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문제 정의
- 최근 한 연구에서는 활성탄을 분해미생물 담체(biocarrier)로 하여 원유분해연구를 실시하였는데 원유의 분해는 물론 미생물의 증식효과가 있는 것으로 나타났다(18). 본 연구에서는 고온에서 활성화된 국내산 대나무활성탄을 우수 유류분해 혼합균의 배양담체로 사용하고 이에 기타 부형제를 첨가하여 미생물제제를 제조하여 원유로 오염된 해양토양의 정화 가능성을 검토하고자 하였다. 대나무활성탄은 유류분해 혼합균주의 증식을 촉진하였으며 제조된 미생물제제는 산소발생제의 존재하에서 현저하게 유류분해를 촉진하였다.
제안 방법
- 1차 PCR은 27F, 1541R을 이용하여 50 µl 안에 1× PCR buffer, 20 mM MgCl2, 40 mM dNTP mixture, 각 primer (1 µM), template DNA와 0.5 U Taq polymerase를 첨가하여 PCR을 수행하였다.
- 각각의 PCR products는 ethidium bromide 염색 후 1% agarose gel에서 확인하였다. 1차 PCR의 증폭산물을 주형으로 2차 PCR을 수행하였으며, 이때 사용된 primer는 40개의 GC-clamp가 붙은 341F-GC와 786R을 이용하였다. 2차 PCR을 위한 PCR mixture는 1차 PCR에 사용된 것과 동일하며, 사용된 PCR 반응조건은 94℃에서 5분 동안 DNA를 변성시켜, 94℃에서 45 sec denaturation, 60℃에서 45 sec annealing, 72℃에서 45 sec extension하고 72℃에서 7 min 동안 최종 extension을 수행하였다.
- 2가지의 최종 선발된 혼합균주인 “C” 및 “S” 를 SM1(500~600 ml; 적정량의 활성탄 함유)가 들어있는 2 L Erlenmeyer flask에서 최소한 1주일 혼합배양한 다음 유류분해 미생물제제를 제조하였다.
- 2군데의 원유오염지역(A 및 B 지역)으로 채취된 저질토양을 대상으로 이들 지역으로부터 분리된 우수유류분해 혼합균(CSMix-1)을 사용하여 미생물제제 MA-1 및 MA-2를 제조하였다. 그리고 미생제제 MA-1 및 MA-2를 각각 A 및 B 지역의 오염토양에 Table 1에 제시된 대로 처리하여 정화시험을 실시하였다.
- Denaturing gradient gel 상에서 다른 위치에 존재하는 DNA 단편들을 회수하기 위하여 각각의 band를 선택한 후, 잘라내어 3차 DW 50 µl를 첨가하고 4℃에서 하룻밤 동안 방치하여 상등액을 취하였다. Band에서 회수한 DNA를 주형으로 341F-GC와 786R primer를 이용하여 재증폭을 수행했으며, PCR 산물은 PCR purification kit (QIAGEN, Germany)로 정제한 후 T-Blunt vector를 이용하여 cloning하였다. 이 plasmid를 E.
- Clone library 구축을 위해서, PCR 증폭산물을 1.5% agarose gel에서 loading한 후 약 1,500 bp 크기의 밴드를 잘라, LaboPass Gel Extraction kit (CosmoGen, Korea)를 이용하여 정제한 후, T-Blunt vector (Solgent, Korea)에 ligation시켰고, 이 plasmid를 Escherichia coli DH5α (RBC Korea, Korea)에 넣은 후 선택배지에서 확인하였다.
- PCR 산물은 Dcode™ System (Bio-Rad, USA)을 이용하여 DGGE를 수행하였다. Denaturing gradient gel은 10% polyacrylamide (37.5:1=acrylamide:bisacrylamide)에 urea와 formamide 변성제를 40%~70%까지 농도구배가 형성되도록 첨가하여 제작하였다. 이와 같이 제작된 gel에 PCR 증폭산물을 30 µl씩 loading하여 1× TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA, pH 8.
- 미생물 군집변화를 측정하기 위해 PCR-DGGE 기법과 clone library 기법을 이용하였다. Fast DNA 추출 kit (MPbio, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였으며, 미생물 다양성을 확인하기 위하여 시료로부터 얻은 DNA를 주형으로 PCR 반응을 수행하였다. 1차 PCR은 27F, 1541R을 이용하여 50 µl 안에 1× PCR buffer, 20 mM MgCl2, 40 mM dNTP mixture, 각 primer (1 µM), template DNA와 0.
- PCR 산물은 Dcode™ System (Bio-Rad, USA)을 이용하여 DGGE를 수행하였다.
