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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 naringenin이 MMPs 활성과 침윤능이 높은 인체 섬유육종 세포주인 HT1080에서 세포의 증식과 사멸, 전이 과정인 침윤성과 침윤시 분비되는 단백질분해효소인 MMPs와 억제 유전자인 TIMPs의 효소 활성과 유전자 발현에 미치는 영향을 연구하였다.
- 본 연구는 naringenin이 암세포 이동 관련 유전자에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. 먼저, 세포독성에 영향을 주지 않는 처리 범위를 정하기 위해 naringenin을 처리 후, 24시간 후에 100 μM 이하 농도에서 HT1080 세포의 독성에 영향이 없음을 알 수 있었다.
- 본 연구에서는 HT1080 세포에서 naringenin을 이용하여 MMP-2, -9와 MT1-MMP 및 TIMP-1, -2 의 유전자 발현 정도를 연구함으로써 이들의 발현 저해가 암의 전이억제와 관련됨을 밝히고 이들 발현의 상호 작용을 규명하고자 하였으며 또한 여러가지 bioassay를 통하여 실제 암세포의 침윤성에대한 억제효능을 평가하고자 하였다.
- Naringenin은 flavonoid 구조의 감귤류 과피에 다량 함유되어 있으며 항암 및 항산화 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 보고되었다. 이에 본 연구에서는 HT-1080 섬유육종세포의 침윤에 대한 영향을 조사하였다. 먼저 naringenin이 암세포의 침윤에 미치는 영향을 알아보기 위해 invasion assay를 한 결과, naringenin이 암세포의 침윤을 농도 의존적으로 억제시켰다.
제안 방법
- cells/well의 농도로 24시간 동안 부착시킨 후 FBS가 없는 무혈청 배양액으로 갈아준 다음 naringenin을 처리하였다. 24시간 후 무혈청 배양액을 효소액으로 하여 1 mg/mL의 gelatin이 함유된 10% sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electroporesis (SDS-PAGE)을 이용하여 전기영동 하였다. 상온에서 120 V로 2시간 전기영동이 끝난 후에 gel은 SDS를 제거하기 위해 washing buffer (2.
- 3시간 후 배양액을 버리고 DMSO를 200 μL/well씩을 넣어 5분간 실온 방치하여 푸른색 결정인 formazan을 용해시킨 후 분광광도계(microplate spectrophotometer : Bio-Rad, California, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.
- 6.5 mm 직경의 8 μm pores를 가진 polycarbonate filter를 내장한 trans-well culture chamber (Corning)를 이용하여 HT1080 세포의 침윤능을 검사하였다.
- HT1080 세포를 5×103 cells/mL 세포 수로 계수한 다음 24 well plate (Corning)에 200 μL씩 분주하여 24시간 동안 배양하고 25, 50, 100, 200, 400μM 농도의 naringenin (1 μL, 0.1% dimethylsulfoxide (DMSO : Sigma-Aldrich Chemical, St. Louis, MO, USA))이 포함된 배양액으로 교환하고 24시간 추가 배양하였다.
- HT1080 세포를 trans-well culture chamber에 25, 50, 100 μM의 naringenin을 처리하고 24시간 후에 matrigel을 도포한 필터를 통해 이동한 세포를 관찰하였다.
- 3시간 후 배양액을 버리고 DMSO를 200 μL/well씩을 넣어 5분간 실온 방치하여 푸른색 결정인 formazan을 용해시킨 후 분광광도계(microplate spectrophotometer : Bio-Rad, California, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다. Lactate dehydrogenase (LDH) release activity는 세포막 손상에 따라 배지로 유출된 LDH량을 측정하여 세포독성을 확인하는 방법으로 LDH Kit (Wako Pure, Osaka, Japan)을 이용하였다. HT1080 세포주를 각각 5×103 cells/mL가 되도록 24 well plate에 분주하여 24시간 배양 후 이들 세포를 여러 농도의 naringenin이 포함된 배양액에서 24시간 배양하였다.
- Naringenin에 의해 MMP-2, -9 효소의 활성을 억제하였는데 naringenin이 MMPs와 TIMPs 유전자 발현에 저해 활성이 있는지 PMA로 종양을 촉진시켜 상승 발현된 MMP-2, -9, MT1-MMP, TIMP-1, -2 활성을 억제하는지 알아보았다. 그 결과, naringenin 의 처리농도가 증가함에 따라 MMP-2, -9, MT1- MMP의 발현이 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- Naringenin이 MMP-2, -9 효소 활성이 있는지 PMA로 종양을 촉진시켜 상승 발현된 MMP-2, -9 활성을 억제되는지를 gelatin zymography를 이용해 확인해 보았다. 그 결과, PMA 처리군에서는 많은 양의 MMP-2, -9 효소의 활성이 나타남을 관찰할 수 있으며 24시간 동안 naringenin 25, 50, 100 μM로 처리한 결과 MMP-2, -9 효소의 활성은 농도 의존적인 저해 활성을 보였으며 특히 MMP-9 효소의 활성을 강하게 억제함을 확인 할 수 있었다(Fig.
