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문제 정의
- 중요하다고 생각된다. 그러므로 본 연구에서는 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 생쥐의 등과 목 부위에 카모마일 저먼을 발라서 IgE와 IgGl의 변동과 카모마일 저먼의 임상적 효과를 육안으로 검증하여 향후 대체 요법으로써의 아로마 오일에 관한 다양한 연구를 진행하는데 도움을 주고 나아가 아토피 환자의 치료에 활용할 수 있는 기초 자료를 얻고자 하였다.
제안 방법
- 10주령의 NC/Nga 생쥐의 피부염은 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는Matsuda법을 참고하여 Normal군 (10주령의 NC/Nga 생쥐로 오일이나 연고를 바르지 않은 그룹, 이하 Normal군이라 칭함) control군(카모마일 도포하지 않고 BMAC를 도포한 그룹, 이하 control군으로 칭함)과 MR군(카모마일 오일을 도포한 그룹, 이하 MR군이라 칭함) 을 BMAC를 바르고 약 투여 종료 후 13주령에서 16주령까지의 생쥐를 육안평가하였다 아토피 피부염 평가법은 1주일 간격으로 4주간 평가하였다. 육안평가 항목은 소양 행동을 동반한 홍반 (erythema, hemorrhage), 린설 및 가피 (dryness /scarring), 부종(edema), 표피 박리와 짓무름 및 , 태 선화(excoriation /erosion, lichenification) 등의 5가지 항목으로 하고, 육안평가 결과는 각 항목을 평가한 점수를 총합하여 평균을 구하였다.
- 8주령의 NC/Nga 생쥐를 미리 아토피 피부염을 유발시킨 NC/Nga 생쥐와 2주간 같은 공간에서 동시 사육하여 항원감작을 하였다. 눈에서 capUlary 관을 이용하여 100 以의 혈액을 채혈한 후 마취제인 chloral hydrate (10%)로 마취한 후 귀, 등, 목 부위를 깨끗하게 제모 제로 제모하였고, 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다.
- BMAC 도포한 지 2주 후에 카모마일 저먼을 12주령의 생쥐부터 16주령까지 4주간 오전 11시에 1회씩 매일 도포하였다. 또한 양성 대조 약물로 FK506 (tacrolimus) 0.
- 5%를 기본으로 하여 만들어졌다. BMAC> 1주에 2회씩 3주 동안 NC/Nga 생쥐의 등과 목 부분에 고르게 도포하였다. BMAC를 도포하기 2~3시간 전에 4% SDS를 분무하여 피부층을 파괴하였다.
- BMAC> 1주에 2회씩 3주 동안 NC/Nga 생쥐의 등과 목 부분에 고르게 도포하였다. BMAC를 도포하기 2~3시간 전에 4% SDS를 분무하여 피부층을 파괴하였다. 피부염이 충분히 유발되고 생쥐가 긁는 행동을 심하게 하는 시기인 2주 후부터 육안 평가를 실시하였다
- NC/Nga 생쥐의 눈에서 10주, 12주, 16주에 capillary 관을 이용하여 약 100 成의 혈액을 채혈한 후 원심분리기 6, 500 rpm에서 20분간 원심분리한 후 30 迎의 혈청을 분리하였다. 혈청은 취하여 -70℃에 냉동 보관하였다.
- 다시 2회 수세 후 완충용액으로 세척한 다음 antibody Avidin-HRP conjugated 100 成를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. TMB 기질을 100 成씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 후 100 以의 stop 용액을 처리한 후 ELISA reader 450 飾에서 흡광도를 측정하였다.
- NC/Nga 생쥐의 혈청 내 IgE와 IgGl의 농도 측정은 enzyme-linked immuno sorbent assay로 즉정하였다. 각 well에 NC/Nga 생쥐에서 10주, 12주, 그리고 16주에 채혈한 혈청 5 成 (1/10 dilution)와 dilution buffer 45 以를 혼합하여 각 well 에 분주하고, 2시간 동안 25℃ 실온에서 방치한 후 2회 washing 완충용액으로 세척한 다음 antibody biotin-IgE, IgGl에 conjugated 를 넣고 2시간 방치하였다. 다시 2회 수세 후 완충용액으로 세척한 다음 antibody Avidin-HRP conjugated 100 成를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다.
- 육안평가 항목은 소양 행동을 동반한 홍반 (erythema, hemorrhage), 린설 및 가피 (dryness /scarring), 부종(edema), 표피 박리와 짓무름 및 , 태 선화(excoriation /erosion, lichenification) 등의 5가지 항목으로 하고, 육안평가 결과는 각 항목을 평가한 점수를 총합하여 평균을 구하였다. 각각의 항목은 아토피 증상을 관찰하여 없음 (0), 약함 (1), 중증도 (2), 심함 (3) 으로 채점하였다.
