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문제 정의
- 한다. 따라서 본 연구는 최근에 국내 양돈장의 PCVD 발병 돈에서 분리된 PCV2 국내 분리주에 대한 유전자 염기서열을 분석하여 기존에 보고된 국내 분리주 및 외국 분리 주와의 유전적 특성을 비교 분석하였다.
제안 방법
- coli (TOP 10) kit (Invitrogen Corp)의 방법에 따라 tTansformation시켰다. 20|11 kanamycin(50mg/ ml, Sigma, USA)과 20|il X-gal (50mg/ml, Promega, USA)을 함유한 LB plates (DIFCO, USA)에서 흰색 또는 연한 파란색의 집락을 선택하여 niiniprep kit (Pro- mega)로 DNA를 추출한 뒤 제한효소 EcoR I(MBI)으로 처리한 다음 agarose gel에 전기영동하여 삽입된 DNA를 확인하였다. DNA 염기서열은 ABI PRISM® 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA)로 분석하였고, 분석된 염기서열은 DNASTRAR version 2.
- 5종의 PCV2 국내 분리주(KPCV201, KPCV202, KPCV203, KPCV204 및 KPCV205)에 대한 전체 유전자 염기서열을 분석하기 위하여 제작된 4종의 primer pair를 이용하여 PCR 및 cloning을 실시하였고, 이들 cloning 유전자단편의 염기서열을 분석한 후 DNA-STAR 프로그램으로 재배열하여 PCV2 국내 분리주에 대한 전체 유전자염기서열지도를 작성하였던 바 Fig. 1 과 같다.
- 20|11 kanamycin(50mg/ ml, Sigma, USA)과 20|il X-gal (50mg/ml, Promega, USA)을 함유한 LB plates (DIFCO, USA)에서 흰색 또는 연한 파란색의 집락을 선택하여 niiniprep kit (Pro- mega)로 DNA를 추출한 뒤 제한효소 EcoR I(MBI)으로 처리한 다음 agarose gel에 전기영동하여 삽입된 DNA를 확인하였다. DNA 염기서열은 ABI PRISM® 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA)로 분석하였고, 분석된 염기서열은 DNASTRAR version 2.1 software를 이용하여 기존에 검출된 33주 북미, 유럽, 아시아 및 국내 분리주의 염기 및 아미노산서열과 비교분석하였고 Cheung 등(2007)의 분류방법에 따라 PCV2a와 PCV2b로 분류하였다(Table 2).
- PCV2 국내 분리주의 유전적 특성 규명하고자 PCVD으로 진단 받은 돼지로부터 분리한 5개의 국내 분리주와 이전에 검출된 국내 분리주 및 외국 분리주간의 유전자 염기와 아미노산 서열을 분석하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- PCV2의 cloning 및 염기서열 분석을 위하여 PCR 반응 산물을 GENECLEAN®Turbo kit (BIO101, USA) 로정 제하였다. pCR® 2.
- 제하였다. pCR® 2.1-TOPO® kit (Invitrogen Corp, US A) 를 사용하여 정제된 DNA 4μl, TOPO vector 1μl, salt solution 1μl를 혼합한 후 5분간 실온에서 ligation 하였다. Ligation 반응물 2μl를 one shot® chemically competent E.
- 활발히 수행되고 있다. 국내 분리주의 유전적 특성과 외국 분리주와의 상관성 여부를 알아보고자 PCVD 발병돈의 조직시료에서 분리한 PCV2에 대한 유전자 염기 및 아미노산 서열 분석을 실시하였다.
- 국내에서 전형적인 임상증상, 특징적인 조직병리학적 병변 및 조직내 PCV2 항원이나 핵산의 검출 등 3 가지 기준을 통해 PCVD로 진단된 5두의 이유자돈을대상으로 PCV2의 유전자 검출을 위하여 이용하였다.