- Naringenin이 암세포 증식에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고, 세포 사멸로 인해 침윤에 영향을 미치지 않도록 실험 조건을 정하기 위해 25, 50, 100, 200, 400 μM 농도로 첨가하여 24시간 배양 후 MTT assay에 의해 세포 독성 실험을 하였다.
- PCR 반응에 사용된 primer들의 염기서열은 MMP-2 (5′-GTGCTGAAGGACACACTAAAGA-3′, 3′-GGATGTTGAAACTCTTCCTACC-5′); MMP-9 (5’-CACTGTCCACCCCTCAGAGC-3′, 3′-GGAATAGCGGCTGTTCACCG-5′); TIMP-1 (5’-TGCACCTGTGTCCCACCCCACCC-3′, 3′-TGGACCGTCAGGGACGCCAGGGT-5′); TIMP-2 (5’-CCGAATTCTGCAGCTGCTCCCCGGTG-3′, 3′-GAGCTGTAGCTCCTGGGTATT-5’); MT1-MMP (5′-CGCTACGCCATCCAGGGTCTC-3′, 3′-ACACGACGGGCTACTACTGGC5’); GAPDH (5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG3′, 3′-CCAGTAGGTACTGTTGAA-5′)를 합성하였다.
- PCR 반응 조건은 cycle 시작 전 94℃에서 5분간 가열한 뒤 매 cycle 마다 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 과정을 25회 반복하였다. PCR 반응이 끝난 후에는 증폭된 DNA를 1.2% agrose gel을 이용하여 90 V에서 45분 동안 전기영동하였고 10,000배 희석한 SYBR Gold staining solution (Perkin Elmer, Massachusetts, USA)으로 1시간 동안 염색한 다음 Alpha ImagerTM (Alpha Innotech Corp, CA, USA)을 이용하여 염색된 DNA를 확인하였다.
- 25% crystal violet (Sigma)으로 10분 동안 염색하였다. Xylen (Merck, Darmstadt, Germany)에 넣어서 불순물을 제거하고 슬라이드 글라스에 놓고 histomount를 한 방울 떨어뜨린 후 커버 글라스를 덮어서 필터를 통과하여 필터 하방에 붙어있는 세포수를 200 배율의 현미경(TS-100 : Nikon, Tokyo, Japan)으로 사진 촬영하였다.
- 그 후 반응 정지액을 120 μL/well씩 처리하여 분광광도계로 570 nm 에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.
- 따라서 이후 실험에서는 세포독성에 영향을 미치지 않는 25, 50, 100 μM 농도의 naringenin을 처리하여 실험하였다(Fig. 1A).
- 또한 naringenin을 HT1080 세포주에 25, 50, 100, 200, 400 μM 농도로 첨가하여 24시간 배양 후 유출된 LDH량에 의해 세포 증식 실험을 평가해보았다.
- 생성된 cDNA (10-50 ng/μL)를 이용하여 표적 유전자에 선택적인 primer (10 pmol) 및 Taq polymerase (5 Units/μL; Promega)를 이용하여 polymerase chain reaction (PCR : Corbett Research, Sydney, Australia)을 수행하였다.
- 세포주 배양용 배지는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM : GibcoBRL, NY, USA) 배양액에 10%의 fetal bovine serum (FBS : GibcoBRL)과 3 μL/mL의 fungizone (GibcoBRL) 및 10 μL/mL의 antibiotics(GibcoBRL)를 첨가해 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 세포는 인체 섬유육종 세포(human fibrosarcoma cell : HT-1080)로 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받아 사용하였다. 세포주 배양용 배지는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM : GibcoBRL, NY, USA) 배양액에 10%의 fetal bovine serum (FBS : GibcoBRL)과 3 μL/mL의 fungizone (GibcoBRL) 및 10 μL/mL의 antibiotics(GibcoBRL)를 첨가해 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과의 유의성 검증은 Tukey-Kramer test 방법에 따라 실시하였으며, p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- In vitro invasion assay는 Moon and Kim (2000)의 방법으로 시행하였다. 6.
- MTT assay는 Mosmann (1983) 방법에 따라 시행하였다. HT1080 세포를 5×103 cells/mL 세포 수로 계수한 다음 24 well plate (Corning)에 200 μL씩 분주하여 24시간 동안 배양하고 25, 50, 100, 200, 400μM 농도의 naringenin (1 μL, 0.