- 반응조건은 우선 94℃에서 5 min 동안 DNA를 변성시킨 후, 94℃에서 45 sec denaturation, 56℃에서 45 sec annealing, 72℃에서 45 sec extension을 30 cycles을 수행한 후 72℃에서 7 min 동안 final extension을 수행하였다. 각각의 PCR products는 ethidium bromide 염색 후 1% agarose gel에서 확인하였다. 1차 PCR의 증폭산물을 주형으로 2차 PCR을 수행하였으며, 이때 사용된 primer는 40개의 GC-clamp가 붙은 341F-GC와 786R을 이용하였다.
- 2군데의 원유오염지역(A 및 B 지역)으로 채취된 저질토양을 대상으로 이들 지역으로부터 분리된 우수유류분해 혼합균(CSMix-1)을 사용하여 미생물제제 MA-1 및 MA-2를 제조하였다. 그리고 미생제제 MA-1 및 MA-2를 각각 A 및 B 지역의 오염토양에 Table 1에 제시된 대로 처리하여 정화시험을 실시하였다. 우선 A 지역의 토양은 점질토양으로서 시험 초기의 TPH 농도(5,200 mg/L)가 처리 35일 경과 시 제제(MA-1)만의 처리 경우는 약 71%의 정화효과가 인정되었다(1,500 mg/L)(Fig.
- 단위 배양액 부피당 분해미생물의 밀도를 높이고자 대나무활성탄을 담체(carrier)로 첨가 후 배양을 시도하였다. 상기 혼합배양액 CSMix-1을 디젤유(5000 mg/L)과 대나무활성탄을 1% (w/ w) 첨가하여 7일간 배양한 후 배양액을 인산염 완충액으로 희석하여 SM1 고체배지에 도말하여 7일간 배양한 결과는 Fig.
- 그러나 “S” 는 “C”에 비해 보다 우수한 디젤유에서 분해력을 나타내었다(미발표자료). 따라서 이들 2가지의 혼합균을 혼합 배양하여 제제의 제조에 활용하였다.
- 이 clone들은 50 µg/ml kanamycin을 포함한 LB배지에서 키웠으며 생성된 콜로니들을 16S rDNA 분석에 이용하였다. 선택한 콜로니는 LB + kanamycin 배지에서 재배양하여 plasmid를 추출 한 후 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI (www.
- 시료의 채취는 7주 동안 주 1회로 이루어졌으며 각 반응조에서 3군데를 채취하여 혼합하여 시료로 하였다. 우선 채취한 시료를 4 ml vials (National Scientific Company, USA)에 5g을 담은 후 실온에서 24시간 건조시켰다.
- 오염토양의 초기 총석유계탄화수소(total petroleum hydrocarbon : TPH) 농도는 5,000~6,000 ppm이었으며, 미생물제제 접종시 분해균의 밀도는 107 (CFU/g soil)의 수준이었고 추가의 접종은 실시하지 않았다. 실험은 실온(25℃)에서 30~40%의 토양함수율을 유지하는 조건에서 5주간 실시하였다.
- 5℃ 감소하게 20 cycles 수행하였고, 그 후 50℃에서 15 cycles을 수행하여 touch-down PCR을 완료하였다. 얻어진 2차 PCR의 산물을 이용하여 DGGE를 수행하였다. PCR 산물은 Dcode™ System (Bio-Rad, USA)을 이용하여 DGGE를 수행하였다.
- 원유로 오염된 해양저질의 생물접종(bioaugmentation)을 통한 정화시험은 polypropylene 비이커 (2 L)에 오염토양(지점 A및 B)을 각각 1 kg을 넣은 다음 실시하였다(Table 1). 오염토양의 초기 총석유계탄화수소(total petroleum hydrocarbon : TPH) 농도는 5,000~6,000 ppm이었으며, 미생물제제 접종시 분해균의 밀도는 107 (CFU/g soil)의 수준이었고 추가의 접종은 실시하지 않았다.
- 원유오염 토양정화에 사용된 미생물 제재의 제조에 사용된 미생물군집의 개별군집과 혼합군집의 유류 분해능을 비교하기 위해, 200 ml SM1 배지가 사용되었으며, 각 처리구는 5,000 mg/L의 디젤유를 유일 탄소원으로 첨가되었으며 25℃에서 7일간 진탕(190 rpm) 배양하였다. 미생물군집 “S” 의 경우 대조군에 비해 약 70%의 분해율을 나타내었으나, 미생물군집 “C” 의 경우는 55%의 분해능을 보였다(Fig.
- 유류분해 생균수의 측정은 배양액을 10-3, 10-4, 10-5, and 10-6로 희석한 후 SM1 한천 배지에 도말한 후, 디젤유를 filter paper strip에 적셔 Petri dish 뚜껑에 놓고 vapor 형태로 공급하여 배양하였으며 최소한 1주 후 성장하는 유류분해균주를 계수하였다.
