하여 30℃에서 4일간 배양한 결과, Fig. 3과 같이 pH 4.0에서 항균활성이 가장 우수하였다. 따라서 본 균주는 호산성균으로 추정된다.
- 7H2O 및 ZnSO4 . 7HK)를 각각 0.01%로 첨가한 기본 배지(pH 4.0)로 온도를 25℃로 조절하여 70시간까지 배양한 결과, 30시간 후에 항생물질의 생산이 최고에 달하였으며, 시간과 더불어 약간씩 감소하는 경향을 보였다. 균 생육은 30시간 만에 최고에 달한 후 계속 그 수준으로 유지되었다Rig.
- coli ATCC 9637을 시험균으로 이용한 paper disc법으로 항균력을 측정한 결과, glucose을 100으로 했을 때 fructose 100%, glycerol 85%, soluble starch 80%, ^lactose 65% 순으로 그 상대 활성을 나타내었다. Sorbitol, dextrin에서는 항균활성은 전혀 나타나지 않았으나, 균의 생육은 각각 151 mg으로 잘 자랐으며, galactose 131 mg, soluble starch 130 mg 및 glucose는 67 mg 순으로 나타났다(data not shown). 본 실험에서는 탄소원으로 glucose와 soluble starch를혼용하여 사용하였다.
- 각종 탄소원의 영향을 검토하기 위해서 기본배지에 soluble starch 대신 각종 탄소원을 2%로 첨가하여 100 삼각플라스 크에 20 ㎖씩 분주하여 pH 7.0으로 조절하고 감압 살균하여 30℃에서 4일간 진탕배양 후 E. coli ATCC 9637을 시험균으로 이용한 paper disc법으로 항균력을 측정한 결과, glucose을 100으로 했을 때 fructose 100%, glycerol 85%, soluble starch 80%, ^lactose 65% 순으로 그 상대 활성을 나타내었다. Sorbitol, dextrin에서는 항균활성은 전혀 나타나지 않았으나, 균의 생육은 각각 151 mg으로 잘 자랐으며, galactose 131 mg, soluble starch 130 mg 및 glucose는 67 mg 순으로 나타났다(data not shown).
- 1). 관찰 결과, Y-88의 포자 연결 상태는 곧거나(straight) 구불 구불한(flexuous) 형태인 rect由exibilis이었고, 포자의 표면 상태는 smooth 형이었다. 따라서 본 균주는 형태적 특성상 Streptomyces 속의 특징을 갖고 있었다.
- Glucose와 soluble starch를 농도별로 조합하여 30 ℃ 에서 4 일간 진탕배양한 후 paper disc법으로 항균력을 측정하였다. 그 결과, Table 5에서와 같이 glucose와 soluble starch가 각각1.6%일 때 항균활성이 가장 높게 나타났으며, 대체로 glucose는 0.8—1.6%, soluble starch는 1.6~2.0%를 첨가했을 때 항균 활성이 높게 나타났다. 1.
- 관찰 결과, Y-88의 포자 연결 상태는 곧거나(straight) 구불 구불한(flexuous) 형태인 rect由exibilis이었고, 포자의 표면 상태는 smooth 형이었다. 따라서 본 균주는 형태적 특성상 Streptomyces 속의 특징을 갖고 있었다.
- 본 균주의 형태학적, 배양학적 및 생리적 특성을 조사하여종합한 결과, Table 4에서와 같이 Streptomyces exfoliatus 또는 근연균으로 추정된다.
- 또한, Mg*가 항생물질 생산을 촉진시켰다는 Bang과 Ha#)의 보고 와도 같았고, Mn*이 항생물질의 생산에 아주 큰 영향을 주었 다는 결과와는 일치하지 않았다. 본 연구에서는 Zn卄이 항생 물질 생산에 촉진적으로 작용하였고, 인산염으로서는 KzHPQ 가 효과적이었다. 따라서 다음 실험에서는 glucose와 soluble starch 각각 1.
- 당 이용성은 Shilling과 Gottlieb의 방법7)에 따라 탄소원 이용성 시험 기본배지에 당을 1% 농도로 첨가한 배지에 Y-88 균주의 포자 접종하여 30C 에서 3주간 배양하면서 그 이용성 여부를 조사한 결과 D-giucos饥 D-fructose, L-arabinose, sucrose는 잘 이용하였으나 xylene, rhamnose, raffinose, mannitol, imsitW에서는 잘 증식하지 못하였다(Table 2). 질소원의 이용성을 조사하기 위하여 기본배지에 각각의 질소원을 1% 농도가 되도록 첨가하여 배양한 결과, L-phenylalanine, L-valine,L-hydroxyproline'e 잘 이용하였고, L-histidine, L-cysteine 등은 이용하지 못하였다(Table 3).
- coli ATCC 9637을 시험 균으로 이용한 paper disc법으로 항균력을 측정한 결과, b^f extract의 상대 활성을 100%로 하였을 때 coin steep powder peptone 및 soybean meal이 각각 83%, 78% 및 74%의 순으로 나타났으며, 무기질소원 중에서는 (NHQHPQi가 91%로 가장 높게 나타났다* 균의 생육도를 보면 soybean meal 189 mg, beef extract 176 mg, com steep powder 113 nig으로, 무기질 소원으로는 (NH^HPQ;에서는 102 mg이었다(data not shown). 탄소원으로 1.6% glucose와 1.6% soluble starch를 혼합사용한 배지에 beef extract* 0.2〜1.6%까지 첨 가하고 같은 조건에서 paper disc법으로 항균활성을 검토한 결과는 Fig. 2와 같이 0.6%에서 그 활성과 생육도가 가장 좋았다. Ruichi 등9)은 Streptomyces 속으로부터 aldecalmycin 생산에는 0.
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