성능/효과
- 또한 MMP-9, -2, MT1-MMP의 유전자 발현에 대한 naringenin의 영향을 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 방법으로 조사한 결과, naringenin이 MMP-9, -2와 MT1-MMP의 mRNA 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다. 결론적으로 naringenin의 암전이 억제는 단백질분해효소인 MMPs의 mRNA 발현 및 효소 활성을 억제함으로써 암세포의 침윤을 저해함으로써 나타난 결과로 사료된다.
- 그 결과, 25, 50, 100 μM의 naringenin 농도에서는 LDH 유출정도가 대조군과 유사하였으나, 200 μM의 naringenin 농도에서는 LDH 유출량이 2.4배로 유의적으로 증가되었고, 400 μM의 naringenin 농도에서는 LDH 유출량이 3.4배로 농도 의존적으로 증가되었다(Fig. 1B).
- 그 결과, PMA 처리군에서는 많은 양의 MMP-2, -9 효소의 활성이 나타남을 관찰할 수 있으며 24시간 동안 naringenin 25, 50, 100 μM로 처리한 결과 MMP-2, -9 효소의 활성은 농도 의존적인 저해 활성을 보였으며 특히 MMP-9 효소의 활성을 강하게 억제함을 확인 할 수 있었다(Fig. 3).
- Naringenin에 의해 MMP-2, -9 효소의 활성을 억제하였는데 naringenin이 MMPs와 TIMPs 유전자 발현에 저해 활성이 있는지 PMA로 종양을 촉진시켜 상승 발현된 MMP-2, -9, MT1-MMP, TIMP-1, -2 활성을 억제하는지 알아보았다. 그 결과, naringenin 의 처리농도가 증가함에 따라 MMP-2, -9, MT1- MMP의 발현이 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 25 μM 이상에서 MMP-2, -9, MT1-MMP의 발현이 현저하게 감소하는 것을 알 수 있었다.
- 그 결과, naringenin을 HT1080세포에 25, 50, 100, 200, 400 μM 농도로 24 well plate에서 24시간 동안 배양한 후 처리하여 대조군과 비교한 결과 100 μM 이하의 naringenin 농도에서는 약 90%의 높은 세포 생존율을 보였고, 200 μM에서는 64%의 세포생존율을, 400 μM에서는 37%의 세포 생존율을 나타냈다.
- HT1080 세포를 trans-well culture chamber에 25, 50, 100 μM의 naringenin을 처리하고 24시간 후에 matrigel을 도포한 필터를 통해 이동한 세포를 관찰하였다. 그 결과, 종양 촉진제인 phorbol myristate acetate (PMA) 100 nM 단독 처리한 군에서는 암세포의 침윤율이 증가된 것에 반하여 naringenin 처리 농도에 의해 암세포의 침윤율이 억제됨을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- 특히 25 μM 이상에서 MMP-2, -9, MT1-MMP의 발현이 현저하게 감소하는 것을 알 수 있었다. 또한 MMP-2, -9의 내인성 저해제인 TIMP-1, -2의 발현이 PMA에 의해 증가되었으나 naringenin의 처리에 따른 변화는 없는 것으로 나타났다(Fig. 4).
- 암의 침윤에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 단백질분해효소인 matrix metalloproteinases (MMPs)의 활성도를 측정하기 위해 gelatin zymography를 한 결과, naringenin이 MMP-9, -2의 효소 활성도를 농도 의존적으로 감소시켰다. 또한 MMP-9, -2, MT1-MMP의 유전자 발현에 대한 naringenin의 영향을 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 방법으로 조사한 결과, naringenin이 MMP-9, -2와 MT1-MMP의 mRNA 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다. 결론적으로 naringenin의 암전이 억제는 단백질분해효소인 MMPs의 mRNA 발현 및 효소 활성을 억제함으로써 암세포의 침윤을 저해함으로써 나타난 결과로 사료된다.
- MMP-2, -9 효소 활성은 유전자 발현 및 효소의 활성화 정도에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다(Chambers and Matrisian, 1997). 먼저 PMA에 의해 유발된 MMP-2, -9의 효소 활성을 naringenin이 억제 시키는지 알아본 결과, naringenin의 처리농도 의존적으로 MMP-2, -9의 효소의 활성은 저해됨을 확인하였다. 이러한 결과는 naringenin이 암세포주인 HT1080 세포에서 MMP-2, -9 효소 활성을 억제하는 데 효과가 있음을 확인하였다.