- 5mM MgCl2, 멸균된 증류수 32μl를 첨가한 50㎕의 반응액을 94℃ 5분간 1차 반응시킨 다음, 94℃에 45초, 52℃ 45초, 72℃ 1분씩 30회 반응시킨 후 최종 72℃에서 10분간 반응시켰다. 증폭된 PCR산물의 확인은 TAE buffer (40mM Tris acetate, ImM EDTA, pH 8.0)를 전해질로 사용한 1 % agarose gel에서 전기 영동을 실시한 후, 40mM etidium bromide용액에서 gel을 염색하여 UV transilluminator (Vilberlour- mat, France)로 생성된 band# 확인하였으며 DNA markei로는 lOObp DNA ladder (Promega, USA)를 사용하였다.
- 폐, 간, 비장, 편도 및 림프절 등의 조직을 균질화하여 5% PBS 부유액을 원심분리하고 상층액을 보관하면서 DNeasy® Mini kit(QIAGEN, Germany)를 이용하여 제조사의 술식 에 따라 DNA를 추출하였다.
대상 데이터
- 또한 KPCV205는 일본주(AB072303, AB072301), 2005년 이전 북미주(AF027217)와 같은 계 열에 속하였고 유전적으로 밀접한 근연관계를 나타내었으며 아시아주인 대만, 일본(AB072301, AB072302) 및 다른 2005년 이전 북미주와 함께 큰 PCV2a 계열을 구성하였다(Fig. 3). ORF2 유전자 염기서열에 의한 phylogenetic tree 분석 결과도 일부 분리주간에 상동성에 다소 차이가 있을 뿐 전체 염기서열 분석결과와 유사한 양상을 나타내었다.
- 국내 분리주인 KPCV201, KPCV202, KPCV203 및 KPCV204와 유럽 분리주인 네덜란드, 영국 및 프랑스(AY321985)분리주와 함께 같은 계열에 속하였고 다른 계열에 속하는 2005년 북미 분리주와 같은 그룹에 속하였으며 유전적 밀접한 근연관계를 나타내었다. 이 그룹은 중국주(DQ195679), 프랑스주(AY322003)와 합께 다른 중국(AY686763, AY556476 및 AY713470) 및 독일주(AY713470)와 함께 큰 PCV2b 계열을 구성되었다(Fig. 3).
이론/모형
- 1-TOPO® kit (Invitrogen Corp, US A) 를 사용하여 정제된 DNA 4μl, TOPO vector 1μl, salt solution 1μl를 혼합한 후 5분간 실온에서 ligation 하였다. Ligation 반응물 2μl를 one shot® chemically competent E. coli (TOP 10) kit (Invitrogen Corp)의 방법에 따라 tTansformation시켰다. 20|11 kanamycin(50mg/ ml, Sigma, USA)과 20|il X-gal (50mg/ml, Promega, USA)을 함유한 LB plates (DIFCO, USA)에서 흰색 또는 연한 파란색의 집락을 선택하여 niiniprep kit (Pro- mega)로 DNA를 추출한 뒤 제한효소 EcoR I(MBI)으로 처리한 다음 agarose gel에 전기영동하여 삽입된 DNA를 확인하였다.
- 국내에서 분리된 PCV2 전체 유전자의 분석은 Gen- Bank entry AF027217을 참고하여 4종의 primer를 합성하여 PCR 증폭 위해 사용하였다(Hamel 등, 1998)(Table 1).
성능/효과
- 한국, 일본, 중국 및 대만 등 아시아주는 북미주와 유럽주의 PCV2a와 PCV2b의 계열에 분포되었고, 2005~2006년 북미주는 PCV2b 계열에 분포되 었다. 4주 국내 PCV2b주는 유럽주와 같은 계열에 속하였고 매우 밀접한 유전자 근연관계를 보였으며 네덜란드, 영국 및 프랑스 등 유럽주와 근연관계가 있는 것으로 추정되었다. 동시 2005~2006년 북미주와도 밀접한 유전자 근연관계를 보였다.
