[논문]이식을 위한 사람 양막의 소독 및 멸균공정에 의한 감염성 위해인자 불활화 효과

배정은; 김찬경; 김인섭

이식을 위한 사람 양막의 소독 및 멸균공정에 의한 감염성 위해인자 불활화 효과
Inactivation of Infectious Microorganisms by Disinfection and Sterilization Processes for Human Amniotic Membrane Grafts 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.45 no.4, 2009년, pp.346 - 353

배정은 (한남대학교 생명.나노과학대학 생명과학과 & 바이오의약품안전성검증센터) , 김찬경 (한남대학교 생명.나노과학대학 생명과학과 & 바이오의약품안전성검증센터) , 김인섭 (한남대학교 생명.나노과학대학 생명과학과 & 바이오의약품안전성검증센터)

초록
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이식을 위해 사용하는 사람 양막은 기증자로부터 수혜자에게 바이러스, 세균, 진균과 같은 감염성 위해인자를 전파할 위험이 있다. 따라서 적절한 소독 및 멸균 공정을 통해 이식용 양막 내재 또는 혼입 가능한 감염성 위해인자를 완벽하게 불활화하여야 한다. 본 연구에서는 인체조직은행에서 사용하고 있는 소독 공정과 멸균 공정의 바이러스 및 세균, 진균 불활화 효과를 검증하기 위해 국제적 가이드에 따라 5종의 바이러스[human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), bovine herpes virus (BHV), bovine viral diarrhoea virus (BVDV), hepatitis A virus (HAV), porcine parvovirus (PPV)]와 2종의 세균(Escherichia coli, Bacillus subtilis), 1종의 진균(Candida albicans)을 생물학적 지표로 사용하였다. 양막에 각 생물학적 지표를 첨가한 후 70% 에탄올 소독 공정, 감마선 조사 공정, 산화에틸렌 가스 멸균 공정을 실시한 다음 각 바이러스, 세균, 진균을 회수하여 정량한 후 불활화 정도를 비교하였다. 70% 에탄올 처리 공정에서 HIV-1, BHV, BVDV 같은 외피 바이러스는 처리 시간 2.5분 안에 불활화되었지만, HAV와 PPV 같은 비-외피 바이러스는 에탄올에 매우 큰 저항성을 나타내었다. 감마선 2.5 kGy 조사에 의해 HIV-1, BHV, BVDV는 검출한계 이하로 완벽하게 불활화되었다. HAV와 PPV는 각각 5 kGy와 25 kGy 조사에 의해 검출한계 이하로 불활화되었다. 산화에틸렌 가스 처리에 의해 본 연구에 사용한 모든 바이러스가 검출한계 이하로 불활화되었다. 70% 에탄올 처리 공정에서 E. coli와 C. albicans는 모두 5분 안에 완벽하게 사멸하였다. 하지만 B. subtilis는 큰 저항성을 나타내었다. 감마선 조사 공정과 산화에틸렌 가스 멸균 공정에서 E. coli, B. subtilis, C. albicans 모두 완벽하게 불활화되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Viral, bacterial, and fungal infection can be transmitted from donor to recipient via transplantation of human amniotic membrane. Therefore human amniotic membrane for transplantation should be disinfected and sterilized before use. The purpose of this study was to examine the efficacy of the disinfection process and sterilization processes used at human tissue bank in the inactivation of viruses, bacteria, and fungi. A variety of experimental model viruses, bacteria, and fungus for human pathogens, including the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), bovine herpes virus (BHV), bovine viral diarrhoea virus (BVDV), hepatitis A virus (HAV), porcine parvovirus (PPV), Escherichia coli, Bacillus subtilis, and Candida albicans were all selected for this study. Enveloped viruses such as HIV-1, BHV, and BVDV were effectively inactivated to undetectable levels by 70% ethanol treatment, gamma irradiation process, and ethylene oxide (EO) gas sterilization process. Also non-enveloped viruses such as HAV and PPV were effectively inactivated to undetectable levels by gamma irradiation and EO gas treatment. However HAV and PPV showed high resistance to 70% ethanol treatment. E. coli and C. albicans were effectively inactivated to undetectable levels by 70% ethanol treatment, gamma irradiation process, and EO gas treatment. Also B. subtilis was effectively inactivated to undetectable levels by gamma irradiation process and EO gas treatment. However it showed high resistance to 70% ethanol treatment.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서 조사한 70% 에탄올 처리 공정, 감마선조사 공정, 산화에틸렌 가스 공정의 바이러스 및 세균, 진균 불활화 효과는 얼마나 효과적으로 화학물질과 감마선이 양막안으로 침투하는 가에 달려 있다. 본 연구에서는 기질층을 제거한 양막을 대상으로 실험을 수행하였는데, 기질층을 제거하지 않은 양막이라 할지라도 침투력이 강한 감마선조사는 동일한 불활화 효과를 나타낼 것으로 판단된다. 하지만 에탄올 처리와 산화에틸렌 가스 공정은 화학물질의 침투력에 따라 그 효과가 달라질 수도 있다고 사료된다.