- 이에 본 연구에서는 HT-1080 섬유육종세포의 침윤에 대한 영향을 조사하였다. 먼저 naringenin이 암세포의 침윤에 미치는 영향을 알아보기 위해 invasion assay를 한 결과, naringenin이 암세포의 침윤을 농도 의존적으로 억제시켰다. 암의 침윤에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 단백질분해효소인 matrix metalloproteinases (MMPs)의 활성도를 측정하기 위해 gelatin zymography를 한 결과, naringenin이 MMP-9, -2의 효소 활성도를 농도 의존적으로 감소시켰다.
- 먼저, 세포독성에 영향을 주지 않는 처리 범위를 정하기 위해 naringenin을 처리 후, 24시간 후에 100 μM 이하 농도에서 HT1080 세포의 독성에 영향이 없음을 알 수 있었다.
- 또한 MMP-2, -9과 TIMP-1, -2의 발현은 생체 실험과 세포수준의 실험에서 다르게 조절된다고 보고하였다(De Clerck, 1994). 본 실험에서도 MMP-9의 효소 활성이 TIMP-1에 의해 조절되는지 확인하기 위해 조사해 본 결과, naringenin이 처리 농도별로 MMP-9의 유전자 발현을 억제하는 효과를 나타내었으나, TIMP-1의 유전자 발현에서는 변화가 없었다. 이는 MMP-9의 효소 활성화는 유전자 발현의 감소에 의한 결과이며, TIMP-1에 의한 효소 활성도의 조절이 아님을 시사하였다.
- , 2002). 본 연구에서는 MMP-2, MT1-MMP 및 TIMP-2의 유전자 발현에 미치는 naringenin의 영향을 살펴본 결과, 농도 의존적으로 MMP-2와 MT1-MMP는 유전자 발현을 억제했지만, TIMP-2의 유전자 발현에서는 변화가 없었다. 이는 MMP-2의 활성화는 TIMP2에 의한 것이 아님을 시사하였다.
- 먼저 naringenin이 암세포의 침윤에 미치는 영향을 알아보기 위해 invasion assay를 한 결과, naringenin이 암세포의 침윤을 농도 의존적으로 억제시켰다. 암의 침윤에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 단백질분해효소인 matrix metalloproteinases (MMPs)의 활성도를 측정하기 위해 gelatin zymography를 한 결과, naringenin이 MMP-9, -2의 효소 활성도를 농도 의존적으로 감소시켰다. 또한 MMP-9, -2, MT1-MMP의 유전자 발현에 대한 naringenin의 영향을 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 방법으로 조사한 결과, naringenin이 MMP-9, -2와 MT1-MMP의 mRNA 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다.
- 그 결과, naringenin을 HT1080세포에 25, 50, 100, 200, 400 μM 농도로 24 well plate에서 24시간 동안 배양한 후 처리하여 대조군과 비교한 결과 100 μM 이하의 naringenin 농도에서는 약 90%의 높은 세포 생존율을 보였고, 200 μM에서는 64%의 세포생존율을, 400 μM에서는 37%의 세포 생존율을 나타냈다. 이 결과를 통해 naringenin의 처리 농도 의존적으로 세포 생존율이 감소되었다. 따라서 이후 실험에서는 세포독성에 영향을 미치지 않는 25, 50, 100 μM 농도의 naringenin을 처리하여 실험하였다(Fig.
- 이러한 naringenin의 MMP-2, -9의 효소 활성 억제가 유전자 발현에 의해 억제되는지를 RT-PCR를 이용해 확인해 본 결과, naringenin 모두에서 MMP2, -9 유전자 발현을 농도 의존적으로 저해효과를 나타냄을 관찰할 수 있었다.
- 먼저 PMA에 의해 유발된 MMP-2, -9의 효소 활성을 naringenin이 억제 시키는지 알아본 결과, naringenin의 처리농도 의존적으로 MMP-2, -9의 효소의 활성은 저해됨을 확인하였다. 이러한 결과는 naringenin이 암세포주인 HT1080 세포에서 MMP-2, -9 효소 활성을 억제하는 데 효과가 있음을 확인하였다.
- 이러한 결과를 종합해 볼 때, naringenin은 전이에 관여하는 인자인 MMP-2, -9 및 MT1-MMP의 발현을 저해함으로써 전이억제 효과를 나타낼 가능성을 보여주었다. 현재 임상적으로 사용되는 효과적인 전이 억제 약물이 부족한 실정이고 대부분이 생명을 위협하는 부작용을 가지고 있다.
- 특히 25 μM 이상에서 MMP-2, -9, MT1-MMP의 발현이 현저하게 감소하는 것을 알 수 있었다.
후속연구
- 현재 임상적으로 사용되는 효과적인 전이 억제 약물이 부족한 실정이고 대부분이 생명을 위협하는 부작용을 가지고 있다. 따라서 naringenin을 이용한 암전이 억제 및 예방물질의 개발이 기대되며 향후 보다 폭넓은 연구가 진행되어야 할 것이다.
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