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문제 정의
- 이에 MK1의 균체외다당류가 유용한 생리활성물질로 개발 될 수 있다고 사료되어, 균체외다당류의 생산, 물성, 화학 구조 및 생리-생화학 성질에 관심을 갖게 되었다. 본 논문에서는 우선 MK1 균주의 최적 성장 조건을 알아보고 최적 성장 환경에서 얻은 균체외다당류의 몇 가지 물리화학적 성상을 조사하였다.
- 우리 실험실에서도 MK1 균주의 균체외다당류가 쥐과 동물의 거식세포를 자극하여 nitric oxide, TNF-α, IL-1β 생산성이 증가한다고 보고한 바 있다(28). 이와 관련하여 MK1 균주의 균체외다당류의 구조를 분석하여 신물질 인지 여부를 밝히는 연구를 수행 중이다.
가설 설정
- 따라서 배양기의 온도 조절이 보다 용이한 30℃를 최적 성장 온도로 삼았다. MK1 균주는 절대 호기성 세균이라 교반속도가 높을수록 성장도 좋고 균체외다당류의 생산성도 높을 것이다. 배양액의 교반속도가 200 rpm일 때 균의 성장이 더 좋았다 (Table 1).
제안 방법
- 무름병 원인을 규명하고자 무름병소에서 미생물을 탐색하였는데, 광합성 세균 한 균주, 타가 영양균 네 균주를 분리·동정하였다(27).
- 왓트만 3 mm 종이(12×30 cm)에 DW에 녹인 가수분 해산물을 약 200 µg을 점적한 후 n-butanol:acetic acid:DW(3:1:1, v/v/v) 액에서 전개하였다.
- 최적 C/N (w/w) 비를 구할 때는 2% glucose에 각기 다른 농도의 (NH4)2SO4를 첨가하여 조성하였다. MK1의 최적 성장에 요구되는 pH, 교반 속도, 온도는 2%의 glucose가 들어있고 탄소/질소비가 10/1로 조성된 무기염 배지에서 조사하였다. 하루 밤 LB 배양액에서 자란 MK1 균액 10 ml을 탄소, 질소원 함유 무기염화학조성 배지 500 ml에 접종한 후 30℃에서 3일간 진탕 배양(150 rpm)하면서 배양액의 흡광도(OD600)를 측정하고 균의 성장을 specific growth rate로 표시하였다.
- 건조된 균체외다당류를 다시 DW에 용해하고 2일간 15 L의 DW에서 투석(분자량 1,000 Da 이하는 통과)한 후, 균체외다당류를 냉 에탄올로 재침전하고 동결 건조하였다. 이렇게 동결 건조한 균체외다당류로 형태 관찰, 종이 크로마토그라피, 점도 측정 및 분자량을 계측하였다.
- 균체외다당류의 분자량을 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 로 측정하였다(15). 분자량 표준물질로 aprotinin (6.
- )을 사용하였다. 전기영동 후 겔에 있는 균체외다당류와 단백을 우선 50% 메탄올-12% 초산 용액에서 고정하고 0.2% sodium thiosulfate 액에서의 전처리 과정을 거친 후 은 염색하였다(18). 균체외다당류와 단백질 표준분자의 밴드 간의 상대 이동비(Rf 값)에 근거하여 분자량을 구하였다.
- 2% sodium thiosulfate 액에서의 전처리 과정을 거친 후 은 염색하였다(18). 균체외다당류와 단백질 표준분자의 밴드 간의 상대 이동비(Rf 값)에 근거하여 분자량을 구하였다.
- 체외다당류 액 200 ml, acetic acid (7%, v/v)에 녹인 alcian blue 8GX 액(0.0015%) 400 µl, acetic acid (7%) 400 µl로 구성된 반응액을 처음 5분 정도는 완만히 가열, 진탕하고 나중에는 실온에서 2시간 진탕하였다가 30분간 정치한 후 원심분리(9,800×g, 5분)로 얻은 상등액의 흡광도(OD600)를 측정하였다.