본 연구의 목표는 양막에 대한 안전하고 효율적인 소독방법과 멸균방법을 실험을 통하여 제시하고, 동 방법에 대한 표준모델을 확립하여, 표준화 되어 있지 못한 소독 및 멸균방법에 대하여 표준모델을 제시함으로써 인체조직은행의 이식용 양막 안전성 확보수준을 향상시키고, 안전한 양막조직이 공급되도록 하는데 있다. 본 연구에서는 인체조직 소독 공정(70% 에탄올 처리 공정)과 멸균 공정(감마선조사 공정과 산화에틸렌 가스 공정)의 바이러스 및 세균, 진균 불활화 효과를 검증하기 위해 5종의 바이러스[HIV type 1 (HIV-1), bovine herpes virus (BHV), Bovine viral diarrhoea virus (BVDV), HAV, porcine parvovirus (PPV)]와 2종의 세균(E.

제안 방법

일반적으로 인체조직은행에서는 바이러스 및 세균, 진균과 같은 감염성 위해인자를 소독하기 위해 70% 에탄올을 사용한다. 70% 에탄올 처리 공정에서 각 바이러스들의 불활화 정도를 비교하였다. 3×3 cm 양막에 바이러스를 1 ml 첨가하였다.
70% 에탄올 처리에 의한 E. coli, B. subtilis, C. albicans 불활화 효과를 비교 검증하였다(Table 3). 70% 에탄올 처리에 의해 1.
감마선 조사는 (주)그린피아에 위탁하여 실시하였으며, 감마선 조사를 규정한 ISO 13409 규정에 따라 실시하였다(17). E. coli, B. subtilis, C. albicans도 동일하게 감마선 조사를 하면서 불활화 정도를 정량하였다.
바이러스 배양을 위해서는 2% FBS가 첨가된 배지를 사용하였다. T-175 flask에 배양된 단층 세포에 바이러스를 감염시킨 후 주기적으로 HIV의 경우 거대세포(syncitium), 다른 바이러스들의 경우에는 세포병변효과(cytopatic effect)를 관찰하였다. 거대세포 또는 세포병변효과가 명백하게 관찰 될 때 배양액과 세포를 수거한 다음, 400×g에서 7분간 원심분리하여 상층액은 따로 모으고 침전물은 현탁하였다.
양막으로부터 세균과 진균을 회수하기 위해 인산완충용액(phosphate buffered saline)을 첨가한 후 혼합 실험기를 이용하여 격렬하게 반응시킨 후 균주를 추출하였다. 각 균주 추출은 회수율이 90% 이상이 되게 3차례 이상 실시하였다.
25 ml씩 접종하였다. 각 바이러스의 양성 대조구로 역가를 알고 있는 바이러스를 7배수로 희석하여 각 plate에 배양된 세포에 접종하였다. 음성대조군으로 바이러스가 첨가되지 않은 배양배지를 접종하였다.
일반적으로 감마선을 멸균의 목적으로 사용할 때 25 kGy를 조사한다. 감마선 조사량에 의한 바이러스 불활화 정도를 비교하였다. 2×2 cm 양막에 바이러스를 0.
음성대조군으로 바이러스가 첨가되지 않은 배양배지를 접종하였다. 그 후 CO₂ 배양기에서 35^oC로 배양하면서 계속적으로 현미경으로 거대세포 또는 세포병변효과를 관찰하였다. 감염성 바이러스가 검출되지 않을 때, 즉 검출한계 이하로 관찰될 때에는 바이러스의 역가를 98% 신뢰도를 가지고 이론적 최소 검출량(a theoretical minimal detection level)을 사용하여 계산하였다.