- 3%를 매주 5회 발진 된 등 부위에 도포하였다. 그리고 1주 간격으로, 관능평가를 실시한 다음 혈액을 채혈하고 등 부위의 피부를 절제하여 10% 포르말린 용액에 담아 보관하였다.
- 항원감작을 하였다. 눈에서 capUlary 관을 이용하여 100 以의 혈액을 채혈한 후 마취제인 chloral hydrate (10%)로 마취한 후 귀, 등, 목 부위를 깨끗하게 제모 제로 제모하였고, 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 피부염을 유발시키기 위하여 사용된 연고는 Biostir Mite Antigen Cream (BMAC, 중앙실험동물 사 제공)이다.
- 본 연구에서는 아토피 피부염을 유발시킨 10주령의 NC/Nga 생쥐 모델에 아토피 피부염의 대표적인 증상인 항염증, 상처치유, 피부발진과 두드러기에 효과가 있다고 알려진 카모마일 저먼을, 실험동물의 등과 목부위에 발라서 육안 평가와 혈청 내 IgE와 IgGl의 변동을 측정하여 아토피 피부염 완화 효과를 검증하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 간격으로 4주간 평가하였다. 육안평가 항목은 소양 행동을 동반한 홍반 (erythema, hemorrhage), 린설 및 가피 (dryness /scarring), 부종(edema), 표피 박리와 짓무름 및 , 태 선화(excoriation /erosion, lichenification) 등의 5가지 항목으로 하고, 육안평가 결과는 각 항목을 평가한 점수를 총합하여 평균을 구하였다. 각각의 항목은 아토피 증상을 관찰하여 없음 (0), 약함 (1), 중증도 (2), 심함 (3) 으로 채점하였다.
- BMAC를 도포하기 2~3시간 전에 4% SDS를 분무하여 피부층을 파괴하였다. 피부염이 충분히 유발되고 생쥐가 긁는 행동을 심하게 하는 시기인 2주 후부터 육안 평가를 실시하였다
- ) 와 물을 충분히 공급하였다. 환경 조건은 온도 22±2℃, 습도 55 ±15%, 조명조건은 하루 중 12시간은 200-300 Lux 로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였으며, 생쥐를 2 주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 아로마 오일은 Chamomile German (Matricaria recutita, 이하 MR라 한다)으로 60kg인 사람의 경우 1.5%의 오일을 사용한다는 것을 감안하여 체중이 20g인 실험용 생쥐에는 0.025% 오일을 사용하였다. 실험용 오일은 La Selection (한국 아로마테라피협회)사의 essential oil을 사용하였다.
- 025% 오일을 사용하였다. 실험용 오일은 La Selection (한국 아로마테라피협회)사의 essential oil을 사용하였다.
- 암컷 6주령의 SPF NC/Nga 생쥐는 체중 15-20g의 Charles River JapanfYokohama, Japan)사에서 공급받았다. 동물은 실험 당일까지 고형사료(조단백질 22.
데이터처리
- The level of lgG1 were determined using a commercially available ELISA kit. Statistically significant value compared with Nc/Nga mice group data by student's t-test (p<0.01).
- 실험으로부터 얻어진 결과는 평균土표준편차로 기록하였고, 유의성 검증은 Student's t-test 분석법을 사용하였다.
이론/모형
- 육안평가에서는 NC/Nga 생쥐의 등부위에 나타난 아토피 피부염 발현 및 오일 도포 효과에 관한 것을 사진과. Matsuda법으로 관찰하였다. MR군과 FK506군은 control군과 비교하여 볼 때 FK 506과 MR군이 아토피 증상이 완화되었음을 볼 수 있었다.
- 혈청은 취하여 -70℃에 냉동 보관하였다. NC/Nga 생쥐의 혈청 내 IgE와 IgGl의 농도 측정은 enzyme-linked immuno sorbent assay로 즉정하였다. 각 well에 NC/Nga 생쥐에서 10주, 12주, 그리고 16주에 채혈한 혈청 5 成 (1/10 dilution)와 dilution buffer 45 以를 혼합하여 각 well 에 분주하고, 2시간 동안 25℃ 실온에서 방치한 후 2회 washing 완충용액으로 세척한 다음 antibody biotin-IgE, IgGl에 conjugated 를 넣고 2시간 방치하였다.
성능/효과
- 1. 육안평가에서는 NC/Nga 생쥐의 등부위에 나타난 아토피 피부염 발현 및 오일 도포 효과에 관한 것을 사진과. Matsuda법으로 관찰하였다.
- 2.혈청 내 IgEe Norrmal군보다, Control군에서는 약 25% 이상 증가되었다. FK 506군과 MR군은 contr이군에비하여 혈청 내 IgE양이 감소하였음을 볼 수 있었다.