- 균 배양액의 흡광도(OD600) 및 효소 반응액의 흡광도(OD420, OD550)를 기록하여 수식에 따라 β-galactosidase unit를 구하였다.
- DW와 균체외다당류 액 10 ml의 유속 시간(second)을 각기 측정한 후 상대점도(# = 균체외다당류 액의 유속 시간/ DW의 유속 시간)를 구하였다. 동결 건조한 균체외다당류를 디지털 사진기, 광학 현미경, 주사전자현미경(S-2500C, Hitachi, Japan)으로 관찰하였다.
- 배양액의 잔여 탄소원 가운데 aldo-당은 DNS법으로, keto당은 Seliwanoff법으로 정량하였다(48). 배양액 1 ml과 DNS 3 ml (DNS 구성: 3,5-dinitrosalicylic acid 7.49 g, NaOH 13.98 g, Rochelle salt 216.1 g, sodium metabisulfite 5.68 g, phenol 5.73 ml, DW를 첨가하여 최종 부피가 1L가 되게 함)을 혼합 후 100℃ 수조에서 5분간 가열, 실온에서 냉각 후 잔여 glucose, galactose, lactose 같은 환원당이 3, 5-dinitrosalicylic acid (DNS)를 환원시켜 생성되는 주황색의 3-amino-5-nitrosalicylic acid의 농도를 OD550에서 측정하였다. Glucose, galactose, lactose로 작성한 표준 곡선을 활용하여 당의 농도를 계량하였다.
- 73 ml, DW를 첨가하여 최종 부피가 1L가 되게 함)을 혼합 후 100℃ 수조에서 5분간 가열, 실온에서 냉각 후 잔여 glucose, galactose, lactose 같은 환원당이 3, 5-dinitrosalicylic acid (DNS)를 환원시켜 생성되는 주황색의 3-amino-5-nitrosalicylic acid의 농도를 OD550에서 측정하였다. Glucose, galactose, lactose로 작성한 표준 곡선을 활용하여 당의 농도를 계량하였다. Fructose 농도는 Seliwanoff법으로 측정하였는데, 배양액 1 ml과 resorcinol [0.
- 5% (w/v) in 3 N HCl] 5 ml을 잘 섞어 100℃ 수조에서 1~2분간 정치하면 형성되는 진홍의 furfural 복합체의 흡광도(OD480)를 재었다. 농도를 달리한 fructose액으로 표준 곡선을 만들었다.
- Glucose 용액으로 표준 곡선을 작성하여 glucose 상응 균체외다당류 정량에 참조하였다. 시료마다 세벌씩 분석하여 평균치를 구하였다. 산성 균체외다당류는 alcian blue 결합 분석법으로 정량하였다(24, 35, 44).
- 이 균주의 세균학적 특성은 보고되었지만(27), 생리적 특성은 연구된 바 없다. 기본 무기염 배지에 각종의 탄소원을 가하고 균을 길러보니 glucose, galactose, fructose, sucrose 첨가 시는 균의 성장이 좋으나 lactose가 첨가되면 성장이 다소 저조하였다(Fig. 1). 균의 성장 곡선과 배지 속의 잔여 탄소원 농도는 서로 반비례하였다(자료 미제시).
- DW와 균체외다당류 액 10 ml의 유속 시간(second)을 각기 측정한 후 상대점도(# = 균체외다당류 액의 유속 시간/ DW의 유속 시간)를 구하였다.
대상 데이터
- 에서, 균체외다당류 염색용 PowerStain™ Silver Stain kit는 ELPIS Biotech(EDP1051, Korea)에서 구입하였다.
- 분자량 표준물질로 aprotinin (6.5 kDa), bovine α-lactalbumin (14.2 kDa), soybean trypsin inhibitor (20.1 kDa), bovine carbonic anhydrase (29 kDa), rabbit glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (36 kDa), chicken ovalbumin (45 kDa) (Sigma-Aldrich Co.)을 사용하였다.