소독 및 멸균 공정에 의한 불활화 효과를 검증하기 위해 (주)바이오랜드에서 양막을 기증받아 사용하였다. 기질층을 제거한 후 동결건조한 양막에 각 바이러스, 세균, 진균을 첨가한 후 불활화 공정을 실시한 다음 양막에서 각 바이러스, 세균, 진균을 회수하여 정량한 후 불활화 정도를 비교하였다. 양막으로부터 바이러스를 회수하기 위해 세포배양배지를 첨가한 후 혼합 실험기(vortex mixer)를 이용하여 격렬하게 반응시킨 후 바이러스를 추출하였다.
3×3 cm 양막에 바이러스를 3 ml 첨가한 후 동결건조를 하였다. 동결건조한 양막으로부터 바이러스를 회수하여 즉시 정량하였다. 또한 바이러스를 첨가한 양막에 산화에틸렌 가스를 처리한 후 바이러스를 회수하여 불활화 정도를 비교하였다.
바이러스를 첨가한 후 바이러스를 회수하여 즉시 정량하였다. 또한 바이러스가 첨가된 양막에 감마선을 2.5, 5, 15, 25 kGy로 조사한 후 바이러스를 회수하여 즉시 정량하였다. 감마선 조사는 (주)그린피아에 위탁하여 실시하였으며, 감마선 조사를 규정한 ISO 13409 규정에 따라 실시하였다(17).
바이러스를 첨가한 후 바이러스를 회수하여 즉시 정량하였다. 또한 바이러스가 첨가된 양막을 70% 에탄올에 2.5분, 5분, 10분, 20분간 처리한 후 바이러스를 회수하여 즉시 정량하였다. E.
동결건조한 양막으로부터 바이러스를 회수하여 즉시 정량하였다. 또한 바이러스를 첨가한 양막에 산화에틸렌 가스를 처리한 후 바이러스를 회수하여 불활화 정도를 비교하였다. 산화에틸렌 가스 멸균에 의한 감염성 위해인자 불활화 검증을 위해 37^oC, 상대습도 60% 조건에서 1,000 mg/L의 산화에틸렌 가스 농도로 4시간 동안 처리하였다.
다른 세포들은 10% FBS를 첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium (DMEM: Gibco BRL)에 배양하였다. 바이러스 배양을 위해서는 2% FBS가 첨가된 배지를 사용하였다. T-175 flask에 배양된 단층 세포에 바이러스를 감염시킨 후 주기적으로 HIV의 경우 거대세포(syncitium), 다른 바이러스들의 경우에는 세포병변효과(cytopatic effect)를 관찰하였다.
바이러스 불활화 실험시 바이러스 역가를 정확하게 측정하기 위해서 먼저 바이러스를 첨가하지 않은 음성대조 실험에서 취한 시료들이 바이러스의 정량 분석을 위해 사용되는 세포에 세포독성을 나타내는지, 바이러스 정량분석에 간섭효과를 일으키는지를 실험하였다(20). 바이러스 불활화 실험 중 취한 시료들을 세포독성과 간섭효과를 나타내지 않은 농도로 바이러스 배양 배지를 사용하여 희석하였다. 희석된 시료를 7배수로 희석하여 HIV-1의 경우 96 well plate에 배양된 세포에 0.
)]으로 나타내었다(19). 바이러스 불활화 실험시 바이러스 역가를 정확하게 측정하기 위해서 먼저 바이러스를 첨가하지 않은 음성대조 실험에서 취한 시료들이 바이러스의 정량 분석을 위해 사용되는 세포에 세포독성을 나타내는지, 바이러스 정량분석에 간섭효과를 일으키는지를 실험하였다(20). 바이러스 불활화 실험 중 취한 시료들을 세포독성과 간섭효과를 나타내지 않은 농도로 바이러스 배양 배지를 사용하여 희석하였다.
바이러스 정량 분석이 끝난 후 그 결과를 기초로 각 공정에서 바이러스 감소인수를 구하였다. 바이러스 감소인수는 바이러스가 첨가된 공정출발물질에 존재하는 바이러스 양의 log 값에서 공정 진행 후에 존재하는 바이러스 양의 log 값을 뺀 log 감소인수(reduction factor)로 정의하였다(20).
양막으로부터 바이러스를 회수하기 위해 세포배양배지를 첨가한 후 혼합 실험기(vortex mixer)를 이용하여 격렬하게 반응시킨 후 바이러스를 추출하였다. 바이러스 추출은 바이러스 회수율이 90% 이상이 되게 3차례 이상 실시하였다. 양막으로부터 세균과 진균을 회수하기 위해 인산완충용액(phosphate buffered saline)을 첨가한 후 혼합 실험기를 이용하여 격렬하게 반응시킨 후 균주를 추출하였다.