- KPCV201, KPCV202, KPCV203 및 KPCV204는 ORF2 부위에 해당하는 1, 042번째 염기서열에 1 개의 nucleotide (thymidine: T) 7} deletion 되어 1, 767개의 nucleotides로 구성되어 있었다. KPCV205는 ORF2의 262-CCCCGC-267 염기 및 88-PR-89 아미노산을 갖고 있어 PCV2a genotype로 분류되었고, 반면에 KPCV201, KPCV202, KPCV203 및 KPCV204는 262-AAAATC-267 염기 및 88-KI-89 아미노산을 갖고 있어 PCV2b genotype로 분류되었다(Fig. 1).
- 보고했다. ORF2에 대한 유전자염기 및 아미노산 서열 분석결과, 4종의 PCV2b 분리주간에는 99.3%, 99.1% 이상인 높은 염기 및 아미노산 상동성을 나타내었고 국내 PCV2a주와 비교시 각각 92.3~92.7%, 91.9~92.3%의 낮은 상동성을 나타내었다. 국내 분리주간에 ORF 2는 유전적 차이가 있는 것으로 생각된다.
- 7% 비교적 높은 상동성을 보였고 이전 국내주 및 외국주와 비교시 유사한 염기 및 아미노산 상동성을 보였다. ORF2의 염기 및 아미노산 분석에는 국내 PCV2b주간에 각각99.3%, 99.1% 이상의 높은 상동성을 나타내었고 국내 PCV2a 주와 비교시 각각 92.3~92.7%, 91.9~92.3%의 매우 낮은 상동성을 나타내었다. 유럽 분리주의 네델란드, 영국 및 프랑스주(AY321985)와 비교시 염기는 99.
- 특히 PCV2b주의 KPCV202는 네덜란드 분리주의 AY484009와 100% 상동성을 나타내었다. capsid protein의 아미노산 서열비교분석결과 ORF2의 시작부위로부터 residues 59~91, 121-136 및 190-210 3개 greater heterogeneity 구간이 존재하는 것을 확인하였다(Fig. 2).
- PCV2b주별로 62~74개의 nucleotides가 point mutation되어 있는 것으로 확인되었다. 국내 PCV2 b 분리주는 AF027117 및 AY484009와 비교시 PCV2 b 주별로 63~77개와 14~18개 nucleotides7} point mutation되어 있는 것으로 확인되었다(Fig. 1).
- 국내 PCV2a 및 PCV2b분리주 간의 ORF1 염기는 97.8-99.4%, 아미노산은 98.1 ~99.7% 비교적 높은 상동성을 보였고 이전 국내주 및 외국주와 비교시 유사한 염기 및 아미노산 상동성을 보였다. ORF2의 염기 및 아미노산 분석에는 국내 PCV2b주간에 각각99.
- 3%의 높은 상동성을 보였다. 국내 PCV2b분리주는 유럽주 및 2005~2006년 북미주간에 높은 유전적 특성을 보였고, 일본 및 대만 분리주와 비교 시 95.2~96.4%의 상동성을 보였다. 따라서 PCV2의 genome는 지역적으로 유전적 차이를 보였다.
- 국내 PCV2b주간에 안정된 양상을 나타내고 있었고 PCV2a주와는 차이를 보여 국내분리주간에 유전적 차이가 있는 것으로 생각된다. 국내 PCV2b분리주는 유럽주(네덜란드, 영국 및 프랑스) 및 2005~2006년 북미주와 비교시 각각 99.2~ 99.5%, 98.9~99.3%의 높은 상동성을 보였다. 국내 PCV2b분리주는 유럽주 및 2005~2006년 북미주간에 높은 유전적 특성을 보였고, 일본 및 대만 분리주와 비교 시 95.
- 국내 분리주 5주의 염기서열을 북미 PCV2a주인 AF027217 과 유럽 PCV2b주인 AY484009와 비교한 결과 4개 국내 PCV2b주간에는 11~16개의 nucleotides가 point mutation 되어 PCV2a주인 KPCV205와 비교 시 PCV2b주별로 62~74개의 nucleotides가 point mutation되어 있는 것으로 확인되었다. 국내 PCV2 b 분리주는 AF027117 및 AY484009와 비교시 PCV2 b 주별로 63~77개와 14~18개 nucleotides7} point mutation되어 있는 것으로 확인되었다(Fig.