- MK1 균주의 증식에는 LB 배지(Difco)를 사용하였다. 기본 무기염 배지는 1 L DW에 Na2HPO4 4.
- 2로 맞추고 탄소원과 질소원을 보충하였다(23). 탄소원으로 glucose, galactose, fructose, sucrose, lactose, dextrin, potato starch 등을, 질소원으로는 NH4Cl, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, yeast extract를 사용하였다. 최적 C/N (w/w) 비를 구할 때는 2% glucose에 각기 다른 농도의 (NH4)2SO4를 첨가하여 조성하였다.
- 균체외다당류의 구성 원소는 충북대학교 공동실험실습관에서 C, H, N, S, O 원소분석기(EA 1110, CE Instruments, Italy)로 분석하였다. 질소로 충전한 밀폐된 유리관에서 건조된 균체외다당류를 6 N HCl로 16시간 동안 100℃에서 처리하여 가수분해물을 얻었다.
- 왓트만 3 mm 종이(12×30 cm)에 DW에 녹인 가수분 해산물을 약 200 µg을 점적한 후 n-butanol:acetic acid:DW(3:1:1, v/v/v) 액에서 전개하였다. 비교표준물질로 5% (w/v) glucose, galactose, fructose, sucrose, rhamnose, glucuronic acid 용액을 사용했다. 100℃의 건열기에서 15분쯤 종이를 말린 뒤 당 발색 용액인 n-butanol/phthalic acid/aniline (26 ml:0.
- 2% (w/v) ninhydrine-ethanol액을 살포한 후 15분간 100℃에서 건조하였다(60). 아미노기의 표준물질로 5% (w/v) glycine과 glutamic acid액을 사용하였다.
- E. coli KCTC 25923를 β-galactosidase 활성 측정에 대조균으로 사용하였다.
이론/모형
- Lactose 기본 배지에서 자란 MK1 균주의 β-galactosidase 활성은 ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactoside)를 기질로 사용하여 Miller법으로 측정하였다(36).
- 배양액의 잔여 탄소원 가운데 aldo-당은 DNS법으로, keto당은 Seliwanoff법으로 정량하였다(48). 배양액 1 ml과 DNS 3 ml (DNS 구성: 3,5-dinitrosalicylic acid 7.
- Glucose, galactose, lactose로 작성한 표준 곡선을 활용하여 당의 농도를 계량하였다. Fructose 농도는 Seliwanoff법으로 측정하였는데, 배양액 1 ml과 resorcinol [0.5% (w/v) in 3 N HCl] 5 ml을 잘 섞어 100℃ 수조에서 1~2분간 정치하면 형성되는 진홍의 furfural 복합체의 흡광도(OD480)를 재었다. 농도를 달리한 fructose액으로 표준 곡선을 만들었다.
- Glucose 상응 균체외다당류는 phenol-sulfuric acid법으로 정량 하였다(31, 35). 스크류 캡 유리 시험관에 DW에 녹인 균체외다 당류 액 500 µl와 phenol 액(5%, v/v) 300 µl를 넣고 혼합하였다.
- 시료마다 세벌씩 분석하여 평균치를 구하였다. 산성 균체외다당류는 alcian blue 결합 분석법으로 정량하였다(24, 35, 44). 체외다당류 액 200 ml, acetic acid (7%, v/v)에 녹인 alcian blue 8GX 액(0.
성능/효과
- 한편 β-galactosidase를 갖고 있지 않은 MK1 균주가 lactose 배지에서 자란 것이 이용 가능한 오염된 탄소원에 의한 것일 수도 있으나, 균의 성장에 반비례하여 배양액의 lactose가 감소하는 것으로 보아 lactose가 균의 성장에 이용되었다고 사료된다. 무기염 배지에 glucose량을 달리하여 균을 배양한 결과(Fig. 2), 0.5~2% glucose에서는 농도의 구애 없이 균이 잘 생장하나 5%의 glucose에서는 MK1 생장이 다소 줄었다. 이는 고농도 기질에 의한 성장 저해로써 사료되는데 이러한 현상은 Azotobacter vinelandii MTCC 2460 (55), Bacillus polymyxa KS-1 (23), Methylomonas organophilum (8) 등에서 이미 보고된 바 있다.