3×3 cm 양막에 바이러스를 1 ml 첨가하였다. 바이러스를 첨가한 후 바이러스를 회수하여 즉시 정량하였다. 또한 바이러스가 첨가된 양막을 70% 에탄올에 2.
바이러스에 대한 산화에틸렌 가스 멸균 효과를 조사하였다(Table 6). 산화에틸렌 가스 처리에 의해 HIV-1, BHV, BVDV와 같은 외피 바이러스뿐만 아니라 HAV, PPV 같은 비-외피 바이러스 모두 검출한계 이하로 불활화되었다.
본 연구의 목표는 양막에 대한 안전하고 효율적인 소독방법과 멸균방법을 실험을 통하여 제시하고, 동 방법에 대한 표준모델을 확립하여, 표준화 되어 있지 못한 소독 및 멸균방법에 대하여 표준모델을 제시함으로써 인체조직은행의 이식용 양막 안전성 확보수준을 향상시키고, 안전한 양막조직이 공급되도록 하는데 있다. 본 연구에서는 인체조직 소독 공정(70% 에탄올 처리 공정)과 멸균 공정(감마선조사 공정과 산화에틸렌 가스 공정)의 바이러스 및 세균, 진균 불활화 효과를 검증하기 위해 5종의 바이러스[HIV type 1 (HIV-1), bovine herpes virus (BHV), Bovine viral diarrhoea virus (BVDV), HAV, porcine parvovirus (PPV)]와 2종의 세균(E. coli, B. subtilis), 1종의 진균(C. albicans)을 생물학적 지표로 사용하였다.
또한 바이러스를 첨가한 양막에 산화에틸렌 가스를 처리한 후 바이러스를 회수하여 불활화 정도를 비교하였다. 산화에틸렌 가스 멸균에 의한 감염성 위해인자 불활화 검증을 위해 37^oC, 상대습도 60% 조건에서 1,000 mg/L의 산화에틸렌 가스 농도로 4시간 동안 처리하였다. 양막에 잔존하는 산화에틸렌 가스가 바이러스 정량 분석을 위한 감염성 세포주에 독성을 일으킬 수 있기 때문에 양막으로부터 바이러스를 회수하기 전에 산화에틸렌 가스를 제거하기 위해 상온에서 7일 이상 보관하였다.
산화에틸렌 가스는 RNA 또는 DNA에 알킬화(alkylation) 반응을 야기하여 감염성 위해인자들의 유전체를 파괴함으로써 바이러스, 세균, 곰팡이를 불활화시킨다(24, 27). 산화에틸렌 가스 멸균이 효과적으로 이루어지기 위해서는 적절한 노출시간(2~5시간), 산화에틸렌 가스 농도(450~1200 mg/L), 처리 온도(29~65^oC), 상대습도(45~85%)가 중요한데, 감염성 위해인자 불활화 검증을 위해 37^oC, 상대습도 60% 조건에서 1,000 mg/L의 산화에틸렌 가스 농도로 4시간 동안 처리한 후 바이러스, 세균, 진균의 불활화 효과를 조사하였다. 산화에틸렌 가스 처리에 의해 바이러스, 세균, 진균 모두 검출한계 이하로 불활화되었다.
세균과 진균에 대한 감마선 조사 효과를 알아보기 위해 감마선 조사량(0, 2.5, 5, 15, 25 kGy)에 따른 E. coli, B. subtilis, C. albicans 불활화 효과를 비교 검증하였다(Table 5). E.
세균과 진균에 대한 산화에틸렌 가스 멸균 효과를 검증하기 위해 E. coli, B. subtilis, C. albicans를 대상으로 불활화 효과를 비교 검증하였다(Table 7). E.
기질층을 제거한 후 동결건조한 양막에 각 바이러스, 세균, 진균을 첨가한 후 불활화 공정을 실시한 다음 양막에서 각 바이러스, 세균, 진균을 회수하여 정량한 후 불활화 정도를 비교하였다. 양막으로부터 바이러스를 회수하기 위해 세포배양배지를 첨가한 후 혼합 실험기(vortex mixer)를 이용하여 격렬하게 반응시킨 후 바이러스를 추출하였다. 바이러스 추출은 바이러스 회수율이 90% 이상이 되게 3차례 이상 실시하였다.