- 유류오염토양으로부터 유류분해미생물을 분리하기 위해 농화배양하였다. 250 ml 삼각플라스크에 SM1 배지(pH 7.
- 매주 경과 시 5 ml을 새로운 배지에 옮겨 농화배양을 수행하였고, 이 과정을 4회 반복하였다. 이 과정에서 2가지의 대표적 유류분해 혼합배양균(consortium)을 유류분해시험을 통하여 선발하였다.
- 이 과정에서 농화배양을 한 후 TPH의 분해율과 성장속도를 측정하여 우수한 유류(디젤)분해균을 포함하는 미생물군집 “S” 및 “C” 확보하였다.
- 정치시킨 상등액을 screw cap vial (Agilent, USA)에 1 ml씩 분주하여 GC-FID [Agilent Technologies 6890 Network System; HP-5 capillary column (50 m×0.2 mm×0.33 µm)]로 TPH의 농도분석을 실시하였다.
- 지방족 및 방향족분해 기능이 있는 미생물군집을 조합하여 활성탄이 첨가된 배지에 접종 후 배양한 혼합배양액 CSMix-1(Alcanivorax sp. 가 우점종)을 얻었으며, 부형제를 첨가하여 미생물제제를 제조하여 원유로 오염된 해양저질의 정화를 시도하였다. 원유의 정화는 미생물제제(MA-2)를 산소발생제와 함께 처리할 경우 5주 경과 시 90% 이상의 제거효과를 보였다.
- 시료채취는 표층에서 60 cm 깊이의 토양을 채취하였다. 큰 입자의 토양 및 자갈, 이물질을 제거하기 위하여 2 mm 체질을 실시하였다.
- 혼합균의 군집분석을 위하여 TA Cloning kit (Solgent, Korea)를 이용하여 PCR 증폭산물로부터 16S rDNA를 클로닝하였다. Clone library 구축을 위해서, PCR 증폭산물을 1.
- 사용한 대나무활성탄은 1,300 m2/g의 비표면적을 가지며 우수한 CO2 흡착능을 가지고 있어서(9) 분해미생물의 배양 담체로 사용하였다. 활성탄에 배양된 미생물은 적정량의 활성탄, peat moss, 휴믹물질 및 광물질을 첨가하여 미생물제제를 제조하여 오염토양의 정화에 활용하였다.
대상 데이터
- 디젤유 또는 원유를 유일 탄소원으로 사용한 농화배양을 통하여 유류분해군집을 선발하였다. 이 과정에서 농화배양을 한 후 TPH의 분해율과 성장속도를 측정하여 우수한 유류(디젤)분해균을 포함하는 미생물군집 “S” 및 “C” 확보하였다.
- 본 연구에 사용된 토양시료는 최근 원유로 오염된 서해안 조간대의 토양으로서 대표적으로 점토질토양(오염지역 A)과 사질토양(오염지역 B)을 대상으로 하였다. 시료채취는 표층에서 60 cm 깊이의 토양을 채취하였다.
- 5 (CFU/ml)에 달하였다. 사용한 대나무활성탄은 1,300 m2/g의 비표면적을 가지며 우수한 CO2 흡착능을 가지고 있어서(9) 분해미생물의 배양 담체로 사용하였다. 활성탄에 배양된 미생물은 적정량의 활성탄, peat moss, 휴믹물질 및 광물질을 첨가하여 미생물제제를 제조하여 오염토양의 정화에 활용하였다.
- 본 연구에 사용된 토양시료는 최근 원유로 오염된 서해안 조간대의 토양으로서 대표적으로 점토질토양(오염지역 A)과 사질토양(오염지역 B)을 대상으로 하였다. 시료채취는 표층에서 60 cm 깊이의 토양을 채취하였다. 큰 입자의 토양 및 자갈, 이물질을 제거하기 위하여 2 mm 체질을 실시하였다.
- 이 clone들은 50 µg/ml kanamycin을 포함한 LB 배지에서 키웠으며 생성된 콜로니들을 16S rDNA 분석에 이용하였다.
- 이 clone들은 50 µg/ml kanamycin을 포함한 LB배지에서 키웠으며 생성된 콜로니들을 16S rDNA 분석에 이용하였다.
- 이 clone들은 50 µg/ml kanamycin을 포함한 LB 배지에서 키웠으며 생성된 콜로니들을 16S rDNA 분석에 이용하였다. 최소한 50개 이상의 콜로니를 선발하였고, LB + kanamycin 배지에서 재배양하여 plasmid를 추출 한 후 염기서열을 결정하였다.