- 이는 고농도 기질에 의한 성장 저해로써 사료되는데 이러한 현상은 Azotobacter vinelandii MTCC 2460 (55), Bacillus polymyxa KS-1 (23), Methylomonas organophilum (8) 등에서 이미 보고된 바 있다. 질소원으로 NH4Cl, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, yeast extract를 넣은 glucose (2.0%) 최소 배지에서 균을 배양하였을 때 yeast extract 첨가 배지에서 성장이 가장 빨랐으며(0.230 h-1), (NH4)2HPO4에서는 0.17 h-1, (NH4)2SO4와 NH4Cl에서는 0.16 h-1로 다소 차이를 보였다. Yeast extract 첨가 배지에서 빠른 성장을 보이지만, yeast extract에는 유기 질소 이외에 비타민 등 다른 성장 인자도 들어 있을 뿐만 아니라, 당을 정량할 때 감도가 떨어질 수 있으며, (NH4)2HPO4는 배지의 pH 유지에 영향을 줄 수 있어 구하기 쉬운 (NH4)2SO4를 질소원으로 사용하는 것이 무난하다고 사료된다.
- Glucose (2.0%) 최소 배지에 (NH4)2SO4의 농도를 다양하게 조정하여 탄소/질소의 비를 10~80:1로 조절한 후 균을 배양하였더니 탄소/질소의 비가 10~40:1일 때는 MK1의 생장속도에 별 차이가 없었으나(0.110 h-1), 탄소/질소의 비가 80일 때는 현저하게 줄었다(0.055 h-1).
- MK1 생장에 대한 pH의 영향을 살펴본 결과, 지수기의 생장률및 배양액의 생장수율 모두가 pH 7.0 에서 가장 좋았다. 일반적으로 균체외다당류를 생산하는 세균은 중성 환경에서 최적 성장을 보이는데 B.
- Glucose-무기염 배지에서 최적 조건을 맞추어 배양한 균 상등액에서 냉 ethanol 침전으로 얻은 균체외다당류(EPSopt)의 구성 원소는 탄소(37.1%), 수소(6.4%), 산소(49.3%), 질소(2.2%)였다. L.
- pH 7.0의 배지에서 수확된 균체외다당류(0.1 g/ml)의 상대 점도( # rel)는 1.35, pH 6.0에서 얻은 것은 1.23, pH 7.5의 것은 1.39로 배지의 pH가 높을수록 균체외다당류의 점성이 높았다.
- EPSopt의 상세한 구조의 연구는 liquid chromatograph, NMR으로 진행 중이다. EPSopt의 분자량은 14.8~47.9 kDa으로 분자량이 서로 다른 것이 혼재하고 있음을 알 수 있었다(Fig. 4). 분자량이 다른 것들이 혼재하는 것은 균체외다당류가 효소의 작용으로 분해된 결과로 추정된다(11, 21, 52).
- 2 mDa)에 비하여 500~1,000배 낮은 것은 분자 크기의 현저한 차이 때문일수도 있다(60). MK1 균체외다당류 물성의 차이를 광학현미경, 디지털 사진기 및 주사전자현미경으로도 알 수 있는데(Fig. 5), 배지의 pH 6.0과 6.5에서 수확한 균체외다당류는 수용성이며 고운 결정성 물성인데, pH 7.0과 7.5에서 얻은 균체외다당류는 수용성이 줄고 점착성을 보였다. 이러한 결과에서 배지의 pH에 따라 생산된 균체외다당류의 물성이 달라짐을 추정할 수 있다.
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