바이러스 추출은 바이러스 회수율이 90% 이상이 되게 3차례 이상 실시하였다. 양막으로부터 세균과 진균을 회수하기 위해 인산완충용액(phosphate buffered saline)을 첨가한 후 혼합 실험기를 이용하여 격렬하게 반응시킨 후 균주를 추출하였다. 각 균주 추출은 회수율이 90% 이상이 되게 3차례 이상 실시하였다.
양막의 안정성과 유효성에 영양을 미치지 않는 감마선 조사량인 25 kGy까지 감마선을 조사하면서 조사량(0, 2.5, 5, 15, 25 kGy)에 따른 바이러스 불활화 효과를 측정하였다(Table 4). HIV-1, BHV, BVDV와 같은 외피 바이러스는 2.
양막의 안정성과 유효성에 영양을 미치지 않는 처리시간인 20분 동안 70% 에탄올을 처리하면서, 처리시간에 따른 바이러스 불활화 효과를 비교 검증하였다(Table 2). HIV-1, BHV, BVDV와 같은 외피 바이러스는 2.
각 바이러스의 양성 대조구로 역가를 알고 있는 바이러스를 7배수로 희석하여 각 plate에 배양된 세포에 접종하였다. 음성대조군으로 바이러스가 첨가되지 않은 배양배지를 접종하였다. 그 후 CO₂ 배양기에서 35^oC로 배양하면서 계속적으로 현미경으로 거대세포 또는 세포병변효과를 관찰하였다.
일반적으로 세균 또는 진균의 경우 성장이 정체기때 지수성장기때보다 물리·화학적 처리에 더 큰 저항성을 나타내기 때문에(5, 7), 먼저 각 시험균주를 배양하면서 성장곡선을 분석하여 정체기의 균주를 가지고 실험을 실시하였다.
일반적으로 세균 또는 진균의 경우 성장이 정체기일 때가 지수성장기 때보다 물리·화학적 처리에 더 큰 저항성을 나타내기 때문에, 먼저 각 시험균주를 배양하면서 성장곡선을 분석한 후, 정체기의 균주를 가지고 실험을 실시하였다.

대상 데이터

coli HB101은 Luria-Bertani (LB) 배지를 사용하여 37^oC에서 배양하였다. B. subtilis (KCTC 1102)는 Nutrient broth (NB) 배지를 사용하여 37^oC에서 배양하였다. C.
HIV-1 (HBX2 strain), BHV (ATCC VR 188), BVDV (ATCC VR 534), HAV (ATCC VR 1402), PPV (ATCC VR 742)의 배양과 정량을 위해 C8166-45 세포, Minipig Kidney (MPK) 세포 (ATCC CCL 166), bovine turbinate (BT) 세포(ATCC CRL 1390), FRhK-4 세포(ATCC CRL 1688), Minipig Kidney (MPK) 세포(ATCC CCL 166)를 각각 사용하였다(8, 18). C8166-45 세포는 10% fetal bovine serum (FBS: Gibco BRL, USA)를 첨가한 RPMI 1640 배지에 배양하였다. 다른 세포들은 10% FBS를 첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium (DMEM: Gibco BRL)에 배양하였다.
E. coli HB101은 Luria-Bertani (LB) 배지를 사용하여 37^oC에서 배양하였다. B.
본 연구를 위해 사용한 바이러스들의 특성은 Table 1과 같다. HIV-1 (HBX2 strain), BHV (ATCC VR 188), BVDV (ATCC VR 534), HAV (ATCC VR 1402), PPV (ATCC VR 742)의 배양과 정량을 위해 C8166-45 세포, Minipig Kidney (MPK) 세포 (ATCC CCL 166), bovine turbinate (BT) 세포(ATCC CRL 1390), FRhK-4 세포(ATCC CRL 1688), Minipig Kidney (MPK) 세포(ATCC CCL 166)를 각각 사용하였다(8, 18). C8166-45 세포는 10% fetal bovine serum (FBS: Gibco BRL, USA)를 첨가한 RPMI 1640 배지에 배양하였다.
본 연구에서는 다양한 물리·화학적 처리 공정에 강한 저항성을 나타내는 그람 양성의 포자 형성 세균인 B. subtilis와 그람 음성 세균인 E. coli, 진균 C. albicans를 지표 미생물로 선정하였다.