데이터처리
- 선택한 콜로니는 LB + kanamycin 배지에서 재배양하여 plasmid를 추출 한 후 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI (www.ncbi. nlm.nih.gov)의 GenBank database를 이용하여 BLAST search를 통해 분석하였다.
이론/모형
- 미생물 군집변화를 측정하기 위해 PCR-DGGE 기법과 clone library 기법을 이용하였다. Fast DNA 추출 kit (MPbio, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였으며, 미생물 다양성을 확인하기 위하여 시료로부터 얻은 DNA를 주형으로 PCR 반응을 수행하였다.
- 원유로 오염된 해양저질 B의 정화과정에 있어서 PCR-DGGE 기법으로 미생물군집변화를 조사하였다(Fig. 5 and Table 3). 처리 직후 시작시점의 미생물군집 패턴은 전반적으로 비슷하게 나타났으나, 처리 5주 경과 시 처리간 분명한 군집의 변화를 보이고 있다.
성능/효과
- 따라서 현장처리의 경우는 산소발생제 및 계면활성제의 적정처리 조건의 확립이 필요하다. 그리고 MA-2처리에 의한 정화 전후의 디젤유 분해균의 밀도를 조사한 결과 정화의 시작시점의 밀도인 106 (CFU/g soil)에 비해 정화 35일 후의 경우 107(CFU/g)로 나타나 분해균의 증식이 있었음을 알 수 있었다. 이는 정화대상토양이나 유사환경에서 분리된 토착미생물을 활용하여 제조된 미생물제제를 오염토양에 처리(bioaugmentation) 할 경우 정화의 촉진이 기대되며 특히 산소발생제의 처리 및 기타 통기성을 향상하는 조치가 이루어지면 현저한 정화의 촉진이 이루어질 수 있음을 시사한다.
- 본 연구에서는 고온에서 활성화된 국내산 대나무활성탄을 우수 유류분해 혼합균의 배양담체로 사용하고 이에 기타 부형제를 첨가하여 미생물제제를 제조하여 원유로 오염된 해양토양의 정화 가능성을 검토하고자 하였다. 대나무활성탄은 유류분해 혼합균주의 증식을 촉진하였으며 제조된 미생물제제는 산소발생제의 존재하에서 현저하게 유류분해를 촉진하였다.
- 대체적으로 자연생태계는 탄화수소분해 미생물의 다양성을 나타내지만 유류유입이 없는 경우에는 분해 미생물 수가 적다(7). 따라서 유류 오염지역으로부터 분리된 미생물은 오염현장에 가장 잘 적응하여 높은 활성을 나타내며, 2차 오염의 발생을 최소화할 수 있어 유류 오염 토양의 생물학적 처리기술인 bioaugmentation 기법에 유용하게 사용 할 수 있다. 최근 Harayama 등(2004)은 유류로 오염된 해수에서 분리된 유류분해균인 Alcanivorax sp.
- 의 경우 PAH (anthracene, phenanthrene, fluorene, fluoranthene, chrysene, 및 pyrene)를 분해하고 cresol compounds 과 n-alkanes을 유일 탄소원으로 사용하는 것으로 알려지고 있다 (24). 따라서 전체적으로 유류분해가 활발히 진행되고 있는 경우 (MA-2 처리구 및 MA-2+Tween 80 처리구)에는 유류분해균이 PCR-DGGE에서 확인이 되나 유류분해가 1차적으로 거의 종료된 경우(MA-2+산소발생제)에는 상대적으로 공존 비유류분해성의 미생물의 활동이 활발한 것으로 사료된다. 한 가지 흥미로운 것은 상기에 언급된 것처럼 Paracoccus sp.
- 가 우점종)을 얻었으며, 부형제를 첨가하여 미생물제제를 제조하여 원유로 오염된 해양저질의 정화를 시도하였다. 원유의 정화는 미생물제제(MA-2)를 산소발생제와 함께 처리할 경우 5주 경과 시 90% 이상의 제거효과를 보였다. 계면활성제의 고농도의 처리는 분해미생물의 작용을 억제하므로 적절한 농도의 확인이 필요하며 점토질의 토양의 정화를 위해서는 적절한 통기를 시키는 방법(산소발생제 투여, 기계적 aeration 등)의 활용이 요구된다.
- 5 and Table 3). 처리 직후 시작시점의 미생물군집 패턴은 전반적으로 비슷하게 나타났으나, 처리 5주 경과 시 처리간 분명한 군집의 변화를 보이고 있다. 즉 시작시점의 경우 우점종은 band 1, band 2 및 band 3로서 각각 Marinobacter sp.
- 한편 미생물군집 “S”와 미생물군집 “C”를 혼합하여 배양할 경우 약 75%의 현저한 분해율을 나타내었다.
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