- 등, 1998). 국내 분리주간에 ORF1의 염기는 97.8-99.4%, 아미노산은 98.1 ~99.7%의 비교적 높은 상동성을 나타내었고 이전 한국분리주 및 외국주와 비교 시 유사한 염기 및 아미노산 상동성을 나타내었다. 따라서 PCV2 국내분리주의 ORF1는 안정성이 높다고 사료된다.
- 분류되었다. 국내 분리주인 KPCV201, KPCV202, KPCV203 및 KPCV204와 유럽 분리주인 네덜란드, 영국 및 프랑스(AY321985)분리주와 함께 같은 계열에 속하였고 다른 계열에 속하는 2005년 북미 분리주와 같은 그룹에 속하였으며 유전적 밀접한 근연관계를 나타내었다. 이 그룹은 중국주(DQ195679), 프랑스주(AY322003)와 합께 다른 중국(AY686763, AY556476 및 AY713470) 및 독일주(AY713470)와 함께 큰 PCV2b 계열을 구성되었다(Fig.
- 국내에서 분리된 PCV2 분리주와 기존에 보고된 국내, 북미, 유럽 및 아시아 분리주들과의 유전자의 근연 관계를 조사하기 위해 전체 염기서열 phylogenetic tree를 작성하여 비교한 결과, 총 38주는 유전자 염기 길이(1768nt와 1767nt)에 따라 2개 큰 계열(PCV2a, PCV2b)로 분류되었다. 국내 분리주인 KPCV201, KPCV202, KPCV203 및 KPCV204와 유럽 분리주인 네덜란드, 영국 및 프랑스(AY321985)분리주와 함께 같은 계열에 속하였고 다른 계열에 속하는 2005년 북미 분리주와 같은 그룹에 속하였으며 유전적 밀접한 근연관계를 나타내었다.
- 4%의 낮은 상동성을 보였다. 또한 국내 PCV2a주는 이전 국내 분리주(PC201DJ, PC201SS 및 PCK101)와 비교시 97.3-99% 비교적 높은 상동성을 나타내었고 일본(AB072303) 및 2005년 이전 북미주(AF027217, AJ223185)와 비교시 99~99.3%의 더 높은 상동성을 나타내었다.
- 국내 분리주간에 ORF 2는 유전적 차이가 있는 것으로 생각된다. 또한 국내 PCV2b분리주는 유럽주 및 2005~2006년 북미주와 99~100%의 높은 유전자 염기 상동성을 보였고 특히 네덜란드 분리주와는 완전 일치하였다. 국내 PCV2 b 주와 유럽주 및 2005~2006년 북미주간에 항원성 및 병원성과 관련된 유전적 특성이 매우 일치한 것으로 생각한다.
- An 등(2007)의 PCV2a genotype는 2004년까지 농장에서 유행하였고 그 후 2005~2006년에는 PCVD으로 발병한 돼지에서 PCV2b genotype만 검출되었다고 하였다. 본 연구에서 국내 분리주 중 4주는 PCV2b genotype로 분류되 었고, 1주는 PCV2a genotypes 분류되어 현재 국내 PCVD 일으키는 dominant genotype는 PCV2b 인 것으로 사료되며 동시 PCV2a genotype도 존재하는 것으로 나타났다. 이는 Gagnon 등(2007)이 보고한 2005~2006년 캐나다의 dominant genotype으로 확인된 PCV2b 것과 동일한 pattern으로 나타냈었다.
- 3%의 매우 낮은 상동성을 나타내었다. 유럽 분리주의 네델란드, 영국 및 프랑스주(AY321985)와 비교시 염기는 99.1 ~ 100%, 아미노산은 98.7~100% 매우 높은 상동성을 보였고 2005~2006년 북미 분리주와 비교시 염기는 99 ~99.4%, 아미노산은 98.7~99.1% 높은 상동성을 보였다. 특히 PCV2b주의 KPCV202는 네덜란드 분리주의 AY484009와 100% 상동성을 나타내었다.