넷째, 선택된 생물학적 지표는 시험자에게 감염의 위험이 적어야 한다. 본 연구에서는 이식용 사람 양막 안전성 검증을 위한 지표 바이러스로 HIV와 HTLV의 모델 바이러스인 HIV-1, Herpes virus와 Cytomegalovirus의 모델 바이러스인 BHV, HCV의 모델 바이러스인 BVDV, B19의 모델 바이러스인 PPV, 그리고 HAV를 선정하였다. 이러한 바이러스들은 일반적으로 사람 체액, 혈액 및 조직 유래 바이오의 약품 제조공정의 바이러스 안전성 검증을 위해 사용되고 있다(8, 19, 20, 29).
소독 및 멸균 공정에 의한 불활화 효과를 검증하기 위해 (주)바이오랜드에서 양막을 기증받아 사용하였다. 기질층을 제거한 후 동결건조한 양막에 각 바이러스, 세균, 진균을 첨가한 후 불활화 공정을 실시한 다음 양막에서 각 바이러스, 세균, 진균을 회수하여 정량한 후 불활화 정도를 비교하였다.

데이터처리

그 후 CO₂ 배양기에서 35^oC로 배양하면서 계속적으로 현미경으로 거대세포 또는 세포병변효과를 관찰하였다. 감염성 바이러스가 검출되지 않을 때, 즉 검출한계 이하로 관찰될 때에는 바이러스의 역가를 98% 신뢰도를 가지고 이론적 최소 검출량(a theoretical minimal detection level)을 사용하여 계산하였다.
바이러스 감소인수는 바이러스가 첨가된 공정출발물질에 존재하는 바이러스 양의 log 값에서 공정 진행 후에 존재하는 바이러스 양의 log 값을 뺀 log 감소인수(reduction factor)로 정의하였다(20). 모든 실험은 독립적으로 두 번 실시하여 평균값을 구하였다.

이론/모형

일반적으로 세균 또는 진균의 경우 성장이 정체기일 때가 지수성장기 때보다 물리·화학적 처리에 더 큰 저항성을 나타내기 때문에, 먼저 각 시험균주를 배양하면서 성장곡선을 분석한 후, 정체기의 균주를 가지고 실험을 실시하였다. 각 균주의 정량을 위해 도말 평판법을 사용하여 생균수를 측정하고, 그 수를 집단 형성 단위(Colony Forming Unit; CFU)로 나타내었다.
5, 5, 15, 25 kGy로 조사한 후 바이러스를 회수하여 즉시 정량하였다. 감마선 조사는 (주)그린피아에 위탁하여 실시하였으며, 감마선 조사를 규정한 ISO 13409 규정에 따라 실시하였다(17). E.
양막에 잔존하는 산화에틸렌 가스가 바이러스 정량 분석을 위한 감염성 세포주에 독성을 일으킬 수 있기 때문에 양막으로부터 바이러스를 회수하기 전에 산화에틸렌 가스를 제거하기 위해 상온에서 7일 이상 보관하였다. 산화에틸렌 가스 멸균은 한스바이오메드(주)에 위탁하여 실시하였으며, 산화에틸렌 가스 멸균 공정을 규정한 ISO 11135 규정에 준하여 검증을 실시하였다(15). E.

성능/효과

B. subtilis는 70% 에탄올 처리 20분까지 점진적인 불활화가 일어나 3.82×107 CFU가 5.79×105 CFU로 감소하였지만, 처리 시간을 30분으로 증가시켰을 때 1.41×105 CFU가 검출되었고, 처리 시간을 60분으로 증가시켰을 때에도 1.38×105 CFU가 검출되었다.
B. subtilis도 2.5 kGy 감마선 조사에 의해 4.75×107 CFU가2.29×103 CFU로 감소되었으며, 5 kGy 감마선 조사에 의해 완벽하게 불활화되었다.
E. coli는 2.5 kGy 감마선 조사에 의해 3.25×106 CFU가 4.20×102 CFU로감소되었으며, 5 kGy 감마선 조사에 의해 완벽하게 불활화되었다.
5, 5, 15, 25 kGy)에 따른 바이러스 불활화 효과를 측정하였다(Table 4). HIV-1, BHV, BVDV와 같은 외피 바이러스는 2.5 kGy 조사에 의해 검출한계이하로 완벽하게 불활화되었다. 감마선 조사에 의한 HIV-1, BHV, BVDV의 log 바이러스 감소인수는 각각 ≥4.