- 이는 아토피 증상이 심할수록 그에 비례하여 IgE양이 증가한다고 하는데 본 연구에서도 아토피 증상이 심해질수록 IgE의 수준이 높아졌다. FK506 군과과 MR 군은 cotrol군에 비하여 혈청 내 IgE 양이 유의적으로 감소함을 볼 수 있었다 (p<0.01). 즉, 병원에서 임상용으로 쓰이는 FK506과 카모마일 저먼 오일을 아토피 피부염을 가진 생쥐에 도포했을 때 아토피 피부염에 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.
- Matsuda법으로 관찰하였다. MR군과 FK506군은 control군과 비교하여 볼 때 FK 506과 MR군이 아토피 증상이 완화되었음을 볼 수 있었다.
- 이러한 결과는 FK 506은 T세포에서의 사이토카인 생산을 억제하고 (Andersson 등, 1992; Wang 등, 1993), 비만세포로부터의 히스타민 방출을 저해하며(Paulis 등, 1991), 동물이나 사람에 있어서도 알러지 반응을 지연시키는(Meingassner & Stutz, 1992) 기능을 가지고 있어서 아토피 피부염을 완화시켰다고 생각된다. MR군은 카모마일 저 먼 오일을 도포한 것으로 약간의 홍반이 관찰되었지만 control군에 비교하여 볼 때 카모마일 저 먼 오일의 도포가 아토피 증상을 완화하는데 효과가 있음을 볼 수 있었다. 이는 유강목 (2006)이 지적한 바와 같이 카모마일의 하이드로카본 옥사이드, 아줄렌 등의 성분이 항염증이나 상처치유 등에 도움을 준 것으로 사료된다.
- 진드기 항원을 피부에 도포하여 아토피 피부염을 유발 시킨 후 아무것도 처치하지 않은 control군과 FK506군, MR군에 대한 육안평가 결과를 점수화하여 나타낸 것이다. 등에 진드기 항원을 도포하였을 때 4주까지는 피부발진 점수가 현저하게 증가하였고, FK 506군과 MR군은 control군에 비하여 피부발진 점수가 현저하게 감소되는것을 확인할 수 있었다(p<0.001). 그러나 FK506군과 MR 군간의 차이는 볼 수 없었다.
- 할 수 있었다. 또한 혈청 내 IgE와 IgGl의 양이 유의적으로 감소함도 확인되었다. 이러한 효과는 FK 506 도포 시도 볼 수 있었는데 FK 506을 장기간 사용할 경우 부작용이 있다는 것을 감안하면, 천연 식물에서 얻은 카모마일 저먼 오일을 대체의학으로서의 아토피 피부염에 접근할 수 있는 가능성을 제시한다고 생각된다.
- 혈청 내 IgE를 측정한 결과이다. 본 실험에서의 IgE양은 8주령(Normal군) 이후 NC/Nga 생쥐에 아토피 피부염을유발시킨 결과, Mite를 도포하지 않은 Normal군보다, control군에서느 약 25% 이상 IgE 수준이 증가되었다. 이는 Nite에 의하여 IgE 양이 증가됨을 알 수 있다.
- 이로부터 NC/Nga 생쥐에 카모마일 저 먼 오일을 적용시켰을 때, 아토피 피부염을 가진 효과를 육안으로 확인 할 수 있었다. 또한 혈청 내 IgE와 IgGl의 양이 유의적으로 감소함도 확인되었다.
- 01). 즉, 병원에서 임상용으로 쓰이는 FK506과 카모마일 저먼 오일을 아토피 피부염을 가진 생쥐에 도포했을 때 아토피 피부염에 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다. 이는 안영희와 최정숙 (2003) 이 지적한 카모마일의 적용과 효능이 아토피의 주요 증상인 소양감을 제거하고 소독 및 소염작용과 항알레르기 작용이 있다는 것을 나타내는 결과라고 할 수 있다.
후속연구
- 또한 혈청 내 IgE와 IgGl의 양이 유의적으로 감소함도 확인되었다. 이러한 효과는 FK 506 도포 시도 볼 수 있었는데 FK 506을 장기간 사용할 경우 부작용이 있다는 것을 감안하면, 천연 식물에서 얻은 카모마일 저먼 오일을 대체의학으로서의 아토피 피부염에 접근할 수 있는 가능성을 제시한다고 생각된다.
- 이의 결과로 볼 때 카모마일 저먼의 오일도포가 아토피 피부염에 효과가 있음을 확인할 수 있었으며, 향후 대체 요법으로써의 아로마 오일에 관한 다양한 연구가 과학적인 검증을 통해 활발히 이루어진다면 아토피 피부염의 근본적인 치료에 도움을 줄 수 있는 결과를 얻을 것이라고 생각된다.
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