- 이상의 연구결과를 통하여 최근 국내에서 문제되고있는 PCV2는 북미와 유럽에서 발생되고 있는 PCVD의 PCV2와 밀접한 관련이 있는 것으로 추정된다. 본연구를 통하여 얻어진 PCV2 국내 분리주의 유전적 정보는 향후 진단법 개발이나 병원성 규명 등에 유용하게 사용되어질 것으로 판단된다.
- 전체 염기서열에 의한 phylogenetic analysis 근연관계 분석 결과, 국내 PCV2b분리주는 유럽주와 같은 계열에 속하였고 2005~2006년 북미 분리주와도 밀접한 유전자 상관관계를 보였다. 국내 PCV2a주는 일본, 2005년 이전 북미주와 같은 계열에 속하였다.
- (Fenaux 등, 2000; Olvera 등, 2007). 전체 염기서열은 국내 PCV2b주간에 11~16개 염기차이를 나타냈으며 99.1 ~99.4%의 높은 상동성을 나타내었다. PCV2 a 주와 비교 시 62~74개 큰 염기차이를 나타냈으며 95.
- 전체 유전자 염기서열을 비교하여 phylogenetic anal- ysis로 유전적 근연관계를 분석한 결과, 38개 한국주 및 외국주는 2005년 이전에 분리된 북미주 위주로 구성된 PCV2a계열과 유럽주 위주로 구성된 PCV2 b 계열로 나누어졌었다. 한국, 일본, 중국 및 대만 등 아시아주는 북미주와 유럽주의 PCV2a와 PCV2b의 계열에 분포되었고, 2005~2006년 북미주는 PCV2b 계열에 분포되 었다.
- 전체 유전자염기서열 분석에는 PCV2b주간에 99.1- 99.4% 높은 상동성을 나타내었고, PCV2a주와 비교시 95.4~96.2% 상동성을 나타내었다. 이전 국내 분리 주와 비교시에도 95.
- 전체 유전자염기서열을 분석한 결과 국내 분리주 중 1주는 1, 768 nucleotides로 구성되어 있고 4주는 1, 767 nucleotides로 구성되어 있었으며 각각 PCV2a 및 PCV2b로 분류되었다. PCV2b주는 1, 042번째 염기서열의 thymidine가 deletion되어 ], 767개의 nucleotide로구성되 었다.
- 3% 높은 상동성 나타내었다. 중국분리주(DQ195679)와 비교시 98.1 ~98.7%의 상동성을 보였고 다른 아시아 분리주인 일본주와 대만주의 비교 시 95.2~96.4%의 낮은 상동성을 보였다. 또한 국내 PCV2a주는 이전 국내 분리주(PC201DJ, PC201SS 및 PCK101)와 비교시 97.
후속연구
- 본연구를 통하여 얻어진 PCV2 국내 분리주의 유전적 정보는 향후 진단법 개발이나 병원성 규명 등에 유용하게 사용되어질 것으로 판단된다.
- 국내 PCV2b주의 ORF2 57~91 아미노산 구역은 국내 PCV2a주 및 다른 PCV2a주와 비교시 아미노산 residue 57은 V-[로, 59은 A--R로, 63은 R—K로, 77 은 D—N로, 80은 V—L로, 86은 T—S로, 88은 K—P 로 89은 I-R로, 91은 I—V로 변환되었고, 121~136 번 구역에서는 공통적으로 121은 T—S로, 131은 P—T 로, 136은 Q—L로 변환되었다. 이런 PCV2a와 PCV2b 간의 유전적 차이가 virulence 차이를 나타낼 수 있는지, PCV2b가 국내 PCVD 일으기는 dominant genotype으로 향후 보다 많은 원인의 규명이 필요할 것으로 사료된다.
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