양막의 안정성과 유효성에 영양을 미치지 않는 처리시간인 20분 동안 70% 에탄올을 처리하면서, 처리시간에 따른 바이러스 불활화 효과를 비교 검증하였다(Table 2). HIV-1, BHV, BVDV와 같은 외피 바이러스는 2.5분 안에 검출한계이하로 완벽하게 불활화되었다. HIV-1, BHV, BVDV의 log 바이러스 감소인수는 각각 ≥3.
셋째, 검증용 생물학적 지표는 되도록 쉽게 분석 가능하며 고농도로 배양할 수 있어야 한다. 넷째, 선택된 생물학적 지표는 시험자에게 감염의 위험이 적어야 한다. 본 연구에서는 이식용 사람 양막 안전성 검증을 위한 지표 바이러스로 HIV와 HTLV의 모델 바이러스인 HIV-1, Herpes virus와 Cytomegalovirus의 모델 바이러스인 BHV, HCV의 모델 바이러스인 BVDV, B19의 모델 바이러스인 PPV, 그리고 HAV를 선정하였다.
둘째, 선택된 생물학적 지표는 되도록 물리·화학적 처리에 큰 저항성을 나타내는 것이어서 다른 미지의 또는 동정되지 않은 감염성 위해인자의 불활화를 보장할 수 있어야 한다.
특정 불활화공정에서 감염성 위해인자 불활화 효과가 매우 크다고 할지라도, 부적절하게 공정이 진행될 수도 있고, 그 공정에 저항성을 갖는 새로운 감염성위해인자가 오염될 수도 있기 때문이다. 따라서 70% 에탄올 소독 공정, 감마선 조사 공정, 산화에틸렌 가스 멸균 공정, 기타 효과가 입증된 불활화 공정을 병행하는 것이 사람 양막 조직의 안전성을 확보하는 조건으로 판단된다.
바이러스 중 가장 물리·화학적 처리에 큰 저항성을 나타내는 것으로 알려진 PPV의 경우에는 감마선 조사량이 증가함에 따라 점진적으로 불활화 효과가 크게 나타났으며, 25 kGy 조사량에 의해 검출한계 이하로 불활화되었다. 또한 E. coli와 B. subtilis는 5 kGy 조사량에 의해서 완벽하게 불활화되었고, C. albicans는 2.5 kGy 조사량에 의해 완벽하게 불활화되었다. 이와 같은 결과에서 감마선 조사공정은 바이러스, 세균, 진균을 모두 불활화할 수 있는 공정임을 확인하였다.
바이러스 중 가장 물리·화학적 처리에 큰 저항성을 나타내는 것으로 알려진 PPV의 경우에는 감마선 조사량이 증가함에 따라 점진적으로 불활화 효과가 크게 나타났으며, 25 kGy 조사량에 의해 검출한계 이하로 불활화되었다.
본 연구에서 조사한 70% 에탄올 처리 공정, 감마선조사 공정, 산화에틸렌 가스 공정의 바이러스 및 세균, 진균 불활화 효과는 얼마나 효과적으로 화학물질과 감마선이 양막안으로 침투하는 가에 달려 있다. 본 연구에서는 기질층을 제거한 양막을 대상으로 실험을 수행하였는데, 기질층을 제거하지 않은 양막이라 할지라도 침투력이 강한 감마선조사는 동일한 불활화 효과를 나타낼 것으로 판단된다.
본 연구에서는 감염성 있는 바이러스의 역가를 50% 조직배양 감염용량[50% tissue culture infectious dose (TCID₅₀)]으로 나타내었다(19). 바이러스 불활화 실험시 바이러스 역가를 정확하게 측정하기 위해서 먼저 바이러스를 첨가하지 않은 음성대조 실험에서 취한 시료들이 바이러스의 정량 분석을 위해 사용되는 세포에 세포독성을 나타내는지, 바이러스 정량분석에 간섭효과를 일으키는지를 실험하였다(20).
바이러스에 대한 산화에틸렌 가스 멸균 효과를 조사하였다(Table 6). 산화에틸렌 가스 처리에 의해 HIV-1, BHV, BVDV와 같은 외피 바이러스뿐만 아니라 HAV, PPV 같은 비-외피 바이러스 모두 검출한계 이하로 불활화되었다. EO 가스 멸균에 의한 HIV-1, BHV, BVDV, HAV, PPV의 log 바이러스 감소인수는 각각 ≥ 3.
산화에틸렌 가스 멸균이 효과적으로 이루어지기 위해서는 적절한 노출시간(2~5시간), 산화에틸렌 가스 농도(450~1200 mg/L), 처리 온도(29~65^oC), 상대습도(45~85%)가 중요한데, 감염성 위해인자 불활화 검증을 위해 37^oC, 상대습도 60% 조건에서 1,000 mg/L의 산화에틸렌 가스 농도로 4시간 동안 처리한 후 바이러스, 세균, 진균의 불활화 효과를 조사하였다. 산화에틸렌 가스 처리에 의해 바이러스, 세균, 진균 모두 검출한계 이하로 불활화되었다. 이와 같은 결과에서 산화에틸렌 가스 공정은 바이러스, 세균, 진균을 모두 불활화할 수 있는 공정임을 확인하였다.
둘째, 선택된 생물학적 지표는 되도록 물리·화학적 처리에 큰 저항성을 나타내는 것이어서 다른 미지의 또는 동정되지 않은 감염성 위해인자의 불활화를 보장할 수 있어야 한다. 셋째, 검증용 생물학적 지표는 되도록 쉽게 분석 가능하며 고농도로 배양할 수 있어야 한다. 넷째, 선택된 생물학적 지표는 시험자에게 감염의 위험이 적어야 한다.
알코올은 인지질을 녹여내고, 단백질을 변성 시켜 살균 효과를 나타낸다(28). 양막 조직을 소독하기 위해 70% 에탄올로 20분간 처리하는 공정은 외피 바이러스(HIV-1, BHV, BVDV)에 대해 완벽한 불활화 효과를 나타내지만, 비-외피 바이러스(PPV, BPV)에 대해서는 불활화 효과가 미미하였다. 또한 70% 에탄올 처리 공정은 일반 세균과 진균(E.
5 kGy 조사량에 의해 완벽하게 불활화되었다. 이와 같은 결과에서 감마선 조사공정은 바이러스, 세균, 진균을 모두 불활화할 수 있는 공정임을 확인하였다.
산화에틸렌 가스 처리에 의해 바이러스, 세균, 진균 모두 검출한계 이하로 불활화되었다. 이와 같은 결과에서 산화에틸렌 가스 공정은 바이러스, 세균, 진균을 모두 불활화할 수 있는 공정임을 확인하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	인체조직 이식 기증자의 안전성 확보가 중요한 요인인 이유는 인체조직 이식의 어떤 특징 때문인가?	사람의 뼈, 연골, 근막, 피부, 양막, 인대, 건, 심장판막, 혈관 등과 같은 인체조직은 심장, 간, 신장 등의 고형장기와 달리 면역학적 거부반응의 발생빈도가 상대적으로 낮아 다양한 용도로 환자들에게 이식이 되고 있다. 이러한 인체조직은 한 사람의 기증자로부터 불특정 다수의 수혜자에게 이식이 가능하다는 것이 특징이다. 따라서 이식을 위해 채취한 조직이 감염성 위해인자에 오염되었을 경우 그 오염이 많은 사람들에게 전파될 수 있다. 기증자의 안전성 확보를 위해 기증자의 병력을 검토하고, 기증자의 신체에 대한 육안 검사를 통해 감염의 증후, 외상 등 조직의 성상에 영향을 주는 요인의 유무를 확인하고, 또한 기증자의 혈액검사 및 조직에 대한 미생물학적 검사를 통해 감염질환에 대한 선별검사를 실시한다 할지라도 기증된 인체 조직에 감염성 위해 인자가 오염될 가능성을 배제할 수 없다(2, 3, 40).
	감염성 세균과 진균이 오염된 골 조직을 이식하였을 때 몇 % 정도의 감염이 발생하는가?	감염성 세균 및 진균이 오염된 골 조직을 이식하였을 경우 통계적으로 18~75%에서 감염이 발생하였고, 세균 및 진균이 전혀 검출되지 않았던 조직을 이식한 경우라도 1.6~3.
	인체조직에는 어떤 것들이 있는가?	사람의 뼈, 연골, 근막, 피부, 양막, 인대, 건, 심장판막, 혈관 등과 같은 인체조직은 심장, 간, 신장 등의 고형장기와 달리 면역학적 거부반응의 발생빈도가 상대적으로 낮아 다양한 용도로 환자들에게 이식이 되고 있다. 이러한 인체조직은 한 사람의 기증자로부터 불특정 다수의 수혜자에게 이식이 가능하다는 것이 특징이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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